鄧嘉輝 雷建峰 趙燚 劉敏 胡子曜 尤揚(yáng)子 邵武奎柳建飛 劉曉東

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 教育部棉花工程研究中心 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052）

基因組編輯技術(shù)是指利用人工構(gòu)建的特異性核酸酶對(duì)生物體核酸序列進(jìn)行刪除、插入、替換等各種修飾的基因工程技術(shù)。該技術(shù)的出現(xiàn)為生物體功能基因組學(xué)研究提供了便捷的反向遺傳學(xué)手段［1-2］。目前，基因編輯技術(shù)主要包括鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nucleases, ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator?like effector nucleases, TALENs）及CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat?associated protein）系統(tǒng)，其中，CRISPR/Cas系統(tǒng)由于編輯效率高、操作耗費(fèi)時(shí)間少和成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前廣泛應(yīng)用的主流基因編輯系統(tǒng)［3-4］。

ZFN由鋅指蛋白（zinc finger protein, ZFP）和限制性內(nèi)切酶Fok I融合構(gòu)成。3-5個(gè)串聯(lián)的ZFP構(gòu)成ZFN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與DNA靶位點(diǎn)特異性結(jié)合，然后引導(dǎo)FokI蛋白二聚體發(fā)揮DNA切割功能［5］，之后通過引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶切割DNA靶位點(diǎn)序列，形成DNA雙鏈斷裂（DNA double?strand break, DSB），從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。細(xì)胞通過非同源末端連接（non?homologous end joining,NHEJ）或同源重組（homology?directed repair, HDR）兩種不同的DNA修復(fù)途徑來實(shí)現(xiàn)基因組編輯，包括基因敲除（knockout）、基因定點(diǎn)突變及外源基因的定點(diǎn)整合（knockin）等［6］。TALEN技術(shù)則繼承ZFN技術(shù)的設(shè)計(jì)原理，通過類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子（transcription activator?like effector, TALE）與DNA靶位點(diǎn)特異結(jié)合，誘導(dǎo)FokI蛋白二聚體在靶位點(diǎn)進(jìn)行切割［7-9］。CRISPR/Cas9技術(shù)是通過人工合成的引導(dǎo)RNA（single strand guide RNA, sgRNA）序列與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白進(jìn)行DNA雙鏈切割［10］。

第一、二代基因組編輯技術(shù)ZFNs和TALENs雖然實(shí)現(xiàn)了特異性地識(shí)別靶位點(diǎn)并對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行敲除，但是其構(gòu)建繁瑣、難度大、時(shí)間長(zhǎng)、脫靶率高、可操作性不高等問題嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用范圍［11］。CRISPR/Cas技術(shù)雖然突變效率、精確度及安全性更高，耗費(fèi)時(shí)間更少，但是其靶向核酸酶分子量大、依然存在脫靶現(xiàn)象和受PAM識(shí)別序列的限制等問題，尚需要進(jìn)一步改進(jìn)［12］。

MCP蛋白（major capsid protein, MCP）是MS2噬菌體的外殼蛋白，由130個(gè)氨基酸組成，它可以精確識(shí)別并結(jié)合由19或者21個(gè)核苷酸組成的MS2小RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（MS2?SL）［13-14］。目前，MCP蛋白被用來識(shí)別MS2?SL莖環(huán)結(jié)構(gòu)并融合轉(zhuǎn)錄抑制因子或者轉(zhuǎn)錄激活因子來控制下游基因的表達(dá)［15］。Csy4（CRISPR associated protein, Cas6f）是一種參與CRISPR1?F系統(tǒng)crRNA生成的RNA酶，由188個(gè)氨基酸組成，其發(fā)揮功能除了需要識(shí)別特異性靶序列外，還需要靶序列3′端形成5個(gè)堿基配對(duì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因?yàn)橥瑫r(shí)對(duì)堿基序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的要求導(dǎo)致Csy4相比傳統(tǒng)內(nèi)切酶具備較高的特異性［16-17］。由于MCP蛋白具有識(shí)別并結(jié)合guide?SL的功能，Csy4蛋白也可以識(shí)別并結(jié)合sgRNA，它們的功能類似于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)內(nèi)Cas9蛋白，但它們并無切割活性。

本研究基于一代基因編輯技術(shù)ZFNs和二代基因編輯技術(shù)TALENs的原理，選取分子量小、RNA高結(jié)合能力和高特異性的MCP蛋白和Csy4蛋白，與具有核酸內(nèi)切酶特性的FokI蛋白構(gòu)建融合蛋白。擬建立MCP?FokI和Csy4?FokI新型雙靶位點(diǎn)編輯系統(tǒng)，將FokI蛋白構(gòu)建至靶向蛋白MCP或Csy4蛋白的C端和N端，讓正反兩個(gè)靶向蛋白分別識(shí)別目標(biāo)基因位點(diǎn)左右兩側(cè)的DNA序列，通過探究不同的中間間隔區(qū)的間距使FokI在靶位點(diǎn)形成活性二聚體，進(jìn)而發(fā)揮內(nèi)切酶活性，造成DSB，細(xì)胞通過HDR或NHEJ的機(jī)制進(jìn)行修復(fù)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因編輯（圖1）。希望通過構(gòu)建MCP?FokI和Csy4?FokI這兩個(gè)新型雙靶位點(diǎn)編輯系統(tǒng)來解決CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)存在的脫靶現(xiàn)象和受PAM識(shí)別序列限制等問題。

圖1 MCP-FokI（FokI-MCP）和Csy4-FokI（FokI-Csy4）基因組編輯體系示意圖Fig. 1 Schematic diagram of MCP-FokI（FokI-MCP）and Csy4-FokI（FokI-Csy4）genome editing system

1 材料與方法

1.1 材料

所用AtU6?26∷sgRNA載體、棉花葉皺縮病毒載體CLCrV?A和CLCrV?B均為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所保存，載體CLCrV?A和CLCrV?B由浙江大學(xué)周雪平教授惠贈(zèng)。植物基因組DNA提取試劑盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit）、克隆載體（pEASY?B Zero）和感受態(tài)細(xì)胞（Trans1?T1）均購(gòu)于北京全式金生物公司。所用限制性內(nèi)切酶購(gòu)于賽默飛生物公司。引物合成及測(cè)序由上海生工生物科技有限公司完成，其余試劑及藥品均由新疆本地生物公司代購(gòu)。

1.2 方法

1.2.1 迷你基因組編輯系統(tǒng)不同中間間隔區(qū)的設(shè)計(jì) 分別使用2個(gè)不同U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)成對(duì)的guide?SL左側(cè)靶位點(diǎn)和右側(cè)靶位點(diǎn)，以減少使用相同啟動(dòng)子導(dǎo)致基因沉默的概率。已有2個(gè)單獨(dú)研究團(tuán)隊(duì)研究表明CRISPR/dCas9?FokI對(duì)EGFP編輯效率最高的中間間隔區(qū)的距離為14-25 bp［18］、13-17 bp［19］。因?yàn)椴⒉恢烙行懈钏璧拈g隔距離，因此本研究設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)AtCLA1不同位點(diǎn)的guide?SL和7對(duì)不同位點(diǎn)的sgRNA來探究迷你基因組編輯系統(tǒng)的編輯能力。

1.2.2 MCP?FokI（FokI?MCP）和Csy4?FokI（FokI?Cs?y4）基因編輯載體的構(gòu)建 參照雷建峰［20］方法構(gòu)建基因編輯載體，首先構(gòu)建35∷MCP?FokI?Ter?B zero和35∷FokI? MCP?Ter?B zero過渡載體，并經(jīng)Xho I、Sal I、Xba I和BamH I酶切鑒定。構(gòu)建4個(gè)AtU6∷SL?B zero和4個(gè)AtU6?26∷SL?B zero過渡載體，經(jīng)Kpn I和BamH I雙酶切鑒定。將構(gòu)建好的靶向敲除AtCLA1的不同AtU6?26∷SL和AtU6∷SL片段與35∷MCP?FokI?Ter和35∷FokI?MCP?Ter片段分別重組為35∷MCP?FokI?Ter?P1300和35∷FokI?MCP?Ter?P1300載體，經(jīng)Hind III、Sal I、Xba I和Kpn I酶切鑒定，驗(yàn)證是否成功。

通過Transfer?PCR目的片段替換的方法［21］對(duì)35S∷MCP?FokI?Ter和35S∷FokI?MCP?Ter表達(dá)載體進(jìn)行改造，將MCP片段替換為Csy4，經(jīng)Dpn I酶切3 h，轉(zhuǎn)化、測(cè)序，并經(jīng)Spe I和Pac I酶切鑒定。分別在35S∷FokI?Csy4載體與35S∷Csy4?FokI載體的5′端添加Spe I酶切位點(diǎn)，3′端添加Pac I酶切位點(diǎn)，經(jīng)測(cè)序比對(duì)和Spe I與Pac I雙酶切鑒定，成功構(gòu)建Spe I?35S∷Csy4?FokI?B zero?Pac I和Spe I?35S∷FokI?Csy4?B zero?Pac I載體。設(shè)計(jì)7對(duì)針對(duì)CLA1不同位點(diǎn)的sgRNA，分別對(duì)4個(gè)AtU6∷SL?B zero和2個(gè)AtU6?26∷SL?B zero載體進(jìn)行改造，通過Tansfer?PCR目的片段替換的方法將SL片段替換為Csy4?sgRNA，構(gòu)建AtU6∷sgRNA（1-4）?B zero和AtU6?26∷sgRNA（5-6）?B zero 6個(gè)過渡載體，分別在這6個(gè)載體的5′端添加Pac I酶切位點(diǎn)，3′端添加Avr II酶切位點(diǎn)，之后將4個(gè)AtU6∷sgRNA和2個(gè)AtU6?26∷sgRNA片段兩兩串聯(lián)連接到SK載體上，經(jīng)Kpn I、EcoR I和Xba I酶切鑒定。將FokI?Csy4和Csy4?FokI片段與CLCrV?A載體連接，同時(shí)，將其分別與7個(gè)不同間距的雙靶序列片段與CLCrV?A載體串聯(lián)連接，將FokI?Csy4和Csy4?FokI與CLCrV?A載體連接，同時(shí)將其分別與7個(gè)不同間距的雙靶序列片段與CLCrV?A載體串聯(lián)連接，經(jīng)Spe I、Avr II雙酶切鑒定靶向敲除擬南芥AtCLA1的Csy4?FokI和FokI?Csy4編輯載體是否構(gòu)建成功。

1.2.3 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài) 吸取重組成功的CLCrV?A基因編輯載體與CLCrV?B質(zhì)粒各20 μL，加入100 μL剛剛解凍的農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)中，冰浴35 min，液氮速凍2 min，立即放入37℃水浴鍋中熱激3 min，加600 μL無抗LB液體培養(yǎng)基，28℃、220 r/min恒溫?fù)u床中孵育4 h，在LB固體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan）上篩選陽性克隆，酶切鑒定，得到含編輯載體的陽性轉(zhuǎn)化菌用于注射擬南芥葉片。

1.2.4 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥 采用浸花法［22］對(duì)野生型擬南芥Col?0進(jìn)行轉(zhuǎn)化。取農(nóng)桿菌凍存液10 μL接種于2 mL LB培養(yǎng)基（50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif）中活化。28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)20 h左右。然后按1∶100體積比將活化菌液接種到25 mL LB培養(yǎng)基（50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif）中，于28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，搖至菌液的OD600≈1.6-1.8時(shí)，離心收集農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，重懸于新鮮配制的轉(zhuǎn)化液（1/2 MS液體培養(yǎng)基含5%蔗糖，0.02% Silwet L?77），至終濃度OD600≈0.8-1.0，轉(zhuǎn)化擬南芥Col?0。在篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，種子用5% NaClO消毒5 min，置于1/2 MS培養(yǎng)基（含30 μg/mL Kan）上萌發(fā)。2周后，將陽性苗移栽到土壤中，在22℃ 16 h光照/8 h黑暗條件下生長(zhǎng)。選取生長(zhǎng)15 d左右的擬南芥幼苗進(jìn)行接種轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥 將?80℃保存的陽性轉(zhuǎn)化菌在LB固體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan）上劃線活化，挑取單克隆接種于體積為10 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan）中，28℃、220 r/min恒溫?fù)u床中搖至OD600≈1.5左右，4 000 r/min離心10 min沉淀菌體，接著用含有10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和200 μmol/L乙酰丁香酮的懸浮液懸浮至OD600≈1.0，室溫遮光靜置3 h。接種時(shí)，將CLCrV?A和CLCrV?B懸浮菌液按1∶1等量混合，使用1 mL注射器注射到擬南芥葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。

1.2.6 突變檢測(cè) 剪取注射農(nóng)桿菌后的擬南芥葉片100 mg左右，提取基因組DNA。參照Gao等［23］方法檢測(cè)AtCLA1是否發(fā)生編輯。利用PCR擴(kuò)增出含有EcoR V和Xba I酶切位點(diǎn)的目的片段（表1）。用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物，檢查是否存在未被消化的PCR擴(kuò)增條帶，初步判定是否發(fā)生基因編輯，通過HI?TOM高通量測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定AtCLA1的突變類型。

表1 引物及用途Table 1 Primers and applications

1.2.7 融合蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)AlphaFold2（https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/ AlphaFold2.ipynb）對(duì)融合蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.8 瞬時(shí)表達(dá)載體檢測(cè) 以注射7個(gè)不同中間間隔區(qū)距靶序列的Csy4?FokI基因編輯載體14 d后的子葉葉片基因組DNA為模板，分別以未注射農(nóng)桿菌的擬南芥Col?0和注射未帶靶序列的Csy4?FokI載體為陰性對(duì)照。利用CLCrVB病毒載體上特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白結(jié)構(gòu)分析

由于MCP和Csy4蛋白較小，與FokI融合后是否會(huì)影響彼此的三維空間，進(jìn)而影響各自功能的發(fā)揮。運(yùn)用AlphaFold2蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MCP?FokI和FokI?MCP融合蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖2?A），將FokI蛋白和MCP蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果圖同2個(gè)融合蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果圖進(jìn)行比對(duì)，2個(gè)功能域融合后，并沒有改變FokI蛋白形成二聚體的功能結(jié)構(gòu)，也沒有改變MCP蛋白識(shí)別并結(jié)合guide?SL的功能結(jié)構(gòu)。通過對(duì)Csy4?FokI和FokI?Csy4融合蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖2?B），并將FokI蛋白和Csy4蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)圖同2個(gè)融合蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，沒有改變FokI蛋白形成二聚體的功能結(jié)構(gòu)，也沒有改變Csy4蛋白識(shí)別并結(jié)合sgRNA的功能結(jié)構(gòu)。

圖2 融合蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 2 Tertiary structure prediction of fusion protein

2.2 MCP?FokI編輯載體構(gòu)建

本研究設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)CLA1不同位點(diǎn)的guide?SL，中間間隔區(qū)的間距分別為10、14、16和25 bp，中間間隔區(qū)的序列上有EcoR V和Xba I酶切位點(diǎn)，便于突變檢測(cè)（圖3?A）。35∷MCP?FokI?Ter?B zero和35∷FokI?MCP? Ter?B zero過渡載體（圖3?C）、4個(gè)AtU6∷SL?B zero和4個(gè)AtU6?26∷SL?B zero靶序列過渡載體（圖3?D）以及帶有4個(gè)不同中間間隔區(qū)的35∷MCP?FokI?Ter?P1300和35∷FokI?MCP?Ter?P1300載體編輯載體（圖3?B, E）經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序比對(duì)后與預(yù)期結(jié)果相吻合，說明靶向敲除AtCLA1的MCP?FokI和FokI?MCP編輯載體已構(gòu)建成功。

圖3 MCP-FokI和FokI-MCP基因編輯載體構(gòu)建圖Fig. 3 Construction of MCP-FokI and FokI-MCP gene editing vector

2.3 MCP?FokI基因組編輯技術(shù)可行性檢測(cè)

運(yùn)用浸花法將構(gòu)建的編輯載體分別轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col?0，潮霉素篩選獲得大量轉(zhuǎn)基因T1代植株（圖4）。選取轉(zhuǎn)基因陽性苗基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增覆蓋突變位點(diǎn)的AtCLA1。通過Hi?TOM高通量測(cè)序，結(jié)果顯示，選取的4對(duì)不同中間間隔區(qū)的CLA1?SL、MCP?FokI和FokI?MCP編輯系統(tǒng)均未能實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的靶向編輯，與此同時(shí)，并沒有觀察到AtCLA1突變植株明顯的表型。

圖4 MCP-FokI和FokI-MCP基因編輯系統(tǒng)靶向敲除AtCLA1Fig. 4 Targeted knockout of AtCLA1 gene by MCP-FokI and FokI-MCP gene editing system

2.4 Csy4?FokI編輯載體的構(gòu)建

Spe I?35S∷Csy4?FokI?B zero?Pac I和Spe I?35S∷?FokI?Csy4?B zero?Pac I過渡載體（圖5?C）、4個(gè)AtU6∷sgRNA?B zero和2個(gè)AtU6?26∷sgRNA?B zero過渡載體、7個(gè)中間間隔區(qū)的靶序列過渡載體（圖5?D）以及帶有7個(gè)中間間隔區(qū)靶序列的FokI?Csy4?CLCrV?A和Csy4?FokI?CLCrV?A載體（圖5?B, E），經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序比對(duì)后，與預(yù)期結(jié)果相吻合，表明說明靶向敲除擬南芥CLA1的Csy4?FokI和FokI?Csy4編輯載體已構(gòu)建成功。

圖5 Csy4-FokI和FokI-Csy4基因編輯載體構(gòu)建圖Fig. 5 Construction of Csy4-FokI and FokI-Csy4 gene editing vector

2.5 Csy4?FokI基因組編輯技術(shù)可行性檢測(cè)

通過葉片注射法將構(gòu)建的編輯載體，分別注射到野生型擬南芥Col?0葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。接種病毒7-14 d后并未觀察到擬南芥CLA1被編輯后明顯的白化表型。

分別提取野生型Col?0擬南芥基因組DNA與注射Csy4?FokI編輯載體的擬南芥基因組DNA，對(duì)CLCrV?B基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在注射Csy4?FokI編輯載體的擬南芥基葉片中可以檢測(cè)到CLCrV?B病毒積累，而在野生型擬南芥未檢測(cè)到CLCrV?B病毒的積累（圖6?A, B）。表明編輯載體已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。

圖6 Csy4-FokI和FokI-Csy4基因編輯系統(tǒng)靶向敲除AtCLA1Fig. 6 Targeted knockout of AtCLA1 gene by Csy4-FokI and FokI-Csy4 gene editing system

通過Hi?TOM高通量測(cè)序，結(jié)果顯示，在Csy4?FokI基因組編輯體系中，檢測(cè)范圍在靶位點(diǎn)sgRNA（1-5）之間64 bp區(qū)域，中間間隔區(qū)為25 bp的植株#5、#6和#7出現(xiàn)了3種類型的堿基替換，平均編輯效率為2.13%；檢測(cè)范圍在靶位點(diǎn)sgRNA（2-6）之間48 bp區(qū)域，中間間隔區(qū)為10 bp的植株#15出現(xiàn)了1種類型的堿基替換，編輯效率為0.3%；檢測(cè)范圍在靶位點(diǎn)sgRNA（1-6）之間57 bp區(qū)域，中間間隔區(qū)為19 bp的植株#17和#19出現(xiàn)了3種類型的堿基替換，平均編輯效率為1.13%；檢測(cè)范圍在靶位點(diǎn)sgRNA（4-5）之間56 bp區(qū)域，中間間隔區(qū)為18 bp的植株#5、#6和#7出現(xiàn)了3種類型的堿基替換，平均編輯效率為1.87%。而在野生型、Csy4?FokI靶位點(diǎn)空載對(duì)照和FokI?Csy4基因組編輯體系中未檢測(cè)到編輯的發(fā)生。結(jié)果表明，在Csy4?FokI基因組編輯體系中選取的7對(duì)不同中間間隔區(qū)的sgRNA，CLCrV介導(dǎo)的Csy4?FokI編輯系統(tǒng)中間間隔區(qū)為10、18、19和25 bp能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)靶基因的靶向編輯（圖6?C），但是突變類型均為堿基置換類型且編輯效率很低，而CLCrV介導(dǎo)的FokI?Csy4基因組編輯體系和Csy4?FokI編輯系統(tǒng)中間間隔區(qū)為12、13和16 bp均不能實(shí)現(xiàn)基因編輯。

3 討論

基因組編輯技術(shù)以準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)單地操作而發(fā)展迅速，近年來，以CRISPR/Cas系統(tǒng)為代表的第三代基因組編輯技術(shù)在基因功能研究、植物分子育種、疾病治療等方面取得了重要進(jìn)展，但CRISPR/Cas系列基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域還存在其靶向核酸酶分子量大、存在脫靶現(xiàn)象和受PAM識(shí)別序列的限制等問題，研究者一直致力于尋找解決方法，通過改造修飾Cas9蛋白、使用Cas9直系同源酶等一系列措施，來提高基因編輯效率，降低其脫靶率，減弱PAM位點(diǎn)限制來進(jìn)一步拓展應(yīng)用范圍。本研究構(gòu)建的MCP?FokI和Csy4?FokI融合蛋白可能比Cas9蛋白更具有優(yōu)勢(shì)。主要表現(xiàn)在：首先Cas系列基因相對(duì)較大，大于4 000 bp［19］，而MCP?FokI和Csy4?FokI大小為1 074和1 248 bp，從堿基片段大小來講，兩個(gè)融合蛋白小于Cas蛋白，更利于編輯載體的構(gòu)建。此外，Cas對(duì)靶位點(diǎn)的切割依賴于PAM位點(diǎn)，盡管經(jīng)過人工改造的Cas9可以識(shí)別更多的PAM位點(diǎn)［24］，但是Cas9蛋白發(fā)揮切割作用仍然存在PAM位點(diǎn)的限制，導(dǎo)致并不是所有基因任意區(qū)段都能被編輯。使用上述融合蛋白靶向目標(biāo)基因并沒有PAM位點(diǎn)的限制，從而提高了目標(biāo)位置選擇的靈活性；最后，也就是說CRISPR/Cas9并沒有實(shí)質(zhì)性地解決脫靶問題［25］。若將兩個(gè)融合蛋白應(yīng)用于基因編輯體系必須采用雙切口酶策略，也就是用2個(gè)不同的U6啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)guide?SL或sgRNA的轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)ok I分別切割目標(biāo)DNA片段的正負(fù)鏈，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。只有2個(gè)guide?SL或sgRNA同時(shí)靶向到同一個(gè)基因上，才能發(fā)揮基因編輯的功能，從而提高了基因編輯的特異性進(jìn)而解決CRISPR/Cas9的脫靶問題。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的新型迷你基因組編輯系統(tǒng)雖然具有蛋白小、不受PAM位點(diǎn)限制和脫靶效率低等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些限制。該系統(tǒng)是一種雙靶位點(diǎn)編輯系統(tǒng)，需要在目標(biāo)基因的兩側(cè)設(shè)計(jì)靶向位點(diǎn)，因此，在設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建上具有一定的復(fù)雜性。此外，迷你基因組編輯系統(tǒng)也會(huì)受到靶向蛋白自身性質(zhì)的影響，例如，與RNA結(jié)合能力的強(qiáng)弱、RNA切割活性和靶向蛋白的大小等，這些因素都可能影響該系統(tǒng)的編輯能力。

根據(jù)報(bào)道［26-27］在CRISPR/dCas9?FokI編輯體系內(nèi)，F(xiàn)okI在dCas9蛋白的N端，通過設(shè)計(jì)有效的靶序列才可以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行編輯。出現(xiàn)這樣結(jié)果的原因可能是dCas9和FokI這兩個(gè)蛋白在空間構(gòu)象上有嚴(yán)格的排列順序。為此，本研究構(gòu)建了4種不同的融合蛋白：FokI核酸酶域與MCP（MCP?FokI）的羧基末端融合和與其氨基末端融合（FokI?MCP），F(xiàn)okI核酸酶域與Csy4（Csy4?FokI）的羧基末端融合和與其氨基末端融合（FokI?Csy4），融合蛋白在結(jié)構(gòu)上與ZFNs和TALENs相似（圖7）。這4種融合蛋白本研究使用帶有SGGSSGGSSGSETPGTSESAT?PESSGGSSGGS序列的32個(gè)氨基酸連接子來連接這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)對(duì)MCP蛋白進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，使其能在植物細(xì)胞中表達(dá)［20］。

圖7 MCP-FokI（FokI-MCP）和Csy4-FokI（FokI-Csy4）融合蛋白示意圖Fig. 7 Schematic diagram of MCP-FokI（FokI-MCP）and Csy4-FokI（FokI-Csy4）fusion protein

病毒誘導(dǎo)的基因編輯（virus?induced genome editing, VIGE）技術(shù)能夠改造植物病毒使其能在不同植物中表達(dá)外源蛋白和特定長(zhǎng)度的RNA，可以通過簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)化方法借助病毒在植物體內(nèi)系統(tǒng)擴(kuò)散能力將基因組編輯元件投送到植物細(xì)胞內(nèi)［28］，提高了基因編輯的檢出率。棉花葉皺縮病毒（cotton leaf crumple virus, CLCrV）是一種靠煙粉虱傳播的雙生病毒，由CLCrV?A和CLCrV?B兩個(gè)環(huán)狀單鏈DNA成分組分構(gòu)成［29］。Gu等［30］改良了基于CLCrV病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus?induced gene silencing, VIGS）載體，在棉花中實(shí)現(xiàn)了高效持久的基因沉默。Lei等［31］基于CLCrV介導(dǎo)的VIGE體系，在擬南芥中利用FT?sgRNA策略成功獲得了可遺傳的基因編輯后代。趙燚等［32］采用CLCrV介導(dǎo)VIGE體系，成功編輯了棉花內(nèi)源基因。利用病毒載體進(jìn)行基因編輯已在多種植物中得到成功應(yīng)用，但是受病毒基因組承載外源DNA片段的限制阻礙了其承載大片段DNA進(jìn)行基因編輯的應(yīng)用。然而也有研究報(bào)道少數(shù)病毒可承載完整的基因編輯載體進(jìn)行基因編輯，如Ma等［33］采用苦苣菜黃網(wǎng)病毒（sonchus yellow net virus, SYNV）將整個(gè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)投遞到煙草體內(nèi)的，并實(shí)現(xiàn)了基因編輯；Ariga等［34］利用馬鈴薯病毒X（potato virus X, PVX）病毒載體表達(dá)Cas9和sgRNA成功在本氏煙草中實(shí)現(xiàn)了高效編輯；Liu等［35］基于一種廣寄主范圍的番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus, TSWV）建立了高效的遺傳操作系統(tǒng)。研究者通過建立瞬時(shí)遞送系統(tǒng)向多種作物不同品種穩(wěn)定遞送一系列大的CRISPR/Cas核酸酶分子，展現(xiàn)出SYNV、PVX和TSWV具有較好的承載力。CLCrV能否像以上病毒一樣能夠承載完整的編輯系統(tǒng)，進(jìn)而快速驗(yàn)證Csy4?FokI基因組編輯系統(tǒng)的編輯能力。為此，本研究嘗試將完整的編輯體系構(gòu)建到CLCrV病毒載體上，利用CLCrV病毒載體投送到擬南芥葉片中快速驗(yàn)證Csy4?FokI基因編輯體系的可行性。

本研究構(gòu)建的MCP?FokI基因組編輯系統(tǒng)通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥的方式并未檢測(cè)到基因編輯的發(fā)生，推測(cè)其原因可能有：設(shè)計(jì)的sgRNA不同中間間隔區(qū)的設(shè)計(jì)是否有效、蛋白融合方式、與RNA結(jié)合能力的強(qiáng)弱。其中需要解決的是通過蛋白質(zhì)與RNA互作檢測(cè)手段來明確MCP蛋白與MS2?guide?SL的結(jié)合能力。如果結(jié)合能力較弱，可以通過串聯(lián)更多的MS2?SL以提高M(jìn)CP蛋白與MS2?guide?SL的結(jié)合能力，進(jìn)而提高編輯效率。

對(duì)于Csy4?FokI編輯系統(tǒng)，利用CLCrV病毒載體投送到擬南芥葉片中來快速驗(yàn)證Csy4?FokI基因編輯體系。經(jīng)過Hi?TOM高通量檢測(cè)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，CLCrV介導(dǎo)的Csy4?FokI編輯系統(tǒng)的編輯效率較低。推測(cè)造成這一問題的原因可能包括以下幾點(diǎn)：首先在該系統(tǒng)中，構(gòu)建的融合蛋白的基因片段相對(duì)較大（3 316 bp）。然而，CLCrV病毒載體在承載了3 000 bp外源基因片段后，可能會(huì)導(dǎo)致其復(fù)制能力和擴(kuò)散侵染能力大幅下降，不能侵入更多的組織細(xì)胞。由于病毒載體需要有效感染目標(biāo)細(xì)胞才能實(shí)現(xiàn)基因編輯，因此低細(xì)胞感染率可能是導(dǎo)致編輯效率低的主要原因之一。其次，Csy4?FokI編輯系統(tǒng)的靶向蛋白除具有和sgRNA高識(shí)別與結(jié)合特異性外，還存在RNA切割活性。這可能導(dǎo)致sgRNA在與Csy4靶向蛋白結(jié)合后被切割，從而降低了結(jié)合的能力。此外，使用Csy4蛋白進(jìn)行植物基因組編輯存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)在植物中引入Csy4蛋白加工sgRNA或pegRNA時(shí)可能產(chǎn)生毒性［36-37］。這可能是因?yàn)镃sy4蛋白影響了植物mRNA的功能，對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，進(jìn)而影響了編輯效率。后續(xù)研究將對(duì)Csy4蛋白進(jìn)行改造，使其不具有RNA切割活性，而只是作為RNA結(jié)合蛋白來進(jìn)一步驗(yàn)證該迷你基因組編輯系統(tǒng)的編輯效率。未來的研究也可以嘗試通過驗(yàn)證更多基因和設(shè)計(jì)不同的中間間隔區(qū)，并采用浸花法等穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方式來驗(yàn)證其編輯能力。

綜上所述，本研究采用病毒誘導(dǎo)的基因編輯（VIGE）技術(shù)注射擬南芥葉片，初步探索了Csy4?FokI與MCP?FokI小型基因組編輯體系的編輯能力，為今后優(yōu)化并利用該技術(shù)體系進(jìn)行植物分子育種奠定前期基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

初步建立了Csy4?FokI的迷你的、無PAM位點(diǎn)限制的新型基因組編輯系統(tǒng)。CLCrV介導(dǎo)的Csy4?FokI迷你基因組編輯系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行靶向編輯，但是檢測(cè)到的突變類型只有堿基置換，且編輯效率很低。