郭文博 路楊 隋麗 趙宇 鄒曉威 張正坤 李啟云，3

（1. 吉林省農業(yè)科學院植物保護研究所 吉林省農業(yè)微生物重點實驗室 農業(yè)農村部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室，長春 130033；2. 吉林農業(yè)大學植物保護學院，長春 130118；3. 吉林農業(yè)科技學院，吉林 132101）

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種重要的昆蟲病原真菌，因其具有殺蟲譜廣、對人畜無害、殺蟲機制多樣、害蟲不易產生抗藥性等優(yōu)點，已被廣泛用于農林害蟲的生物防治［1］。但由于球孢白僵菌自身遺傳背景的多樣性，及在繼代培養(yǎng)過程中毒力退化造成的高毒力菌種篩選困難，限制了其進一步應用［2］。高毒力菌株的創(chuàng)制主要以野生菌株篩選為主，但其篩選周期長，并且保存和應用過程中的菌種退化造成了資源浪費；而基因工程育種由于受到環(huán)境安全因素的影響，尚不能廣泛應用［3-4］。

真菌病毒是影響寄主真菌的致病力和生物學性狀的重要因素之一［5］。目前真菌病毒感染造成寄主致病力降低是在植物病原真菌中廣泛研究的主要現(xiàn)象，已經有多個利用真菌病毒防治植物病原真菌造成病害的先例［6-11］。而對于昆蟲病原真菌，則需提高其毒力。目前已有研究表明，真菌病毒有助于提高生防真菌的生防能力［12-14］。Kotta?Loizou等［15］從球孢白僵菌中分離到兩株真菌病毒Beauveria bassiana polymycovirus?1（BbPmV?1）和Beauveria bassiana non?segmented virus 1（BbNV?1），生物學實驗表明，這兩種病毒能夠增加寄主的生物量，并且提高對大蠟螟（Galleria mellonella）的毒力。作者研究團隊于2021年從田間亞洲玉米螟僵蟲上分離純化得到的球孢白僵菌中，鑒定出了一株新的雙鏈RNA真菌病毒，該病毒為產多聚真菌病毒Beauveria bassiana polymycovirus 4（BbPmV?4），能提高球孢白僵菌對寄主的毒力，促進菌株生長［16］，并能通過共培養(yǎng)實現(xiàn)病毒在球孢白僵菌種內和種間水平傳播和垂直傳播。由此可見，可以將真菌病毒用于球孢白僵菌高毒力菌株的創(chuàng)制。然而，真菌病毒在寄主中復制和傳播機制尚不明確。

目前，真菌病毒與寄主互作機理主要是利用轉錄組篩選病毒與寄主互作通路和關鍵基因，且主要集中于植物病原真菌。例如，在多核灰霉菌（Botryosphaeria dothidea）中，攜帶病毒BdCV1和BdPV1的菌株與無病毒株差異基因的變化明顯，GO富集涉及代謝過程、細胞過程、催化活性、轉運蛋白活性、信號轉導和其他生物途徑。KEGG功能分析表明，豐富的差異表達基因參與了代謝、轉錄、信號轉導和ABC轉運［17］。在核盤菌中，共有958個mRNA受病毒hypovirus2?L的影響，其中有100多個基因參與基本代謝及糖和脂質的運輸［18］。作者團隊前期利用轉錄組學，明確了BbPmV?4與寄主互作過程中關鍵通路和基因，寄主被病毒感染后，一些絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞色素P450（CYP450）和聚酮合酶（PKS）編碼基因顯著上調［19］。因此，為了進一步明確病毒和寄主互作機理，蛋白質水平的研究極其重要，特異性的真菌病毒抗體可為其提供實驗材料。同時，血清學技術是檢測動植物病毒的常規(guī)技術，通過制備病毒外殼蛋白單克隆或多克隆抗體，對病毒進行檢測、定位及病毒與寄主互作機制研究［20-22］。然而，目前真菌病毒檢測方法主要為RT?PCR擴增，血清學檢測體系尚不成熟。

本研究對BbPmV?4病毒外殼蛋白進行原核表達，并制備多克隆抗體，利用血清學檢測方法進行病毒檢測，在寄主球孢白僵菌胞內和胞外的定位，深入研究真菌病毒在球孢白僵菌中的復制情況，并為真菌病毒的實驗室診斷及病毒感染真菌細胞中的定位和動態(tài)分布提供技術支持。在未來可借助血清學方法，對球孢白僵菌中的真菌病毒進行快速檢測，豐富球孢白僵菌中真菌病毒檢測的方法，并在實際應用中進行推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、病毒和實驗動物 本研究使用球孢白僵菌菌株BbOFJY，真菌病毒是本團隊于2018年從采自吉林省靖宇縣（42°06′ N，126°30′ E）采集的亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）僵蟲中分離得到，保存于中國微生物菌種保藏中心（菌種保藏號：CGMCC No. 22429）；球孢白僵菌無毒健康菌株BbOFDH1?5（GenBank登錄號：PRJNA178080），保存于中國農業(yè)微生物菌種保藏中心（菌種保藏號為：ACCC No.32726）。

以上菌株均保存于20%（體積分數(shù)）甘油溶液中，使用前需將其涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)5 d對菌株進行活化。

日本大耳兔：購自于遼寧長生生物技術股份有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內切酶QuickCut Xho I和QuickCut BamH I、DNA片段純化回收試劑盒、Gel Extraction Kit、E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞均購自生工生物（上海）股份有限公司；原核表達載體pET?28a（+）為本實驗室保存；SDS?PAGE 凝膠制備試劑盒購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；Ni Bestarose FF（Fast Flow）金屬螯合層析介質購自博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g有限公司；截流分子量15 kD蛋白超濾離心管購自密理博（中國）有限公司；BCA Protein Quantification Kit?BOX購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；絲狀真菌總蛋白提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8）為Leica徠卡公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據本實驗室分離鑒定的BbPmV?4雙鏈RNA病毒ORF4上的外殼蛋白基因序列BbPmV?4?CP（GenBank登錄號：MW385788），設計帶有Xho I和BamH I酶切位點的特異性引物，具體見表1。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Quote sequence information

1.2.2 外殼蛋白基因的擴增 采用常規(guī)dsRNA提取法提取球孢白僵菌菌株BbOFJY的dsRNA，反轉錄后利用特異性引物通過PCR反應擴增BbPmV?4?CP基因。PCR反應程序：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸20 s，共25個循環(huán)；72℃延伸2 min，于4℃保存。利用膠回收試劑盒純化回收大小在798 bp的目的條帶，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 重組原核表達載體的構建與鑒定 利用Xho I和BamH I對擴增得到的BbPmV?4?CP和原核表達載體pET?28a（+）進行雙酶切，酶切產物經過回收后與T4 DNA連接酶連接，4℃過夜。將連接產物轉化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞，挑選菌落PCR陽性克隆，過夜培養(yǎng)。采用質粒提取試劑盒提取陽性克隆質粒并送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序驗證。

1.2.4 重組質粒的誘導表達 取1 μL pET?28a（+）∷BbPmV?4?CP質粒轉化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落至含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中進行活化，次日轉接進行擴大培養(yǎng)，37℃，180 r/min，3 h后加入0.4 mmol/L IPTG，25℃誘導過夜。

1.2.5 重組蛋白的純化與鑒定 采用Ni2＋親和層析對過表達的BbPmV?4?CP蛋白進行純化，采用超濾濃縮管對純化得到重組蛋白進行脫鹽處理及濃縮，然后進行SDS?PAGE檢測。采用BCA蛋白定量試劑盒測定純化得到的BbPmV?4?CP蛋白濃度。

1.2.6 多克隆抗體的制備及效價測定 取純化后的BbPmV?4?CP蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化對日本大耳兔進行首次免疫，免疫劑量為1 mg/只，免疫方式為頸背部三點皮下及大腿肌肉兩點注射。每隔7 d進行加強免疫，共加強免疫4次；加強免疫時，將純化得到的BbPmV?4?CP蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混勻乳化，免疫劑量為0.5 mg/只。免疫結束7 d后，對日本大耳兔進行心臟采血，收集血清，置于37℃培養(yǎng)箱30 min后，4℃放置過夜，4 000 r/min離心。相關動物實驗方案已遵守相關實驗動物福利規(guī)定，獲得吉林大學第一醫(yī)院動物倫理委員會批準，倫理審批號（2022年）臨審第（124）號。

以200 ng/100 μL將純化得到的BbPmV?4?CP蛋白包被96孔酶標板，4℃過夜，5%脫脂奶粉溶液37℃封閉2 h。取倍比稀釋的BbPmV?4?CP蛋白多克隆抗體（1∶500-1∶256 000），37℃孵育1 h，100 μL/孔，每個稀釋度3次重復；加入HRP標記山羊抗兔IgG（1∶5 000），37℃孵育1 h；加入TMB底物溶液，避光反應5 min。加入終止液終止反應，利用酶標儀測定OD450值，分析數(shù)據，實驗進行3次重復。

1.2.7 克隆抗體Western blot檢測 采用絲狀真菌蛋白提取試劑盒提取含病毒BbPmV?4菌株BbOFJY的總蛋白后，分別收集細胞上清液及蛋白裂解液，將樣品變性處理后進行SDS?PAGE分離，然后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h。按1∶5 000比例加入BbPmV?4?CP蛋白多克隆抗體，37℃孵育1 h。按照1∶6 000比例加入HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；最后采用DAB（20×）顯色試劑盒避光反應5-10 min，使用Western blot蛋白印跡成像儀曝光成像。

1.2.8 間接ELISA病毒含量檢測 利用ELISA方法對含有病毒BbPmV?4的BbOFJY菌株進行病毒含量檢測。檢測樣品為SDY液體培養(yǎng)的BbOFJY菌液上清及菌體沉淀。以純化BbPmV?4?CP蛋白為陽性對照，SDY液體培養(yǎng)基為陰性對照，去離子水為空白對照。

從培養(yǎng)7 d的培養(yǎng)皿上挑取BbOFJY菌絲接種至SDY液體培養(yǎng)基中，26℃ 180 r/min培養(yǎng)。2 d后收集100 mL菌液，12 000 r/min離心，棄上清，PBS緩沖液重懸菌體，12 000 r/min離心15 min，分別收集上清液與沉淀，放入液氮中反復凍融3次后置于冰上，采用超聲波破碎儀功率40 W超聲15 min；離心取上清為包被液，后續(xù)采用間接ELISA檢測方法進行檢測。

1.2.9 球孢白僵菌原生質體制備及間接免疫熒光分析 BbOFJY原生質體制備：刮取PDA中培養(yǎng)7 d的球孢白僵菌菌絲，接入200 mL新鮮的SDY液體培養(yǎng)基中，26℃ 180 r/min培養(yǎng)48 h；12 000 r/min離心管收集菌液；0.7 mol/L NaCl溶液洗滌菌體2次；加入5 mL 0.01 mol/L β-巰基乙醇重懸菌體，30℃水浴20 min；12 000 r/min，15 min離心后棄上清，0.7 mol/L NaCl洗滌2次。加入5 mL 0.7 mol/L NaCl為滲透壓穩(wěn)定劑配制的真菌溶壁酶酶液（6.0 mg/mL）中，30℃水浴1.5 h，4 000 r/min，4℃離心10 min；加入0.7 mol/L NaCl，將制備的原生質體洗滌2次，最后將細胞懸浮于0.7 mol/L NaCl中。

間接免疫熒光分析：向制備的BbOFJY菌株原生質體中加入500 μL 4%多聚甲醛，固定30 min；4 000 r/min，15 min去除多聚甲醛，PBS緩沖液清洗3次；5%脫脂奶37℃封閉1 h；一抗為1∶5 000稀釋的陰性兔血清、陽性血清（BbPmV?4?CP多抗），37℃孵育1 h；二抗為FITC標記的山羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃避光孵育1 h；DAPI染色液避光染色10 min，然后在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察，激發(fā)波長：495 nm，發(fā)射波長：425 nm。以首次免疫前采集的兔血清為陰性對照。

2 結果

2.1 重組表達載體的構建

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，BPmV?4?CP擴增產物長度約為800 bp，結果與預期798 bp相符（圖1?A）。對膠回收得到目的基因BPmV?4?CP進行Xho I和BamH I雙酶切處理，與經過相同處理的表達載體pET?28a（+）進行連接（圖1?B），轉化至E. coli DH5α感受態(tài)細胞中，對重組表達質粒pET?28a（+）∷BbPmV?4進行測序鑒定。

圖1 BbPmV-4基因片段的PCR擴增及重組質粒鑒定Fig. 1 PCR amplification of BbPmV-4 gene fragment and the identification of the recombinant plasmid

2.2 目的蛋白表達形式鑒定

將測序驗證正確的重組表達載體轉化至表達菌株E. coli BL21（DE3）中進行IPTG誘導表達后，SDS?PAGE結果（圖2）顯示，在相對分子質量約為30 kD處有蛋白大量表達，均存在于細胞破碎上清液及沉淀液中。

圖2 目的蛋白BbPmV-4-CP表達鑒定Fig. 2 Expression and identification of target protein BbPmV-4-CP

2.3 BbPmV?4?CP蛋白純化

SDS?PAGE分析Ni?NTA鎳柱純化后帶有His標簽的BbPmV?4蛋白（圖3?A），進行6×His標簽Western blot檢測（圖3?B），及在蛋白作為抗原進行動物免疫前，采用超濾管進行濃縮以及脫鹽處理SDS?PAGE檢測（圖3?C），分子量均符合預期大小。BCA濃度測定得到BbPmV?4?CP蛋白濃度為4.04 mg/mL。

圖3 重組蛋白BbPmV-4-CP的純化與鑒定Fig. 3 Purification and identification of the recombinant protein BbPmV-4-CP

結果顯示，純化后的多抗效價達到1∶256 000以上，表明純化后的BbPmV?4?CP蛋白作為抗原免疫日本大耳兔獲得的多克隆抗體具有較高靈敏度（圖4）。

圖4 間接ELISA法檢測效價Fig. 4 Titer detected by indirect ELISA

2.4 抗體特異性檢測

Western blot檢測BbPmV?4?CP蛋白及含病毒BbPmV?4的球孢白僵菌，在膜上25 kD附近呈現(xiàn)清晰的特異性結合條帶，表明制備的BbPmV?4?CP多克隆抗體能夠特異性識別BbPmV?4?CP蛋白及寄主球孢白僵菌，且具有較好的免疫活性及特異性，可用于感染BbPmV?4病毒球孢白僵菌的血清學鑒定（圖5）。

圖5 BbPmV-4-CP抗體特異性檢測結果Fig. 5 Specificity detection of for the antibody of BbPmV-4-CP

2.5 間接ELISA病毒檢測

使用間接ELISA方法對含有BbPmV?4病毒的菌株進行病毒含量檢測。菌液上清及沉淀的間接ELISA檢測結果均為陽性（P≥2.1）（圖6?A），表明在菌液病毒BbPmV?4上清及沉淀中均存在，且可復制表達并游離至菌液上清中（圖6?B）。

圖6 間接ELISA檢測BbPmV-4病毒含量結果Fig. 6 Indirect ELISA detection results of BbPmV-4 virus contents

2.6 間接免疫熒光檢測——病毒細胞定位

制備的多抗可對含病毒BbPmV?4的BbOFJY菌株產生特異性黃色熒光信號，而陰性血清及無病毒球孢白僵菌菌株處理無信號反應（圖7），表明制備的兔源多抗可特異性識別病毒BbPmV?4寄主球孢白僵菌，該病毒定位于球孢白僵菌細胞核中。

圖7 間接免疫熒光檢測（×60）Fig. 7 Indirect immunofluorescence assay（×60）

3 討論

3.1 真菌病毒血清學檢測技術

真菌病毒的血清學檢測方法尚未見報道。目前，對各類真菌病毒的檢測主要依靠常規(guī)的RT?PCR和分子生物學方法，工作量大、檢測周期長，且無法對檢測菌株進行定量檢測。本研究所建立的針對真菌病毒BbPmV?4的血清學檢測方法檢測效率高，特異性強，且可對菌株中的病毒進行定量檢測。該檢測體系同樣適用于其他真菌病毒的檢測。

3.2 為真菌病毒BbPmV?4與寄主在蛋白水平的互作機理研究提供材料

真菌病毒能夠改變寄主真菌的生物學性狀、毒力及致病力，已被廣泛應用于植物病原真菌的生物防治研究［23-24］。真菌病毒與寄主真菌的互作機理研究，對深入了解和利用病毒具有重要意義。目前主要用轉錄組學方法鑒定和分析受病毒調控的寄主真菌關鍵通路和基因。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，真菌病毒BbPmV?4能夠顯著提高球孢白僵菌對害蟲的毒力，并且提高其菌絲生長速度。轉錄組分析結果表明，病毒感染顯著提高編碼絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞色素P450（CYP450）和PKS?NRPS表達水平。這些寄主真菌關鍵通路和基因需要在蛋白質水平上進一步驗證，例如pull?down［25］和免疫共沉淀（co?immunoprecipitation）［26-27］等技術。本研究制備了效價高且特異性好的真菌病毒外殼蛋白多抗，可以用于與病毒互作的寄主真菌蛋白篩選和鑒定，為開展BbPmV?4與寄主球孢白僵菌的互作研究提供材料。

3.3 真菌BbPmV?4定位與寄主細胞核

細胞核是病毒完成自我復制和翻譯的重要細胞器，大部分RNA病毒可在宿主細胞質中完成自身蛋白的合成過程，但其重要蛋白的合成仍需要在宿主細胞核內完成，這些蛋白質在影響病毒的毒力、復制能力以及致病力方面往往發(fā)揮關鍵作用［28］，且近年研究發(fā)現(xiàn)，宿主細胞核中也存在發(fā)揮著位點選擇、免疫逃逸等功能的病毒衣殼［29］。免疫共沉淀等免疫學方法是病毒與寄主互作研究的重要手段［30］，相關研究在植物及動物病毒中細胞定位機制研究體系較為成熟［31-32］。然而真菌病毒感染寄主后，如何在寄主體內復制以及與寄主互作機制目前尚不明確。本研究利用間接免疫熒光方法檢測到BbPmV?4定位于寄主球孢白僵菌的細胞核，說明真菌病毒與其他病毒可能具有相似或者相同的復制和翻譯功能。

3.4 真菌病毒BbPmV?4能被分泌到寄主體外進行傳播

球孢白僵菌高毒力菌株的創(chuàng)制主要以野生菌株篩選和基因工程菌株為主。野生高毒力菌株篩選周期長、菌種易退化，造成了高毒力菌株獲取難度高。而基因工程菌株涉及環(huán)境安全問題，目前尚無法應用。真菌病毒能夠在寄主種內和種間傳播［33-34］，作者前期研究發(fā)現(xiàn)，BbPmV?4不僅能夠通過共培養(yǎng)實現(xiàn)球孢白僵菌種內進行高效地的水平傳播和垂直傳播，還可以在不同種白僵菌的種間進行傳播，并能夠通過共侵染昆蟲實現(xiàn)上述傳播。但病毒是通過菌絲在培養(yǎng)基或昆蟲體內產生融合而實現(xiàn)傳播，還是病毒粒子可以游離到菌株體外后傳播至另一菌株尚不清楚。本研究在寄主球孢白僵菌菌體內部和培養(yǎng)基中均檢測到該病毒，說明BbPmV?4可能從原寄主分泌至體外，并感染新的寄主，形成傳播。該結果不僅為真菌病毒的流行學研究提供了理論支持，還為通過BbPmV?4病毒感染從而快捷高效地獲得高毒力菌株提供了理論依據。

4 結論

本研究制備出特異性好且高效價的球孢白僵菌真菌病毒多克隆抗體BbPmV?4?CP。在真菌胞內及胞外ELISA檢測中，檢測到該病毒可在寄主體內復制表達，并游離到菌液上清中實現(xiàn)病毒傳播。通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)真菌病毒BbPmV?4定位于寄主球孢白僵菌真菌細胞核上，該病毒可能在細胞核內完成復制和翻譯。該研究為利用真菌病毒創(chuàng)制高毒力菌株提供理論支持。