安昌 陸琳 沈夢千 陳盛圳 葉康卓 秦源， 鄭平

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心，福州 350002；2. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002）

外界環(huán)境因子如光照、氣候、土壤等持續(xù)影響著植物的生長和發(fā)育，植物通過基因的特異性表達來響應(yīng)外界環(huán)境的變化［1］。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達的級聯(lián)控制開關(guān)，可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控或影響植物的許多生物過程［2］。藥用植物在長期適應(yīng)各類生長環(huán)境的過程中，發(fā)生了一系列的基因表達調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，逐漸形成了許多獨特的生活型。近些年，“中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)” “藥用植物擬境栽培”等中藥栽培新模式的提出［3-4］，各種藥用植物生長發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究不斷取得新進展，闡述藥用植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的策略及其對中藥材品質(zhì)形成的影響，推動中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)科的進一步發(fā)展，是中藥現(xiàn)代化研究的新方向和新任務(wù)［5］。在藥用植物中，影響其活性成分生物合成及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制通常是復(fù)雜且多層次的。因此，許多轉(zhuǎn)錄因子家族成員陸續(xù)被人們關(guān)注并研究。大量報道證明，MYB、bHLH、AP2/ERF、WRKY和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育和非生物脅迫條件下發(fā)揮重要作用［6］，是調(diào)控植物中許多生物過程信號網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分。

在植物中，bHLH是繼MYB之后的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，具有多種生物學(xué)功能，其通過與相關(guān)基因啟動子區(qū)域的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，進而調(diào)控植物的適應(yīng)性反應(yīng)，在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、非生物脅迫及代謝網(wǎng)絡(luò)的響應(yīng)中發(fā)揮作用［7］，是參與藥用活性成分合成的重要家族。在中藥研究中，道地藥材是指產(chǎn)在特定地域，與其他地區(qū)所產(chǎn)的同種中藥材相比，品質(zhì)和療效更好的中藥材［8］，不難看出，其原植物是長期適應(yīng)特定環(huán)境的生態(tài)型，且次生代謝產(chǎn)物的含量是評價藥用植物質(zhì)量的重要指標(biāo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為環(huán)境信號和活性成分合成之間的橋梁，可以很好地解釋道地藥材的“逆境效應(yīng)”。因此，深入了解植物bHLHs等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的次生代謝產(chǎn)物分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對促進藥用植物的分子育種、品種改良及農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義，同時可為道地藥材形成機制的探討提供新思路。

1 植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子

1.1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征

轉(zhuǎn)錄因子（TFs），也被稱為反式作用因子，是一類專門與真核生物基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合的蛋白質(zhì)。它們在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)細胞的特定生理或生化過程，因此在生物體的不同發(fā)育階段發(fā)揮著重要作用。bHLHs是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它們廣泛分布于真核生物中。自1989年首次發(fā)現(xiàn)bHLH以來，許多bHLH轉(zhuǎn)錄因子已在動物、植物和真菌中被發(fā)現(xiàn)［9］。bHLH轉(zhuǎn)錄因子因其結(jié)構(gòu)特點而被命名，所有的bHLH轉(zhuǎn)錄因子都有一個保守的結(jié)構(gòu)域，包含大約50-60個氨基酸（aa），由兩個子區(qū)域/保守基序組成：一個是堿性DNA結(jié)合區(qū)（basic DNA binding region, b），另一個是螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)（helix?loop?helix region, HLH）。參與DNA結(jié)合的堿性區(qū)域（b）位于bHLH結(jié)構(gòu)域的N端，長度為10-15個氨基酸不等，能夠識別并特異性結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)的調(diào)控元件E?box（5′?CANNTG?3′）或 G?box（5′?CACGTG?3′）；HLH結(jié)構(gòu)域位于C端，主要包括兩個含有疏水殘基的α螺旋和一個長度不等的氨基酸環(huán)，該區(qū)域由大約40-50個氨基酸殘基組成，是與其他轉(zhuǎn)錄因子形成同源二聚體或異源二聚體的基本結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 黃花蒿bHLH家族成員結(jié)構(gòu)域特征與分布Fig. 1 Domain characteristics and distribution of bHLH family members from A. annua

1.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的分類

bHLH轉(zhuǎn)錄因子最早在動物中發(fā)現(xiàn)，在接下來的深入研究中，根據(jù)其組織分布、二聚化能力和DNA結(jié)合特性等，將bHLH分為6個組（A-F組）［10］。植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子最早在玉米（Zea mays）中被鑒定［11-12］，同時廣泛存在于各類植物中，大多數(shù)植物的bHLH與B組的關(guān)系更為密切［13］。早在2003年，Toledo?Ortiz等［14］就將從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中鑒定出的147個bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因劃分為21個亞家族。隨著分子生物學(xué)及生物信息學(xué)學(xué)科的發(fā)展，越來越多不同植物的bHLH轉(zhuǎn)錄因子被報道，尤其是非典型性（novelatypical）的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的鑒定使得該家族成員具有越來越豐富的多樣性［15-16］，目前，更多的是基于系統(tǒng)進化關(guān)系進行分類，2010年Carretero?Paulet等［17］對擬南芥、白楊（Populus trichocarpa）、水稻（Oryza sativa）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）和5種藻類（algae）的全基因組的bHLH轉(zhuǎn)錄因子進行了全面的系統(tǒng)發(fā)育分析，將鑒定出的638個bHLH基因分為32個亞家族，并且定義了植物bHLH的保守區(qū)域，這為將來鑒定新的bHLH轉(zhuǎn)錄因子提供了堅實的框架。近年來，得益于基因家族分析的成熟開展，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的報道日益增多，涉及的物種也逐漸廣泛，覆蓋蕨類、裸子及被子植物中的40余個物種［18］。在不同植物中，所鑒定得到的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目差異明顯（圖2），如Hong等［19］從紅花（Carthamus tinctorius）中鑒定出41個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員；Shen等［20］從歐洲油菜（Brassica napus）中鑒定出了460個bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員?？傊罅縝HLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定為其結(jié)構(gòu)及功能的研究提供了豐富的基礎(chǔ)材料。

圖2 部分種子植物中bHLH家族成員個數(shù)統(tǒng)計Fig. 2 Statistics of the number of bHLH family members in vascular plants

2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的功能研究

在不同植物中，已經(jīng)有許多bHLH家族成員的功能被分析，擬南芥中約有30%的bHLH已在不同程度上進行了功能鑒定［21］。家族成員中序列結(jié)構(gòu)雖然具有共同特征，但在植物中發(fā)揮的功能作用存在著較大差異，作用于靶基因后所具有的生物學(xué)作用也存在較大差異，這使得 bHLH家族成員具有多種生物學(xué)功能，并能廣泛地參與到植物生命活動中［22］。例如在花生（Arachis hypogaea）中鑒定出61個bHLH參與豆莢的發(fā)育及地下部分的特異性生長［23］。在蓮（Nelumbo nucifera）中預(yù)測了69個NnbHLH的功能，主要與發(fā)育生理和脅迫響應(yīng)有關(guān)［24］。在人參（Panax ginseng）中發(fā)現(xiàn)至少6個bHLH參與人參皂苷生物合成的調(diào)控［25］。以上這些研究為深入了解bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。但應(yīng)該清楚的是，目前bHLHs的研究更多的是停留在家族成員的鑒定和表達分析上，其中大多數(shù)的生理作用和調(diào)節(jié)功能還有待進一步系統(tǒng)研究。

2.1 調(diào)控生長發(fā)育

植物生理與轉(zhuǎn)錄調(diào)控息息相關(guān)，bHLHs參與許多生長和發(fā)育過程，包括種子萌發(fā)、花器官發(fā)育及側(cè)根的生長等。果實的發(fā)育是由復(fù)雜的細胞和分子事件參與完成的［26］。Zhu等［27］報道番茄（Solanum lycopersicum）中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子SlPRE2可通過調(diào)節(jié)果皮細胞的分裂，增大果皮厚度進而影響果實大小，是果實發(fā)育的調(diào)控因子；SlPRE2高表達品系的果實直徑略有增加，而功能缺失品系的果實大小略有減?。?8］，同時，其在草莓（Fragaria × ananassa）中的同源物FaPRE1可以激活與花托成熟過程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進而促進草莓的成熟［16］。在甜瓜（Cucumis mleo）中，bHLH傾向于在果實發(fā)育早期表達，然而CmbHLH9和CmbHLH114的表達在成熟期至收獲期階段樣品中上調(diào)，過表達CmbHLH32的轉(zhuǎn)基因甜瓜與野生型相比，果實存在早熟現(xiàn)象［29］。蘋果（Malus domestica）中的MdbHLH3直接結(jié)合MdcyMDH（蘋果細胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶）的啟動子，激活其轉(zhuǎn)錄表達，從而促進蘋果酸在蘋果果實中的積累［30］；此外，MdbHLH3的過表達增加了蘋果葉片的光合能力和碳水化合物水平，通過調(diào)節(jié)碳水化合物從源（葉片）到庫（果實）的分配，也增強了果實中碳水化合物的積累。根是植物的重要器官，高等植物具有形成側(cè)根的能力，以高效地獲取水分和養(yǎng)分，而側(cè)根發(fā)育的主要來源是位于根系中柱最外層的中柱鞘細胞（pericycle cells）。研究表明，中柱鞘細胞形成后會長時間保持細胞分裂能力，從而使得植物能夠響應(yīng)環(huán)境變化靈活地形成側(cè)根，Zhang等［31］揭示了bHLH轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)中柱鞘細胞形成側(cè)根原基的機制，PFA和PFB可以結(jié)合成二聚體，進而形成正反饋回路調(diào)控鄰近木質(zhì)部極的中柱鞘（xylem pole pericycle）細胞的分裂潛力，在側(cè)根原基的形成中發(fā)揮重要作用。另外，SPT是擬南芥中重要的、功能發(fā)散的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與一系列植物發(fā)育過程［32-34］。在擬南芥中SPT可以限制細胞的增殖和擴張［35］。SPT的突變體可以使主根發(fā)育得更長，同時還會出現(xiàn)其他多效性表型，例如更多的花、更短的節(jié)間和更長的花期［36］。果實類藥材來源于完整的果實或果實的一部分，應(yīng)用較廣。如大棗、山楂等藥食同源藥材；枸杞、梔子等常用大宗藥材。在中藥商品流通中，果實類藥材的質(zhì)量主要體現(xiàn)在果實的形狀及大小，因此，對其原植物果實生長發(fā)育調(diào)控機制的研究具有重要意義；另外，藥用植物的根作為次生代謝產(chǎn)物主要積累的器官，其大小是根類藥材質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，探究藥用植物根系形態(tài)建成的機制可為其定向育種提供理論指導(dǎo)。這些報道可為根莖類、果實類藥材的研究提供新的視角。

2.2 響應(yīng)非生物脅迫

近年來，環(huán)境問題制約著我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展，分析藥用植物栽培面臨的主要脅迫類型，是中藥生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要內(nèi)容。同時，研究藥用植物響應(yīng)脅迫的策略，不僅可以了解藥用植物生物學(xué)特性，還可以闡明藥用植物品質(zhì)形成的機制，從而為認(rèn)識和理解藥用植物栽培模式提供新思路。

2.2.1 bHLH與植物的抗旱性 干旱是嚴(yán)重限制全球農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要環(huán)境因素。bHLH響應(yīng)干旱脅迫，參與提高植物對缺水環(huán)境的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH誘導(dǎo)的植物抗旱性增強一般與脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及活性氧（ROS）的清除有關(guān)［37］。例如，在保衛(wèi)細胞中高表達的AtbHLH122可以抑制脫落酸的分解代謝，從而通過增加脫落酸的含量來增強擬南芥的抗旱性［38］。在小麥（Triticum aestivum）中，TabHLH1基因的過表達可以改變植物干旱脅迫下的氣孔運動、葉片失水率等生長特征，調(diào)節(jié)脫落酸途徑來提高干旱適應(yīng)性［39］。在水稻中，OsbHLH148可以作為茉莉酸信號模塊的一個組成部分賦予水稻耐旱性，過表達的OsbHLH148可以提高其抗旱性［40-41］?；ㄉ械腁hbHLH112與過氧化物酶（POD）基因的啟動子直接、特異地結(jié)合并激活，從而減少活性氧的積累，同時提高脫落酸水平來增強抗旱性［42］。此外，bHLH還可以通過調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、氣孔運動、光合作用和氧化應(yīng)激等來響應(yīng)植物的干旱脅迫。例如，蘋果中的MdbHLH130在煙草中過表達，可通過調(diào)節(jié)不同途徑提高煙草（Nicotiana tabacum）對水分脅迫的耐受性，包括上調(diào)活性氧（ROS）清除相關(guān)基因的表達和調(diào)節(jié)氣孔的關(guān)閉［43］。另外，一些物種的基因在擬南芥中的異源表達也可以提高擬南芥植株的抗旱性，過表達胡楊（Populus euphratica）中PebHLH35基因的擬南芥可以通過調(diào)節(jié)氣孔密度、氣孔開度和蒸騰速率使水分損失減少，同時提高葉綠素含量和光合作用速率來對抗干旱脅迫，且過表達PebHLH35擬南芥植株在水分充足的條件下，主根更長、葉片更多、葉面積更大［44］。密羅木（Myrothamnus fla?bellifolia）的MfbHLH38基因在擬南芥中的異源表達可以通過調(diào)節(jié)滲透平衡，增強脅迫誘導(dǎo)的ROS清除系統(tǒng)，提高干旱脅迫下脫落酸的水平，上調(diào)與脫落酸生物合成和脫落酸響應(yīng)相關(guān)的基因，從而顯著提高擬南芥的耐旱性［45］；剛毛檉柳（Tamarix hispida）中ThbHLH1、枳（Poncirus trifoliata）中PtrbHLH66的研究也得到了類似的結(jié)果［46-47］。此外，bHLH家族成員是否通過調(diào)控特定基因的表達提高植物的抗旱能力，也是目前的一大研究方向，Liu等［48］研究發(fā)現(xiàn)小麥TabHLH49正向調(diào)控小麥脫水WZY2的表達，增強小麥的抗旱性；同樣Gu等［49］的研究結(jié)果表明，干旱可以誘導(dǎo)水稻OsbHLH130的積累，進而激活 OsWIH2的表達，通過參與角質(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成，降低失水率和活性氧積累，提高水稻的抗旱性。這些結(jié)果表明，bHLHs在植物抗旱性中起重要作用，可為作物抗旱性研究提供新的研究方向。

2.2.2 bHLH與植物耐鹽性 bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過影響植物的滲透平衡，來調(diào)節(jié)植物對鹽脅迫的耐受性。植物通常采取兩種滲透調(diào)節(jié)策略來響應(yīng)高鹽環(huán)境，一是調(diào)節(jié)離子的轉(zhuǎn)運；二是合成積累有機小分子物質(zhì)如脯氨酸、抗壞血酸和黃酮類化合物等。鈣被認(rèn)為是介導(dǎo)鹽脅迫信號通路的第二信使，在植物中，第一個被鑒定的與耐鹽性有關(guān)的bHLH基因AtNIG可以與參與鈣離子結(jié)合介導(dǎo)鹽脅迫信號的響應(yīng)［50］。AtMYC2和AtbHLH122可以作為上游基因調(diào)控Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達，進而提高擬南芥的耐鹽性［38,51］，其中，AtMYC2還可通過調(diào)節(jié)脯氨酸的生物合成來實現(xiàn)高鹽環(huán)境的適應(yīng)［52］。在水稻中，OrbHLH001在耐鹽性方面起著積極的調(diào)節(jié)作用，過表達OrbHLH001可以激活OsAKT1（弱整流鉀離子通道），從而改變鹽脅迫下水稻根系的離子通量（Na+/K+），增強對鹽脅迫的耐受性。在其他作物中，辣椒CabHLH035通過影響細胞內(nèi)Na+/K+的比值和脯氨酸的生物合成，在耐鹽性中發(fā)揮重要作用［53］。葡萄（Vitis vinifera）的VvbHLH1基因在擬南芥中過表達，可以顯著增加黃酮類化合物的積累并增強其抗旱性［54］。在玉米中，ZmbHLH55通過直接調(diào)節(jié)抗壞血酸生物合成相關(guān)基因的表達來增加抗壞血酸的積累，從而提高玉米的耐鹽性［55］。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)bHLH既可以正向調(diào)節(jié)又可以負向調(diào)節(jié)植物對鹽脅迫的耐受性［56-57］。SbbHLH85是高粱（Sor?ghum bicolor）根系發(fā)育的關(guān)鍵基因，過表達SbbHLH85可以激活A(yù)BA和生長素信號通路導(dǎo)致根毛數(shù)量和長度顯著增加，增加Na+的吸收；酵母雙雜交和BiFC實驗均證實SbbHLH85可以和SbPHF1（磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1）相互作用，破壞鹽脅迫下植物體內(nèi)磷的運輸和積累，加劇了高鹽引起磷的不均勻分布，大大降低高粱的耐鹽性［58］。目前，土壤鹽漬化已成為全球性問題，我國鹽土面積大、范圍廣，培育耐鹽性高的作物品種在鹽堿土壤上的種植，既可以充分利用土地資源，改善土壤的生態(tài)環(huán)境，又可增加作物的總產(chǎn)量。

2.2.3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子與植物低溫逆境 低溫脅迫是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域最重要的災(zāi)害之一，持續(xù)的低溫會損害植物組織結(jié)構(gòu)和生理功能，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大影響。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以通過ICE?CBF?COR途徑在植物應(yīng)對低溫逆境中發(fā)揮作用。Chinnusamy等［59］從擬南芥中成功分離出bHLH轉(zhuǎn)錄因子ICE1，與CBF3基因啟動子序列中的MYC識別位點結(jié)合，在擬南芥中過表達ICE1能夠增加CBF3基因表達，提高植株對低溫脅迫的耐受性。在擬南芥中過表達山葡萄（Vitis amurensis）的兩個bHLH基因VaICE1和VaICE2，可顯著誘導(dǎo)下游冷響應(yīng)基因CBF1、COR15A和COR47的表達，增強擬南芥的耐寒性［60］。IbbHLH79是一個在番薯（Ipomoea batatas）中高效表達的ICE1樣基因，可以激活CBF途徑；且過表達IbbHLH79的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強的耐冷性［61］。同樣，在水稻中過量表達AtICE1可上調(diào)CBF/DREB途徑相關(guān)基因的表達，增強轉(zhuǎn)基因植株對低溫脅迫的耐受性［62］。蘋果中鑒定出的MdCIbHLH1，煙草中發(fā)現(xiàn)的NtbHLH123，均能上調(diào)CBF2基因的表達，進而增加植物的耐旱性。在其他植物中，同樣存在許多受低溫逆境特異性誘導(dǎo)的bHLH，如水稻中的OsbHLH1，苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）中的FtbHLH2等［63］。Yang等［64］以龍眼（Dimocarpus longan）為材料，研究了CBF基因誘導(dǎo)子DlICE1的轉(zhuǎn)基因表達，其在擬南芥中的過表達可增加幼苗中的脯氨酸含量，降低丙二醛含量，從而提高擬南芥的耐冷性，此外，低溫下MdbHLH3通過增加花青素的積累來提高蘋果的耐寒性［30］。在中藥農(nóng)業(yè)中，許多南方的特色藥材因山地丘陵等地理環(huán)境，很難開展大批量種植，這限制了中藥種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，突破原有農(nóng)業(yè)氣候劃區(qū)的限制，適當(dāng)將種植帶北移可以擴大藥材產(chǎn)量，但需要克服持續(xù)的低溫脅迫。在植物適應(yīng)低溫脅迫的過程中，其體內(nèi)發(fā)生了一系列分子水平的反應(yīng)，這些反應(yīng)按照有序的時空順序發(fā)生，相互聯(lián)系，形成了一整套低溫應(yīng)答的分子機制。了解植物低溫應(yīng)答的分子機制可為藥用植物往北種植拓展奠定基礎(chǔ)。

2.3 參與重金屬的平衡與穩(wěn)態(tài)

重金屬殘留會嚴(yán)重制約作物的生長和生產(chǎn)力［65］，現(xiàn)今環(huán)境污染日益加劇，研究植物對重金屬的生理響應(yīng)和代謝的分子機制尤其重要。近年來，不斷有研究證明bHLH廣泛參與鐵穩(wěn)態(tài)，在擬南芥中鐵吸收主要受到bHLH 轉(zhuǎn)錄因子FIT的調(diào)控，且至少涉及16個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，它們通過形成錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)緊密參與到鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)［66-67］，例如bHLH轉(zhuǎn)錄因子ILR3和PYE可以在鐵脅迫下幫助植物細胞形成光保護作用，并改變?nèi)~綠體形態(tài)，阻止有害的活性氧（ROS）生成，加快光系統(tǒng)II的修復(fù)［68］。不同植物的不同bHLH成員在缺鐵調(diào)控中發(fā)揮不同的作用。如菊花（Chrysanth?emum morifolium）中CmbHLH1通過H+?ATP酶介導(dǎo)的根際酸化促進鐵的吸收。在缺鐵條件下，NtbHLH1的過表達會導(dǎo)致根系變長、根際pH值改變，并增加鐵?；€原酶活性，進而激活缺鐵反應(yīng)基因的表達［69］。研究表明，GmbHLH57和GmbHLH300的過表達上調(diào)了參與鐵吸收相關(guān)基因的表達，并增加了轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max）植株的鐵含量［70］。鐵相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子IRO2已被確定為水稻鐵吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)OsbHLH156可與IRO2形成協(xié)同互作模式，在鐵穩(wěn)態(tài)中的發(fā)揮作用［71］。Wang等［72］報道指出057在側(cè)根中高表達，并參與維持鐵的動態(tài)平衡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，OsbHLH061可通過與OsPRI1相互作用并招募轉(zhuǎn)錄抑制輔助因子OsTPL/TPRs來抑制關(guān)鍵下游基因OsIRO2和OsIRO3的轉(zhuǎn)錄，從而抑制鐵在水稻地上部的積累［73］。鎘（Cd）是一種廣泛存在于環(huán)境中的重金屬，在Cd脅迫下bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因（FIT、 AtbHLH38和AtbHLH39）會協(xié)同MSR3的表達，參與提高擬南芥對Cd的耐受性［74］。大豆GmORG3 可以通過增加光合作用系統(tǒng)的穩(wěn)定性來降低Cd脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草植株的傷害，并增加葉片葉綠素含量［75］。宋倩［76］發(fā)現(xiàn)，GmbHLH30在煙草中的過度表達，可以通過維持滲透壓來增強其鋁耐受性。在酸性土壤中，錳毒性也是限制作物產(chǎn)量的一個重要因素，研究發(fā)現(xiàn)ZmbHLH105可能通過調(diào)節(jié)抗氧化機制，來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)ROS清除和Mn/Fe相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達，提高玉米對錳脅迫的耐受性［77］。近年來，國內(nèi)外中藥材市場需求旺盛，許多藥用植物開始像水稻、果蔬等作物一樣，進行農(nóng)業(yè)化人工種植?，F(xiàn)階段，農(nóng)殘、重金屬超標(biāo)等問題已嚴(yán)重影響了中藥材安全性，成為制約中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大瓶頸。進一步闡明植物對重金屬等脅迫的響應(yīng)機制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，定向選育高耐受性、強代謝性的優(yōu)質(zhì)藥用植物品種，有助于進一步提高中藥產(chǎn)業(yè)的整體發(fā)展質(zhì)量與效益。

2.4 參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成

除了在生長發(fā)育中發(fā)揮作用外，植物通過產(chǎn)生廣泛的具有生物活性的專門代謝物來應(yīng)對壓力。bHLH還在植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成過程中發(fā)揮重要作用，包括黃酮類、萜類、生物堿類、酚酸類等的生物合成［78］。花青素屬于黃酮類化合物，是作物果蔬的主要呈色物質(zhì)，同時也是保健活性物質(zhì)。以擬南芥為例，研究證明AtTT8（Transparent Testa突變）是植物體內(nèi)花青素合成的關(guān)鍵酶基因［79］，其表達調(diào)控是黃酮類相關(guān)基因表達特異性激活的重要調(diào)控步驟，可以誘導(dǎo)花青素的合成［80］。在蓮和細莖石斛（Dendrobium candidum）中的同源基因也表現(xiàn)出誘導(dǎo)活性［81-82］。在牡丹（Paeonia ×suffruticosa）中，花青素的生物合成受PsbHLH1正向調(diào)控，PsbHLH1可直接與二氫黃酮醇4?還原酶（PsDFR）和花青素合成酶（PsANS）基因的啟動子結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活它們的表達［83］，這為牡丹新品種的分子育種奠定了堅實基礎(chǔ)。在桑（Morus alba）中，MabHLH3是調(diào)控果實顏色形成的關(guān)鍵基因，其異常表達可破壞花青素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的平衡，打亂桑樹果實的色素組成［84］。bHLH對下游基因除了多被表征的激活現(xiàn)象，還存在阻遏現(xiàn)象，蠟梅（Chimonanthus praecox）中CpbHLH1基因抑制擬南芥中花青素的積累［85］；丹參（Salvia miltiorrhiza）中SmbHLH92在其根和韌皮部中高表達，在SmbHLH92?RNAi轉(zhuǎn)基因株系的毛狀根中，丹參酚酸和丹參酮的含量顯著增加，表明SmbHLH92是參與調(diào)節(jié)丹參酚酸和丹參酮生物合成的負調(diào)控因子［86］，而SmbHLH10可以直接與丹參酮途徑基因啟動子中的G?box結(jié)合，激活其表達，進而上調(diào)丹參酮的生物合成［87］。此外，在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中鑒定出2個JA誘導(dǎo)的bHLH基因TSAR1和TSAR2，可以通過不同的激活模式激活MVA途徑的相關(guān)基因，導(dǎo)致三萜皂苷含量增加［88］。bHLH還調(diào)控植物中生物堿類成分的生物合成［89］，在日本黃連（Coptis japonica）中，CjbHLH1在體內(nèi)與IQA生物合成基因的啟動子序列直接相互作用，激活相應(yīng)的通路，進而導(dǎo)致生物堿類成分的特異性積累；研究還發(fā)現(xiàn)，CjbHLH1的同源物只在產(chǎn)生IQA的植物物種中發(fā)現(xiàn)，這對藥用植物的研究具有重要參考價值。另有研究表明，PlbHLH79/148/149是最有可能參與粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）中葛根素生物合成途徑的候選基因［90］；杏仁（Prunus domestica）中PdbHLH2參與了苦杏仁苷的生物合成［91］。植物的次生代謝在植物適應(yīng)環(huán)境、生物間信息交流以及協(xié)同進化過程中發(fā)揮重要作用，藥用植物在遭受脅迫后各項生理生化指標(biāo)發(fā)生的變化以及次生代謝產(chǎn)物的積累，是評價藥用植物品質(zhì)的重要依據(jù)。進一步研究bHLH的功能，對于系統(tǒng)闡釋藥用植物有效成分的積累、道地藥材的成因，以及藥用植物資源合理開發(fā)利用等具有重要意義。

3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子在藥用植物中的研究

藥用植物中的高價值活性成分因其對人類健康的益處而受到研究關(guān)注，例如抗瘧疾的青蒿素、抗心血管疾病的丹參酮等［92］。目前，有關(guān)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究還集中在各類重要作物上，對于藥用植物的研究仍涉及較少。我國是藥用植物資源豐富的國家之一，對藥用植物的栽培、采收和加工有著悠久歷史。隨著基因組學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，藥用植物的功能基因組學(xué)研究與應(yīng)用變得極為重要。因此，本文對兩種常見且重要藥用植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究進展進行總結(jié)，為藥用植物功能基因資源更深層次的開發(fā)和利用提供參考，對于藥用植物合成生物學(xué)及細胞工廠的應(yīng)用研究有著重要的意義。

3.1 丹參

丹參是較早發(fā)布全基因組的藥用植物，為其生命科學(xué)研究提供了系統(tǒng)的工具，以丹參作為藥用模式植物而開展的分子生物學(xué)研究、組學(xué)研究和代謝工程研究逐步深入。Zhang等［93］對丹參bHLH基因家族進行了全基因組分析，共鑒定出127個ApbHLH基因，根據(jù)它們在染色體上的物理位置和重疊群數(shù)量進行了重新命名；通過系統(tǒng)發(fā)育分析，將它們劃分為25個亞家族；根據(jù)MeJA處理后的基因特異性表達模式和上調(diào)表達模式，揭示了7個bHLH基因可能參與丹參酮生物合成的調(diào)節(jié)；其中，SmbHLH37、SmbHLH74和SmbHLH92的基因表達與丹參酮生物合成及積累模式的規(guī)律一致，研究結(jié)果為進一步了解丹參bHLH轉(zhuǎn)錄因子的分子基礎(chǔ)和調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。李林［94］從丹參中鑒定出一個參與丹酚酸和丹參酮調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH59。多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，SmbHLH59屬于IIIe亞家族成員，該家族的成員包括MYC2、MYC3、MYC4和MYC5，它們協(xié)同調(diào)控JA介導(dǎo)的植物次生代謝產(chǎn)物的積累；表達模式分析表明，SmbHLH59在丹參葉中高表達，而且受到MeJA的誘導(dǎo)，說明SmbHLH59可能與JA信號和丹酚酸合成相關(guān)。隨后實驗證明SmbHLH59通過結(jié)合E/G?box元件激活丹酚酸和丹參酮合成途徑上關(guān)鍵酶基因的啟動子，促進丹參酮和丹參酚酸的積累，初步闡釋了SmbHLH59的分子機制。在擬南芥中，JA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要受到轉(zhuǎn)錄因子MYC2的影響［95］，Liu等［96］在丹參中鑒定并表征了由MeJA最為顯著負調(diào)控的新型bHLH轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH60，并且SmbHLH60過表達毛狀根中的酚酸和花青素含量顯著降低，而通過CRISPR/Cas9敲除SmbHLH60則導(dǎo)致毛狀根中酚酸和花青素含量的顯著升高；另外，SmbHLH60的表達與酚酸和花青素濃度呈負相關(guān)，同時，參與花青素和酚酸合成的關(guān)鍵基因在SmbHLH60敲除系中上調(diào)，而在SmbHLH60過表達株系中下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，該研究進一步解析了SmbHLH60 調(diào)節(jié)丹參中次級代謝過程的分子機制。結(jié)果顯示，SmbHLH60可以直接結(jié)合SmTAT1和SmDFR等靶基因的啟動子抑制它們的表達并導(dǎo)致丹參中酚酸和花青素生物合成的顯著減少。此外，研究還揭示了SmbHLH60可以和 SmMYC2形成異二聚體，以拮抗的方式調(diào)節(jié)酚酸和花青素的生物合成。方慶［97］以過表達 SmbHLH124的丹參毛狀根為材料，結(jié)合高效液相色譜技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，過表達SmbHLH124根系中的4種丹參酮類化合物的含量顯著增加，而丹參酚酸類化合物含量減少，初步解析了bHLH124參與了丹參次生代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控機制。綜上所述，丹參中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的研究取得了一定的進展，但還需繼續(xù)深入。

3.2 黃花蒿

黃花蒿（Artemisia annua）是一線抗瘧藥物青蒿素的唯一天然來源，隨著青蒿素及其衍生物不斷擴大抗瘧以外的適應(yīng)癥范圍，黃花蒿的市場需求日趨增加，高青蒿素含量黃花蒿新品種的選育是目前相關(guān)研究的重點方向。甘雨等［98］基于黃花蒿全基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定出99個黃花蒿AabHLH基因，通過系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為13個亞族；同時進行AabHLH基因家族成員在不同光處理下的基因表達分析發(fā)現(xiàn)，AabHLH基因在不同水平上響應(yīng)藍光、紅光、遠紅光、白光調(diào)控；根據(jù)表達量推測其中6個亞族基因為光照條件下青蒿素合成途徑調(diào)控基因，7個亞族基因為非光照條件下青蒿素合成途徑調(diào)控基因，為深入了解AabHLH基因功能及其在不同光環(huán)境下青蒿素生物合成調(diào)控機制提供參考。黃花蒿中的amorpha ?4,11?diene合成酶（ADS）和CYP450單加氧酶（CYP71AV1）是參與青蒿素生物合成的兩種關(guān)鍵酶［99-100］，他們的啟動子均含有E?box原件，是bHLH轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點［101-102］。青蒿素主要在青蒿葉片表面的分泌型腺毛中合成和積累［103］，Ji等［104］從青蒿的腺毛的cDNA文庫中鑒定并克隆了一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子bHLH1，通過生化分析發(fā)現(xiàn)bHLH1可以通過與ADS和CYP71AV1等青蒿素生物合成相關(guān)基因啟動子中的E?box結(jié)合來正向調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，此外，bHLH1在青蒿葉片中的瞬時表達可增加青蒿素生物合成相關(guān)基因如ADS、CYP71AV1和HMGR的轉(zhuǎn)錄水平，進一步的脅迫實驗發(fā)現(xiàn)細胞外ABA處理可以誘導(dǎo)AabHLH1的表達，從而激活A(yù)BA信號通道提高其對脅迫的耐受性。這些結(jié)果表明，AabHLH1對青蒿素的生物合成具有正向調(diào)節(jié)作用。Zhang等［105］鑒定了一個在花蕾和腺體分泌毛中高表達的bHLH成員，命名為AaPIF3，能夠顯著增強青蒿素生物合成基因的啟動子活性，包括ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1，正向調(diào)控青蒿素的生物合成。并且通過AaPIF3的高表達，已成功培育出青蒿素高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植株。Xiang等［106］通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，AabHLH112與擬南芥冰結(jié)合蛋白（IBP）聚為一類，IBPs可能通過限制質(zhì)外體中冰晶的生長來幫助防止與冷凍相關(guān)的損傷［107］?？估涿{迫研究中發(fā)現(xiàn)，AabHLH112過表達顯著上調(diào)了AaERF1和青蒿素生物合成基因的表達水平，從而促進了青蒿素的合成。Shen等［108］通過基因共表達分析和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定了與青蒿素生物合成相關(guān)的兩個MYC型轉(zhuǎn)錄因子AabHLH2和AabHLH3，并且它們的表達模式與青蒿素合成途徑基因相關(guān)；進一步的實驗發(fā)現(xiàn)兩者過表達株系的青蒿素積累顯著降低，而RNAi株系的青蒿素含量顯著升高，表明AabHLH2和AabHLH3作為轉(zhuǎn)錄抑制因子負調(diào)控青蒿素生物合成，揭示了一個新的青蒿素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為植物次級代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了新見解，并為青蒿素生產(chǎn)的代謝工程提供了新的靶基因。在青蒿中，除青蒿素外還含有豐富的其他萜類化合物，倍半萜是其萜類化合物的主要成分之一。周琪［109］采用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物技術(shù)等多學(xué)科綜合手段對腺毛中高表達的AabHLH106基因進行研究發(fā)現(xiàn)，AabHLH106在青蒿中能夠激活A(yù)aBFS、AaCPS和AaECS的表達，從而促進 β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的生物合成，在倍半萜生物合成中起到正向調(diào)控作用；此外，AabHLH106還能夠響應(yīng)ABA誘導(dǎo)，推測其可能在植物逆境脅迫方面也發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了各植物物種中關(guān)于bHLH的最新研究進展，并展示了一個相對全面的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族研究概況（圖3）。目前，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)構(gòu)和功能方面的研究已取得重大突破，通過獲得bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的過表達植株或RNAi缺失體，對植株進行生理生化研究，能夠進一步明確bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能。因此利用基因工程的方法研究bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族功能，闡明bHLH協(xié)調(diào)多種內(nèi)外環(huán)境來調(diào)控植物生理的機制，改良植物的脅迫抗性從而為植物抗逆育種服務(wù)將是未來bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)研究的一個主要方向。由于bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能豐富、作用機制較為復(fù)雜，進一步全面、深入地闡明bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族功能及其作用機制，仍是一個重要課題。

圖3 bHLH家族成員參與植物生長發(fā)育和非生物脅迫過程的預(yù)測模型Fig. 3 A predictive model for the involvement of bHLH family members in the growth and development of plants and abiotic stress processes

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，結(jié)構(gòu)功能多樣，但是目前對其功能的大部分研究僅在擬南芥、煙草、水稻等模式植物中展開，具有一定的局限性。bHLH在高等植物中廣泛存在，并且隨著物種的分化進化出具有不同生化特性的功能；另外，根據(jù)蛋白序列的同源性，bHLH家族已被分類，相同的亞家族通常具有相似的序列結(jié)構(gòu)，以及更相似、保守的功能［110］。藥用植物種類繁多，具有復(fù)雜的生境、豐富的生活型，是進一步完善其起源進化多樣性及功能研究的可靠材料，同時，bHLH基因功能的精確定義可以進一步為藥用植物的栽培提供指導(dǎo)。近年來，各類藥用植物全基因組圖譜的完成，為全面、系統(tǒng)地分析轉(zhuǎn)錄因子分布和基因準(zhǔn)確功能的鑒定奠定堅實基礎(chǔ)。

在許多轉(zhuǎn)錄因子基因家族中，蛋白質(zhì)需要與同一家族或另一個家族中的另一個分子發(fā)生物理相互作用，以形成功能性二聚體并結(jié)合DNA，從而行使特定的功能［111-112］。根據(jù)合作伙伴的選擇和細胞環(huán)境，每個二聚體都會觸發(fā)一系列調(diào)節(jié)事件，從而出現(xiàn)更高階的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在植物中，有許多實例證明bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族能夠與自身結(jié)合形成同源二聚體，也能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異源二聚體、三聚體發(fā)揮作用，每個獨特的bHLH二聚體都會觸發(fā)一系列調(diào)節(jié)事件，從而導(dǎo)致特定的細胞命運，這賦予了bHLH多樣的生化特性以及廣泛參與植物生理活動的能力。因此，僅對單個bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能研究能獲取的信息十分有限，進一步研究bHLH二聚化的特異性，結(jié)合后的交互特性以及功能產(chǎn)物，對于理解植物轉(zhuǎn)錄翻譯的復(fù)雜性以及新一代育種策略都至關(guān)重要。

植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)受分子網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)控制。它們激活應(yīng)激反應(yīng)機制以重新建立內(nèi)穩(wěn)態(tài)，保護和修復(fù)受損的蛋白質(zhì)和膜，在這過程中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族起著極其關(guān)鍵的作用，改良植物對各種脅迫的抗性從而為植物抗逆育種服務(wù)將是未來關(guān)于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族研究的一個主要方向。但是，與植物響應(yīng)生物脅迫主要依賴于單基因性狀不同，植物對非生物脅迫的抗性是復(fù)雜的多基因控制的數(shù)量性狀，因此更難控制和工程設(shè)計。一般轉(zhuǎn)入單個抗逆基因?qū)χ仓甑目鼓嫘蕴岣叻扔邢?，甚至不能提高抗逆性，因此?yīng)加速多基因（尤其是調(diào)節(jié)基因）共同導(dǎo)入植物的系統(tǒng)研究，才有可能全面闡明植物的抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。事實上，各類脅迫存在一定的相似之處。例如，無論是在鹽脅迫還是干旱脅迫下，植物都會產(chǎn)生缺水脅迫，合成高水平的ABA，另外，活性氧（ROS）是在各種環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的一種重要而常見的信使，它們結(jié)合下游靶點激活特定的反應(yīng)，另外，游離脯氨酸的積累也是植物應(yīng)對各類脅迫的主要手段［113］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對作物的危害往往是幾種脅迫的同時發(fā)生［114］，對不同脅迫組合的耐受性是一個較為復(fù)雜的生理特征，涉及多種途徑以及不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的串?dāng)_，在藥用植物的種植加工中亦是如此。因此，加強多種脅迫模式的探索，才能為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供更切實的指導(dǎo)。

藥用植物發(fā)揮功效、防病治病的基礎(chǔ)是在植物體內(nèi)積累的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，這些藥用活性成分都貯存在它們的藥用部分（根、莖、樹皮、葉、花、果實或種子等）內(nèi)。因此，研究藥用植物的結(jié)構(gòu)發(fā)育與生理功能、次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，具有重要的理論和實踐意義。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH基因家族成員中只有部分基因在同一基因型、植物器官或發(fā)育階段中表達，并且它們的表達譜在不同的基因類型、組織或發(fā)育階段之間存在著倍數(shù)的差異［115］。這些表達特異性可能反映了它們的功能分化。在藥用植物中，應(yīng)該更著重于藥用部位高表達bHLH基因功能的挖掘，解析與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的分子機制和關(guān)鍵的信號通路，進一步為藥用植物的高效定向育種提供新思路與新方法。