李美芬，袁 月，馬 瑞

（云南孚爾質量檢驗檢測有限公司，云南昆明 650000）

隨著人們生活水平不斷提高，動物性產品的需求量也在不斷增加[1]，獸藥殘留問題也越來越受重視。獸藥殘留主要包括抗生素類藥物殘留、激素類藥物殘留、抗病毒藥物殘留及抗寄生蟲類藥物殘留等[2]。獸藥殘留可能引起過敏反應、增加細菌耐藥性、擾亂腸道微生物菌群平衡、污染環(huán)境，甚至有致突變、致癌和致畸作用[3-5]。因此，必須高度重視動物性食品獸藥殘留的檢測，切實加強食品安全監(jiān)管。核酸探針法檢測獸藥殘留是一種靈敏、快速、可靠的檢測技術，目前已有越來越多的學者致力于該方法的探究。本文對核酸適配體在獸藥殘留檢測中的應用研究進展進行簡要介紹，期望為動物性食品獸藥殘留的監(jiān)管和檢測技術的深入研究提供一定的參考。

1 核酸適配體

核酸適配體（Aptamer，Apt）是一種通過體外配體指數富集系統進化技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）從人工構建的寡核苷酸文庫中篩選出來的一段長度為20 ～60 nt 的單鏈寡核苷酸序列[6]。當Apt 與靶物質共存時，靶物質能夠誘導Apt 由自由構象折疊成特有的三維空間結構，如莖環(huán)、發(fā)夾、G-四鏈體等[7-9]，并通過堿基對的堆積作用、靜電作用[10]、氫鍵作用[11-12]、范德華力[13]等與靶物質特異性結合[14]，具有親和力高、特異性強、靶分子范圍廣、易于制備和修飾、穩(wěn)定性與可復性好等優(yōu)勢[15-17]。由此，核酸適配體在食品安全控制、分析化學、分子生物學以及環(huán)境檢測等方面被廣泛應用[18]。

獲得親和性高的單一適配體序列是Apt 技術的核心。SELEX 技術是目前最常用的Apt 篩選手段，通常是從一個1014～1015庫容量的隨機寡核苷酸文庫中篩選與靶物質特異性結合且具有高親和力的Apt，包括單鏈DNA 文庫合成、單鏈RNA 文庫制備、孵育、分離、轉化、擴增、單鏈DNA 次級文庫制備7 個步驟，經1 ～25 輪的篩選，即可能得到Apt[19-20]。

2 核酸適配體在食品中獸藥殘留檢測的應用

憑借Apt 的優(yōu)勢，其在動物源食品的獸藥殘留檢測發(fā)展快速。檢測方法主要有納米比色法、熒光分析法、化學發(fā)光分析法、電化學傳感器檢測法以及表面增強拉曼散射檢測法。

2.1 納米比色法

納米比色法是基于納米顆粒表面性質改變后，顏色會發(fā)生變化而建立的一種分析方法，主要有納米金、納米銀等材料[21]。金納米顆粒（Au Nanoparticles， AuNPs）具有高消光系數和良好的光學效應，近年來在分析檢測領域受到相關人員的青睞[22]。納米金比色法最早由Mirkin 等提出，主要分析方法有兩類：①基于納米材料的光學特性顯色，依據靶物質觸發(fā)AuNPs 聚集，導致波長紅移，可通過紫外可見光譜或肉眼進行測定；②基于酶催化的顯色，AuNPs 替代有機分子作為模擬酶催化反應中的底物，提高穩(wěn)定性[23-25]。

張萬方等[26]建立了一種納米金核酸適配體雜交鏈式反應放大比色法快速檢測動物源性食品中氨芐青霉素的殘留量，通過Apt 與氨芐青霉素結合，引發(fā)適配體與發(fā)夾型DNA 探針的級聯交叉互補放大效應，使其與AuNPs 表面的負電產生排斥作用，引起AuNPs 在高鹽濃度下發(fā)生聚集，吸收光譜發(fā)生紅移，該方法最低檢測限可達10 nmol·L-1，檢測回收率在92.30%～103.27%。錢成等[27]首次利用Apt 修飾的AuNPs 設計出邏輯開關組，通過Apt、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪控制AuNPs 的聚集和分散，同時快速檢測牛奶中的三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪，三聚氰胺的檢出限為85 μg·L-1，環(huán)丙氨嗪的檢出限為9.0 μg·L-1。ZHOU 等[28]利用Apt 與AuNPs 結合的比色法測定氟喹諾酮類藥物氧氟沙星，線性范圍為72.2 ～144.4 ng·L-1，檢出限為1.2 ng·L-1，具有較高的特異性，成本低、操作簡單。但由于納米顆粒的聚集行為容易受溫度、鹽濃度等的影響，可能出現假陽性，導致檢測體系不穩(wěn)定，而使用模擬酶催化的比色法可以避免這種問題。例如HUANG 等[29]將核酸適配體特異性識別結合的特性與DNA zyme 功能化納米探針催化顯色原理相結合，建立了一種新型比色生物傳感器，并將其用于檢測奶粉中氯霉素殘留，該實驗將過氧化氫酶模擬物及適配體互補探針cDNA 與AuNPs 結合，構建新的納米金探針，過氧化氫酶模擬物能催化H2O2，使3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（Tetramethylbenzidine TMB）氧化并產生比色信號，研究發(fā)現奶粉樣品中加標回收率在92.0%～104.0%，相對標準偏差＜2.7%，檢測信號大大增強。趙晨等[30]在采用AuNPs 比色法檢測水產品中孔雀石綠的研究中，也建立了一種基于十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium BromideCTAB）抑制AuNPs 過氧化物模擬酶活性的可視化檢測方法，檢測范圍在0.01 ～2.00 μmol·L-1，檢出限為1.8 nmol·L-1；同時以磁性Fe3O4納米顆粒（Fe3O4NPs）過氧化物模擬酶為催化劑，催化H2O2，氧化TMB 顯示藍色，根據DNA 適配體對Fe3O4NPs 模擬酶催化活性的抑制作用以及靶物質孔雀石綠與DNA 適配體結合的特異性，對靶物質的檢測范圍為0.1 ～1.0 μmol·L-1，檢出限為9.5 nmol·L-1。對比發(fā)現，AuNPs 模擬酶催化法檢出限更低，可用于物質的微量檢測。

2.2 熒光分析法

熒光分析法是基于熒光物質在一定的激發(fā)波長下能夠發(fā)射熒光的原理，通過檢測熒光強度的變化，對測定物質進行定性或定量分析的一種方法，具有高靈敏度、低背景值和良好選擇性等優(yōu)點，在生命醫(yī)學、化學、食品安全控制和環(huán)境檢測等各種檢測領域有廣泛的應用[31]。Apt 本身不產生熒光，需要在反應體系中引入熒光基團、熒光淬滅劑、熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和熒光內濾效應（Inner Filter Effect，IFE），引起熒光信號強度的變化。熒光基團包括熒光蛋白、熒光燃料、量子點、金屬納米粒子、碳點和納米材料等具有熒光性能的有機物、無機物和納米材料。許多納米材料除了本身有熒光效應，也能作為熒光淬滅劑，還具有吸附單鏈核酸分子的能力，如氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、納米金顆粒、金屬納米顆粒（Metal Nanoparticles，MNPs）、上轉換納米顆粒（Up-Conversion Nanoparticles，UCNPs）、碳納米管（Carbon Nanotubes，CNTs）、二氧化錳納米片和各種納米復合材料等。FRET 是當熒光供體和熒光受體的距離足夠近時，熒光能量由供體向受體轉移的現象[32]。

熒光分析法根據Apt 的標記分為標記型檢測法和非標記型檢測法兩類。其中，標記型檢測法具有靈敏度高、響應快速、可標記的熒光物質多等優(yōu)點，具有多重和實時檢測能力[33]，尤其引入新型納米熒光材料時，熒光檢測能力大大提升。如ZHANG等[34]用核殼上轉換納米粒子（Core-Shell Upconversion Nanoparticles，CSUNPs）作為熒光供體，GO 作為熒光受體，構建了一個基于適配體的CSUNPs-GO 熒光共振能量轉移平臺，以檢測食品中恩諾沙星殘留量，結果表明，溶液中恩諾沙星檢測限為0.47 ng·mL-1，商業(yè)奶粉樣品中的恩諾沙星檢測限為1.59 ng·mL-1。宋亞寧等[35]用溶劑熱法合成具有時間分辨特性的熒光納米材料NaYF 4:Ce/Tb，并基于分子對接輔助設計培氟沙星（Pefloxacin，PEF）適配體的互補鏈，納米金與發(fā)光納米材料分別修飾在適配體、互補鏈上，通過堿基互補配對誘導2 種納米材料間發(fā)生時間分辨熒光共振能量轉移，構建生物傳感PEF 的新型檢測方法，在最佳條件下，測得牛奶中獸藥殘留PEF 加標回收率為73.81%～99.86%，檢測限為0.15 μg·kg-1。LIU等[36]采用UCNPs 作為信號源和Apt 作為特定識別元件構建了檢測恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）的熒光生物傳感器，通過形成具有背景熒光信號的雙鏈結構雜交探針（UCNPs-cDNA/Apt-Fe3O4），ENR 能夠優(yōu)先與Apt-Fe3O4特異性結合，破壞部分雙鏈結構，釋放出UCNPs-cDNA，降低熒光強度，再進行磁分離，檢測雜交探針上未釋放的UCNPs 的熒光強度，最后測得ENR 回收率為85.1%～98.5%，檢出限為0.06 ng·mL-1，實現了高靈敏度檢測。

雖然標記型檢測方法的檢測靈敏度更高，但是需要對探針進行化學合成標記，過程煩瑣、耗時，非標記型檢測模式則相對簡便，無須使用化學試劑進行復雜的標記及最后的分離純化[37]。劉若冰等[38]利用AccuBlue 熒光染料和Apt 的特點，建立一種基于Apt 快速檢測動物源性食品中獸藥殘留恩諾沙星的非標記型熒光分析方法，結果表明，3 種動物源性食品（奶粉、蝦肉、牛肉）加標回收率在76.54%～98.79%，方法的特異性、穩(wěn)定性和重復性均良好。YAN 等[39]利用非標記氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）的Apt、AuNPs 和羅丹明B 構建一種熒光生物傳感器，Apt 包裹住AuNPs，在高濃度鹽溶液中保持分散狀態(tài)，能有效降低羅丹明B 的熒光強度；當OFL 與Apt 結合，脫離Apt 的AuNPs 形成聚集狀態(tài)，聚合的AuNPs 無法猝滅羅丹明B 的熒光強度，使得熒光強度增強。該研究發(fā)現牛奶樣品線性范圍為7.2 ～108.3 ng·L-1，檢出限為1.7 ng·L-1。許景月等[40]建立了一種熒光非標記型核酸適配體傳感器，雞肝樣品中多巴胺測定回收率在91.4%～103.5%，相對偏差為0.9%～2.3%。劉寧寧等[41]利用非標記型傳感器檢測四環(huán)素，通過四環(huán)素Apt 序列進行優(yōu)化，獲得具有G-四鏈體形成雙價Apt 序列，G-四鏈體結構可以激發(fā)硫代黃素T（ThT）熒光；當引入四環(huán)素后，四環(huán)素與Apt 序列結合，破壞G-四鏈體形成條件，ThT 熒光不能被有效激發(fā)，根據熒光變化作為輸出信號，測得在10 ～1×103nmol·L-1線性關系良好，R2在0.99 以上，檢測限為96 pmol·L-1，特異性強、耗時短、操作簡便，可在20 min 內完成快速檢測。

綜合近幾年相關學者對熒光生物傳感器的研究，發(fā)現其具有靈敏度高、檢測時間短、選擇性好、干擾少等優(yōu)點，但在低濃度的靶物質和實際樣品的檢測中仍存在重現性、精確度都較低的問題[42]，因此需要繼續(xù)改進方法，以便實現更穩(wěn)定、更靈敏的快速檢測。

2.3 化學發(fā)光分析法

化學發(fā)光（Chemiluminescence，CL），指發(fā)光物質自身電子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)所產生的發(fā)光，不需要使用外部光源或光學系統的化學反應，與熒光分析法相比可以有效避免光漂白效應，其檢測信號由光子數決定，具有靈敏度高、儀器簡單、校準范圍寬、操作簡便以及檢測時間短等優(yōu)點。如YAO 等[43]利用卡那霉素Apt、磁珠（Magnetic Bead，MBs）、AuNPs 構建了一種基于化學發(fā)光傳感器檢測卡那霉素的方法，將通過酰胺化的卡那霉素Apt 固定在MBs 上，Apt 互補探針cDNA 與AuNPs 結合，形成雙鏈結構雜交探針（AuNPs-cDNA/Apt-MBs），當體系存在卡那霉素時，與Apt 結合，釋放cDNA，富集的AuNPs 催化H2O2分解，魯米諾被氧化后發(fā)出藍光，研究發(fā)現該傳感器檢測限為0.035 nmol·L-1。HAO 等[44]利用碘苯酚（P-Iodophenol，PIP）構建了一個基于競爭的ABEI（乙基異魯米諾）-H2O2-PIP 化學發(fā)光系統，用以檢測牛奶樣品中氯霉素殘留。該系統先將生物素化的氯霉素適配體的磁性納米粒子作為捕獲探針，連有乙基異魯米諾的金納米結構作為信號探針，氯霉素與探針競爭性地與適配體結合，探針結合適配體后催化H2O2分解，氧化PIP 發(fā)光，該方法檢測限為0.01 ng·mL-1，線性范圍為0.01 ～0.20 μg·L-1。但由于化學發(fā)光分析法的信號探針制備相當費時耗力，發(fā)展受到限制，在動物性獸藥殘留的研究報道相對較少。

2.4 電化學傳感器檢測法

電化學適配體生物傳感器是將核酸適配體固定在電極上，根據適配體與靶分子結合后引起電化學信號改變來實現靶分子測定的一種新型生物傳感檢測裝置，具有成本低、特異性高、選擇性強以及響應速度快等優(yōu)點，在食品檢測中越來越受到關注。

FENG 等[45]建立了一種可同時檢測孔雀石綠和氯霉素的“雙電勢”新型電化學發(fā)光適配體傳感器，通過對陽極修飾，連接魯米諾-納米金粒子，增強發(fā)光信號，結果發(fā)現，魚類樣品中孔雀石綠和氯霉素檢測限分別為0.03 nmol·L-1和0.07 nmol·L-1。CHEN 等[46]采用電化學適配體傳感器檢測氯霉素時發(fā)現，通過利用納米金屬有機骨架（Nano Metal Organic Skeleton，NMOF）包封金屬離子并固定cDNA 作為信號標簽，得出該方法檢測限低至0.19 pmol·L-1，同時線性范圍為0.002 ～100.000 nmol·L-1。馮榮榮等[47]構建了兩種電化學適配體生物傳感器，一種將納米金/石墨烯修飾到電極表面，靈敏度高，檢測牛奶中卡那霉素時，線性范圍為1.0 ～10 000.0 pmol·L-1，檢出限為0.3 pmol·L-1；另一種基于核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大技術設計了一種檢測鏈霉素的核酸適配體電化學傳感器，線性范圍為0.1 ～1 000.0 pmol·L-1，檢出限為0.03 pmol·L-1。ZHANG 等[48]研究電化學傳感器測定牛奶樣品中四環(huán)素時，根據適配體與目標分子結合前后構象變化引起的電信號變化，測得四環(huán)素線性范圍在0.1 ～100.0 ng·mL-1，檢出限為1 ng·mL-1。王賽等[49]在研究四環(huán)素測定時，利用核酸適配體作為識別元件，以四環(huán)素為靶分子，在新型集成式絲網印刷表面構建電化學傳感器，通過DNA 自組裝構建了四面體納米結構，輔助適配體的定向固定，研究得出四環(huán)素線性范圍為0.01 ～1 000.00 ng·mL-1，檢測限為0.009 47 ng·mL-1，可實現微量、高靈敏度快速檢測。趙亞男等[50]建立了電化學核酸適配體傳感器用于檢測四環(huán)素殘留，以絲網印刷電極為基底電極，以具有電化學活性或催化活性的功能金屬有機框架材料為信號介質和Apt 固定載體，構建了新型的免標記電化學傳感器，實現了對草魚、鮮蝦、牛奶中四環(huán)素的測定。

2.5 表面增強拉曼散射檢測法

表面增強拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS）是一種基于目標分析物分子吸附在經過特殊處理、具有納米結構的金屬材料（如金、銀等）或非金屬材料（半導體、石墨烯、量子點等）表面，產生極強的拉曼增強效應的分子振動光譜技術[2,51]。部分基底材料可以使拉曼散射強度增強1010～1015倍[52]。因此SERS 具有檢測速度快、靈敏度高，能同時進行多重檢測等獨特的優(yōu)勢，近年來在食品安全分析領域受到關注。

核酸適配體SERS 技術是以Apt 修飾納米顆粒，作為SERS 檢測的探針，增強檢測體系的特異性。YAN 等[53]在檢測氯霉素的研究中以納米金粒子為SERS 增強基底，制備了熒光染料Cy5-適配體-納米金粒子識別探針，Cy5-適配體結合氯霉素形成莖環(huán)結構，與納米金粒子分離，使得SERS 信號強度顯著降低，實現了乳樣品中氯霉素（Chloramphenicol，CAP）殘留的高靈敏度檢測，檢測限為0.19 ng·L-1，回收率為96.6%～110.2%。WU 等[54]將四聚體金納米粒子和土霉素-DNA 適配體及其3 個不同類型部分互補的寡核苷酸序列整合到SERS 基底上開發(fā)了一種適配體傳感器，構建了對土霉素具有高親和力的環(huán)境，以探測牛奶中的土霉素殘留，結果發(fā)現檢出限為0.003 ng·mL-1。JIANG 等[55]以Au@Ag NPs 為SERS活性基底，以硫醇為拉曼報告分子，采用銀殼包裹的AuNPs-適配體作為識別探針，對未經處理的全脂牛奶中卡那霉素檢出限可達0.90 pg·mL-1。JIANG 等[56]采用4-巰基苯甲酸作為拉曼報告分子，制備的Au@Ag NPs 新型適配體傳感器用于牛奶中卡那霉素的檢測，檢出限為142 pg·mL-1。表明該活性基底在實際牛奶樣品檢測中具有很好的靈敏性和選擇性。而FANG 等[57]采用Au NPs@Si 作為活性基底，構建SERS-適配體傳感器對牛奶中的氯霉素殘留進行檢測，濃度降至1.5 pmol·L-1，靈敏度相對較低。費雪蓮等[58]建立了同時檢測牛奶中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺SERS-適配體傳感器，適配體與環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺結合后，控制納米銀在適配體表面還原，形成Cyr/Mel-DNA-Ag NPs復合物，以增強拉曼效應。結果發(fā)現，最適檢測條件下，環(huán)丙氨嗪線性檢測范圍在0.10 ～0.65 mg·L-1，檢測下限為13.6 μg·L-1；三聚氰胺線性檢測范圍在0 ～0.5 mg·L-1，檢出限為43.5 ug·L-1，可為快速檢測牛奶中獸藥殘留提供參考?？傊?，SERS 結合適配體檢測動物性食品中的獸藥殘留應用廣泛，檢測效果好，將在獸藥殘留檢測中有更好的發(fā)展前景。

3 結語

近年來，食品安全問題頻發(fā)，影響了社會大眾的身心健康和國民經濟的良性發(fā)展，其中動物性食品中獸藥殘留給食品安全造成極大的威脅?；诤怂徇m配體檢測動物性食品中獸藥殘留發(fā)展迅速，檢測結果準確，且靈敏度高。但在高質量的適配體篩選、優(yōu)質納米材料的開發(fā)合成、檢測體系的穩(wěn)定性、信號增強放大方法的探究以及多目標檢測系統的設計等方面還需重點研究。核酸適配體作為抗體替代識別探針，涉及多學科理論方法和技術手段，隨著科學技術的進步以及檢測體系的不斷完善，相信該技術在動物食品獸藥殘留檢測中的應用將會更加深入，發(fā)展前景良好。