魏振勇,王嚴(yán),遲雪梅,孫全敏,遲乃玉,張慶芳*

(1.大連大學(xué) 生命健康學(xué)院,遼寧 大連 116622;2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心,遼寧 大連 116622)

亞硝酸鹽是蔬菜發(fā)酵過程中產(chǎn)生的潛在強(qiáng)致癌物,存在潛在的食品安全問題,也被用作著色劑廣泛應(yīng)用于肉類工業(yè),同時(shí)可防止肉毒桿菌等食源性致病菌的生長(zhǎng)[1]。攝入大量亞硝酸鹽會(huì)引起高鐵血紅蛋白癥和急性中毒,并導(dǎo)致人體出現(xiàn)心跳過速、血脂下降等癥狀,還可與體內(nèi)的仲胺生成致癌性極強(qiáng)的亞硝基化合物,出現(xiàn)致癌風(fēng)險(xiǎn)[2]。隨著種植方法的改變與農(nóng)業(yè)氮肥使用量的增加,硝酸鹽在蔬菜中積累,并在發(fā)酵過程中被硝酸鹽還原細(xì)菌(例如腸桿菌)還原為亞硝酸鹽[3],因此,發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的含量及其安全性受到廣泛關(guān)注。根據(jù)研究,亞硝酸鹽在食品發(fā)酵過程中能抑制各種食源性致病菌的生長(zhǎng)[4]。

在一個(gè)發(fā)酵過程中,微生物數(shù)量龐大,菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變。傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法是獲得生物群落信息最簡(jiǎn)單的方法,但有著很大的局限性,特別是因不可培養(yǎng)特性的微生物的存在,低估了微生物的豐度和多樣性,因此采用Sanger測(cè)序和PCR-RFLP等方法對(duì)其鑒定和分類已經(jīng)成為主要的研究熱點(diǎn)[5]。其中高通量測(cè)序(HTS)技術(shù)因不僅具有高通量、高覆蓋、高準(zhǔn)確率等特點(diǎn),而且可全面地揭示樣本微生物群落的組成及多樣性等信息,已被廣泛應(yīng)用于微生物群落的研究[6]。根據(jù)目前在蔬菜發(fā)酵中利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落的相關(guān)性研究大多圍繞細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析[7]、發(fā)酵蔬菜中微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)分析[8-10],并利用相對(duì)豐度值對(duì)發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行闡述。了解某些細(xì)菌類群的豐度變化對(duì)發(fā)酵食品的生物學(xué)研究具有重要意義,然而目前常用的高通量測(cè)序技術(shù)只能得到微生物群落結(jié)構(gòu)的物種種類和相對(duì)豐度[11],而對(duì)相對(duì)豐度的分析忽略了不同樣本之間總體微生物量存在的現(xiàn)實(shí)差異,也不能反映微生物群落數(shù)量和類群間樣品的差異[12],造成了分析結(jié)果的偏差。有研究表明[13]微生物某一類群相對(duì)豐度比例的增加不一定真正與相應(yīng)微生物類群的生長(zhǎng)有關(guān),可能是其他微生物類群的衰退導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度比例增長(zhǎng)。說明對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的分析不能僅僅考慮微生物的相對(duì)豐度,應(yīng)該同時(shí)考慮微生物的總量。

基于以上因素,本研究以自然發(fā)酵與添加亞硝酸鹽發(fā)酵為研究對(duì)象,監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)、OD600 nm值及相關(guān)細(xì)菌總數(shù)的變化,選取理化指標(biāo)變化明顯的4個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)和最終發(fā)酵時(shí)間15 d進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序,將相對(duì)豐度與發(fā)酵過程中測(cè)定的OD600 nm值的結(jié)合量化成為發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的積累量,深入分析在蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響,為蔬菜發(fā)酵菌劑的選擇提供一定的基礎(chǔ),并提供一種可在一定程度上減少只參考高通量測(cè)序菌屬相對(duì)豐度帶來的偏差的方法,對(duì)未來蔬菜發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)研究中采用高通量相對(duì)豐度開展相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)變化的分析具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

大白菜、食鹽:遼寧省大連市大連大學(xué)服務(wù)中心超市;亞硝酸鈉:上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、亞硝酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氫氧化鈉、酚酞(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;DP812 土壤基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒:天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

PHS-3E型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;CRY-2112型恒溫?fù)u床 上海茸研儀器有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Thermo Multiskan 1510型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司;AL204型電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-1200型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 自然發(fā)酵

選取優(yōu)質(zhì)實(shí)心大白菜,去除壞葉后用自來水清洗干凈并瀝干表面水分;將白菜切成0.5～1 cm的均勻細(xì)絲,將切好的白菜細(xì)絲混勻;選用統(tǒng)一規(guī)格的555 mL小型發(fā)酵瓶若干瓶,每瓶裝入160 g白菜絲(經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)所得160 g/555 mL白菜絲實(shí)驗(yàn)效果最佳);注入1.5%的鹽水至滿瓶,擰緊瓶蓋,將全部酸菜置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.3.2 添加亞硝酸鹽發(fā)酵

選取優(yōu)質(zhì)實(shí)心大白菜,去除壞葉后用自來水清洗干凈并瀝干表面水分;將白菜切成0.5～1 cm的均勻細(xì)絲,注意將切好的白菜細(xì)絲混勻;選用統(tǒng)一規(guī)格的555 mL小型發(fā)酵瓶若干瓶,每瓶裝入160 g白菜絲并添加亞硝酸鈉(100 mg/L);注入1.5%的鹽水至滿瓶,擰緊瓶蓋,將全部酸菜放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.3.3 取樣

將自然發(fā)酵體系記為S體系,添加亞硝酸鈉為Y體系。每瓶酸菜代表不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的獨(dú)立發(fā)酵體系,酸菜發(fā)酵液作為研究對(duì)象,每隔12 h取出1瓶發(fā)酵菜進(jìn)行理化指標(biāo)(pH、NIT、TAN)及OD600 nm值的測(cè)定,至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

OD600 nm值測(cè)定:采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品的吸光度,吸取適量酸菜發(fā)酵液于2 cm無菌比色杯中,用零管調(diào)節(jié)零點(diǎn),以蒸餾水作為空白對(duì)照,在600 nm的紫外波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。

pH測(cè)定:使用pH計(jì)對(duì)酸菜發(fā)酵液進(jìn)行測(cè)定。

總酸測(cè)定:參照 GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[14]。

亞硝酸鹽測(cè)定:參照 GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[15]中的鹽酸萘乙二胺法測(cè)定。

細(xì)菌總數(shù)測(cè)定:參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[16]的方法,以上每個(gè)樣品均3次重復(fù)。

1.3.5 16S rRNA高通量測(cè)序

根據(jù)對(duì)兩個(gè)發(fā)酵體系的理化指標(biāo)及OD600 nm值的分析,選取具有明顯變化的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的酸菜樣本,S體系分別標(biāo)記為S1、S2、S3、S4、S5;Y體系分別標(biāo)記為YS1、YS2、YS3、YS4、YS5;每個(gè)酸菜樣本3個(gè)重復(fù)。最后將選出的樣本進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序。按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取樣本的DNA,以其為模板,采用引物對(duì)338F(5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCA-3)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTA-AT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托北京百邁客生物科技有限公司完成建庫測(cè)序。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2021和Excel 2016對(duì)監(jiān)測(cè)的指標(biāo)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中OD600 nm值的變化

由圖1可知,添加亞硝酸鹽發(fā)酵與自然發(fā)酵相比,在發(fā)酵相同時(shí)間點(diǎn)其OD600 nm值低于自然發(fā)酵,說明亞硝酸鹽可能抑制微生物的生長(zhǎng),進(jìn)而影響菌群濃度。

圖1 發(fā)酵樣品OD600 nm值Fig.1 OD600 nm values of fermented samples

2.2 理化指標(biāo)

發(fā)酵過程中的pH值、總酸含量和亞硝酸鹽含量變化情況見圖2。

圖2 發(fā)酵樣品不同時(shí)間點(diǎn)的理化指標(biāo)Fig.2 Physicochemical indexes of fermented samples at different time points

由圖2可知,發(fā)酵25 h時(shí),S體系的pH值由5.45降至3.92,Y體系的pH值由5.97降至4.51,下降趨勢(shì)劇烈,此時(shí)S體系中亞硝酸鹽含量達(dá)到“亞硝峰”(32.63 mg/L),Y體系中亞硝酸鹽含量在25～37 h降解迅速,在37 h時(shí)降解率達(dá)到54.48%。在73 h時(shí),S體系與Y體系的pH值均小于4.0。

2.3 發(fā)酵體系中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

pH值是評(píng)價(jià)蔬菜發(fā)酵程度的重要指標(biāo),下降速度越快,表明蔬菜進(jìn)入發(fā)酵時(shí)間越早,酸菜成熟速度也越快[17]。以pH值為主要變化指標(biāo),選取1,13,25,73 h和最終發(fā)酵時(shí)間15 d的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。

S體系與Y體系中各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌菌群各分類水平見表1。

表1 樣品物種數(shù)目Table 1 Number of sample species

由表1可知,兩體系共含有13個(gè)門,142個(gè)屬,體系間物種數(shù)目差異不大,發(fā)現(xiàn)添加亞硝酸鹽對(duì)發(fā)酵前后期物種數(shù)目的影響不大。

2.3.1 門水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

門水平菌群結(jié)構(gòu)見圖3。體系間相對(duì)豐度排名前五的菌門中,共有菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。在S體系中,相對(duì)豐度值大小為厚壁菌門>變形菌門>藍(lán)藻細(xì)菌門>擬桿菌門;在Y體系中,相對(duì)豐度值大小為厚壁菌門>藍(lán)藻細(xì)菌門>變形菌門>擬桿菌門。根據(jù)體系間對(duì)比,Y體系中厚壁菌門的相對(duì)豐度是S體系的1.27倍,藍(lán)藻細(xì)菌門是S體系的1.58倍,擬桿菌門是S體系的1.04倍;S體系中變形菌門的相對(duì)豐度是Y體系的2.66倍。

圖3 門水平發(fā)酵樣本(A)與體系(B)細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of bacterial community of fermented sample (A) and system (B) at the phylum level

2.3.2 屬水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

屬水平菌群結(jié)構(gòu)見圖4。兩體系間排名前十的菌屬為uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、乳球菌屬(Lactococcus)、uncultured_bacterium_o_Chloroplast、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、Brassica_napus_rape、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、異樣根瘤菌屬(Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)。均有Lactococcus、Leuconostoc、Lactobacillus3種乳酸菌菌屬。在S體系中,乳酸菌屬的相對(duì)豐度值大小為L(zhǎng)actococcus>Lactobacillus>Leuconostoc;在Y體系中,乳酸菌屬的相對(duì)豐度值大小為L(zhǎng)actococcus>Leuconostoc>Lactobacillus。體系間對(duì)比,Y體系中Lactococcus的相對(duì)豐度是S體系的1.96倍;S體系中Lactobacillus的相對(duì)豐度是Y體系的185.88倍;兩體系間Leuconostoc的相對(duì)豐度值一致(7.21%)。對(duì)比排名前十的有害菌屬,S體系中uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae的相對(duì)豐度是Y體系的30.39倍,Chryseobacterium的相對(duì)豐度是Y體系的1.13倍。

圖4 屬水平發(fā)酵樣本(A)與體系(B)菌群結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of bacterial community of fermented sample (A) and system (B) at the genus level

2.4 發(fā)酵過程中細(xì)菌總數(shù)變化

由于Y體系OD600 nm值在發(fā)酵過程中始終低于S體系,因此進(jìn)一步分析細(xì)菌總數(shù)與乳酸菌總數(shù)數(shù)量變化,結(jié)果見圖5。Y體系在發(fā)酵過程中細(xì)菌總數(shù)與乳酸菌總數(shù)始終低于S體系,說明亞硝酸鹽抑制了發(fā)酵過程中某些微生物的生長(zhǎng)。

圖5 發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化Fig.5 Change of microbial quantity in fermentation process

2.5 發(fā)酵體系中群落積累量變化與相對(duì)豐度的關(guān)系

只利用高通量測(cè)序結(jié)果中的相對(duì)豐度變化來分析微生物群落的相應(yīng)變化,忽略了各樣本之間的微生物總數(shù),使得最后的結(jié)果存在一定的偏差。為了修正相對(duì)豐度帶來的偏差,利用OD600 nm值來測(cè)定微生物在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌體濃度作為該點(diǎn)樣本中微生物的相對(duì)總數(shù),并與高通量測(cè)得的各個(gè)物種的相對(duì)豐度相乘得出更準(zhǔn)確的各個(gè)物種的相對(duì)數(shù)量(見圖6)。餅圖面積表示各樣本的OD600 nm值,面積逐漸增大,表示菌群數(shù)量逐漸增多;各物種的積累量為所代表物種的相對(duì)豐度與OD600 nm值的乘積,即所占餅圖的面積,從而可看出各個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)上物種積累量的變化。

圖6 發(fā)酵樣本門水平菌群數(shù)量變化Fig.6 Change of bacterial community of fermented samples at the phylum level

2.5.1 門水平變化分析

門水平上,各菌門在發(fā)酵過程中的積累量變化見圖6,根據(jù)餅圖大小變化,Y體系中各個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)餅圖面積始終小于S體系中各個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn),且兩體系隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)餅圖面積逐漸增大,即各樣品中微生物總數(shù)也在逐漸增多。

由圖7和圖8可知,S體系中變形菌門的相對(duì)豐度在S5階段下降,但其積累量在發(fā)酵過程中始終呈上升趨勢(shì),藍(lán)藻細(xì)菌門在S3～S5階段呈下降趨勢(shì),但其積累量在該階段始終呈上升趨勢(shì);說明相對(duì)豐度的降低并不能表示其菌門的積累量也減少。Y體系中厚壁菌門在YS3與YS4階段相對(duì)豐度相差不明顯(2.05%),但YS4階段的積累量是YS3階段的2.44倍,說明相對(duì)豐度變化不大的階段不能表示其菌門數(shù)量也沒有較大變化。在S體系中,變形菌門的積累量始終呈上升趨勢(shì),最大積累量為27.61%,而Y體系中變形菌門的積累量始終沒有較大波動(dòng),最大積累量為1.51%,說明亞硝酸鹽對(duì)變形菌門的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。厚壁菌門在S3階段的相對(duì)豐度是S2的2.29倍,YS3是YS2的15.06倍,但積累量S3是S2的7.15倍,YS3是YS2的36.89倍;藍(lán)藻細(xì)菌門在S1階段的相對(duì)豐度是S2的18.19倍,YS1是YS2的1.81倍,但積累量S1是S2的11.61倍,YS1是YS2的1.77倍;綜上,說明相對(duì)豐度的上升或下降比例不能完全說明該菌門數(shù)量也呈現(xiàn)相同比例的增加或減少。

圖7 發(fā)酵體系菌門相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of bacterial phylum of fermented system

圖8 發(fā)酵體系菌門積累量Fig.8 Accumulation amount of bacterial phylum of fermented system

2.5.2 屬水平變化分析

屬水平上,各菌屬在發(fā)酵過程中的積累量變化見圖9。

圖9 發(fā)酵樣本屬水平菌群數(shù)量變化

在S體系中,Lactococcus、Leuconostoc在發(fā)酵過程中相對(duì)豐度均呈先上升后下降的趨勢(shì),但其積累量始終呈上升趨勢(shì);在S3～S5的發(fā)酵過程中其相對(duì)豐度值始終低于Y體系中的YS3～YS5階段,其積累量也低于Y體系中的YS3～YS5階段。

在發(fā)酵過程中出現(xiàn)的有害菌屬,Y體系中的相對(duì)豐度低于S體系,根據(jù)積累量比較,uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、Enterococcus、Serratia在Y體系中各發(fā)酵階段的積累量低于S體系,如uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae在YS1(0%)階段低于S1(0.01%),在YS2(0.02%)低于S2(1.93%),在YS3(0.15%)低于S3(7.63%),在YS4(0.53%)低于S4(17.14%),在YS5(0.33%)低于S5(20.09%),說明亞硝酸鹽可抑制有害菌的生長(zhǎng)。

3 結(jié)果與討論

通過高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到的相對(duì)豐度變化不能準(zhǔn)確地反映實(shí)際分類單元密度的動(dòng)態(tài)[13]。因不同樣本之間總體微生物量存在現(xiàn)實(shí)差異,所以將相應(yīng)的相對(duì)豐度與OD600 nm值結(jié)合,量化微生物的類群總量,是深入分析環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的重要前提。而微生物總量是微生物學(xué)的一項(xiàng)基本指標(biāo),對(duì)其進(jìn)行測(cè)定往往很繁瑣、費(fèi)時(shí)[18]。考慮到這一因素,本研究采用分光光度計(jì)對(duì)微生物的OD600 nm值進(jìn)行測(cè)定,其具有簡(jiǎn)便、迅速、可連續(xù)測(cè)定、適合自動(dòng)控制等優(yōu)點(diǎn);且與微生物的總數(shù)變化呈正相關(guān);又有與高通量測(cè)序中死菌、活菌一起測(cè)定的性質(zhì)。通過將高通量測(cè)序方法得到的相對(duì)豐度與測(cè)定的OD600 nm值相結(jié)合,來計(jì)算相應(yīng)菌屬的微生物積累量,進(jìn)一步對(duì)蔬菜發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在門水平上,S體系中變形菌門的相對(duì)豐度在S5階段下降,但其積累量在發(fā)酵過程中始終呈上升趨勢(shì);藍(lán)藻細(xì)菌門在S3～S5階段呈下降趨勢(shì),但其積累量在該階段始終呈上升趨勢(shì)。Y體系中厚壁菌門在YS3與YS4階段相對(duì)豐度相差不明顯(2.05%),但YS4的積累量是YS3的2.44倍。厚壁菌門在S3階段的相對(duì)豐度是S2的2.29倍,YS3是YS2的15.06倍,但積累量S3是S2的7.15倍,YS3是YS2的36.89倍;藍(lán)藻細(xì)菌門在S1階段的相對(duì)豐度是S2的18.19倍,YS1是YS2的1.81倍,但積累量S1是S2的11.61倍,YS1是YS2的1.77倍。表明只參考相對(duì)豐度帶來的結(jié)果并不能準(zhǔn)確地反映發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,同時(shí)菌屬相對(duì)豐度的降低并不能代表其菌屬總數(shù)的減少;當(dāng)菌屬相對(duì)豐度值沒有明顯波動(dòng)時(shí)也不能表示其菌屬微生物總數(shù)也沒有波動(dòng);同時(shí)相對(duì)豐度的上升或下降比例不能完全說明該菌門數(shù)量也呈現(xiàn)相同比例的增加或減少。進(jìn)而表明在利用高通量測(cè)序?qū)ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析時(shí),不能僅僅考慮微生物的相對(duì)豐度,應(yīng)該同時(shí)考慮微生物的總量。

對(duì)蔬菜發(fā)酵的研究中,關(guān)于亞硝酸鹽問題早已成為蔬菜發(fā)酵研究的熱點(diǎn)之一。在發(fā)酵過程中,不僅微生物群落會(huì)受到各種因素的影響,亞硝酸鹽含量也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化,研究亞硝酸鹽與發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系,以確定發(fā)酵過程中的核心微生物,對(duì)最佳發(fā)酵劑的選擇具有重要意義。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),門水平上,S體系中變形菌門的積累量始終呈上升趨勢(shì)且最大積累量為27.61%,而Y體系中變形菌門的積累量始終沒有較大波動(dòng),最大積累量為1.51%,說明亞硝酸鹽對(duì)變形菌門的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。屬水平上,兩體系發(fā)酵過程中有害菌屬的相對(duì)豐度值與積累量表明亞硝酸鹽可抑制有害菌的生長(zhǎng)。相對(duì)豐度與積累量顯示,在發(fā)酵過程中,S體系中Lactococcus、Leuconostoc為發(fā)酵前期主要優(yōu)勢(shì)乳酸菌屬,Lactobacillus為發(fā)酵末期主要優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌屬;Y體系中Lactococcus、Leuconostoc參與整個(gè)發(fā)酵過程,并以Lactococcus為優(yōu)勢(shì)乳酸菌菌屬。在Y體系中,亞硝酸鹽一直處于降解狀態(tài),在發(fā)酵前期pH大于4.5時(shí),乳酸菌產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物(如亞硝酸還原酶),此時(shí)亞硝酸鹽降解以酶降解為主[19-20];在發(fā)酵后期發(fā)酵環(huán)境中pH不斷降低,H+與亞硝酸鹽發(fā)生非酶歧化反應(yīng),亞硝酸鹽的降解由酶降解轉(zhuǎn)為酸降解[20];在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生各種氨基酸,亞硝酸能與含游離α-氨基的氨基酸發(fā)生反應(yīng)[21],進(jìn)而降低其含量;同時(shí)發(fā)酵體系中的反硝化細(xì)菌含有亞硝酸鹽還原酶,可通過好氧或厭氧反硝化過程將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成一氧化二氮或氮?dú)鈁22],從而降低亞硝酸鹽含量。最后本研究中亞硝酸鹽對(duì)發(fā)酵過程中的微生物量有一定的影響,對(duì)蔬菜發(fā)酵劑的進(jìn)一步選擇與發(fā)酵工藝的改進(jìn)有一定的參考意義。