劉平方,蔡承哲,馮小倩,葉賢區(qū),許卓帆

(廣州市第十二人民醫(yī)院,廣東 廣州 510620)

冠心病(CHD)病發(fā)的重要危險(xiǎn)因素之一即為糖尿病(DM),其在心血管疾病的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用［1］。近年調(diào)查顯示,CHD的發(fā)病率已呈現(xiàn)下降趨勢(shì),但合并DM者卻日益增多［2］。而DM合并CHD患者死亡風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更高,可促使心肌發(fā)生惡化,對(duì)患者預(yù)后生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響［3］。有研究顯示,氧化應(yīng)激損傷可加重DM患者心肌梗死的程度,而Nrf2-ARE信號(hào)通路是一種內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答的機(jī)制,在氧化應(yīng)激調(diào)控領(lǐng)域地位顯著［4］。一方面,氧化應(yīng)激可致使Keap1-Nrf2復(fù)合體發(fā)生解離,增加游離Nrf2的比例,而細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2可以通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核中,對(duì)下游的二相解毒酶基因和抗氧化蛋白具有上調(diào)作用,進(jìn)而產(chǎn)生氧化應(yīng)激抑制作用［5-6］。氧化應(yīng)激還可促進(jìn)Nrf2蛋白的合成。相關(guān)研究顯示,HO-1等對(duì)Nrf2-ARE信號(hào)通路產(chǎn)生保護(hù)作用的內(nèi)源性基因［7］。故本文探討Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)糖尿病心肌梗死大鼠氧化應(yīng)激的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究,為糖尿病心肌梗死患者的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只清潔級(jí)別SD雄性大鼠,體重(156.87±12.28)kg,均購(gòu)于南京斯科瑞生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)上海金畔生物科技有限公司。本次試驗(yàn)經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2造模與分組［8-9］:采用高熱量飲食+STZ 注射方法制備2型糖尿病模型40只,隨機(jī)分為糖尿病組(DM組)和糖尿病合并心肌梗死組(DMI組)兩組,各20只。其中DMI組再通過(guò)結(jié)扎前降支的方式制備心肌梗死模型,另取20只健康大鼠作為空白組。其中糖尿病大鼠建模方法:采用STA注射+高熱量飲食的方式制備糖尿病大鼠模型,高脂飼料喂養(yǎng)6 w以后,按照30 mg/kg STZ的量一次性腹腔注射,之后對(duì)尾血血糖水平采用血糖儀(G086型;湖南達(dá)優(yōu)醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定,明顯多尿且血糖值不小于16.7 mmol/L即為建模成功。心肌梗死建模方法:在呼吸機(jī)輔助下,左側(cè)2～3肋骨間進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù),于肺動(dòng)脈圓錐和左心耳交界位置下方2 mm處進(jìn)行前降支結(jié)扎處理。當(dāng)近心尖的左室前壁變?yōu)榘祷疑?收縮力消失或者降低時(shí);心電圖出現(xiàn)Q波以及ST段弓背向上抬高,即為建模成功。

1.3活性氧(ROS)、活性氮(RON) :各組大鼠均喂養(yǎng)1 w后,取心肌組織,采用連續(xù)緩沖液進(jìn)行洗滌處理,取出適量心肌組織,再向其中加入適量的磷酸鉀緩沖液以配成10%勻漿液,離心分離,取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)心肌組織ROS、RON水平進(jìn)行測(cè)定,試劑盒購(gòu)于艾美捷科技有限公司。

1.4Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)［10-11］:通過(guò)Western印跡法對(duì)HO-1、Nrf蛋白進(jìn)行檢測(cè),取0.1 mg保存的心肌組織,采用裂解液500 μl進(jìn)行裂解處理,冰浴后離心10 min,取部分上清,心肌組織HO-1、Nrf蛋白采用BCA蛋白測(cè)試試劑盒進(jìn)行測(cè)定。采用上樣緩沖液對(duì)剩余上清進(jìn)行封閉處理,10 min沸水浴后,-70℃保存。各個(gè)樣品進(jìn)行凝膠電泳上樣,之后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯微孔膜,脫脂奶粉進(jìn)行60 min的封存,在4℃條件下進(jìn)行一抗封閉處理,PBST進(jìn)行3次洗膜,15 min/次,二抗(1∶4 000)處理,常溫條件下進(jìn)行60 min孵育,PBST漂洗,采用凝膠系統(tǒng)對(duì)上述進(jìn)行成像,目的條帶灰度值通過(guò)Labwork4.6進(jìn)行分析,其中HO-1采用β-actin校正,Nrf2采用H1校正。

1.5Ⅱ相解毒酶表達(dá):取1.3中所述心肌組織上清液,通過(guò)氧化酶活性,采用分光光度法對(duì)心肌組織過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)水平進(jìn)行測(cè)定,試劑盒購(gòu)于上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠心肌組織Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá):與空白組相比,DM組和DMI組大鼠心肌組織HO-1、Nrf表達(dá)水平逐漸降低,且DMI組降低更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1和圖1。

a、b、c分別表示DMI組、DM組、空白組

表1 各組大鼠心肌組織Nrf2-ARE信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)

2.2各組大鼠心肌組織ROS、RON水平表達(dá):與空白組相比,DM組和DMI組大鼠心肌組織ROS、RON表達(dá)水平逐漸升高,且DMI組升高更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織ROS、RON水平表達(dá)

2.3糖尿病心肌梗死大鼠氧化應(yīng)激與Nrf2-ARE信號(hào)通路的相關(guān)性:經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示,糖尿病心肌梗死大鼠心肌組織ROS表達(dá)水平與HO-1、Nrf表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),心肌組織RON表達(dá)水平與HO-1、Nrf表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 糖尿病心肌梗死大鼠氧化應(yīng)激與Nrf2-ARE信號(hào)通路的相關(guān)性

2.4各組大鼠心肌組織CAT、SOD的表達(dá)水平比較:與空白組相比,DM組和DMI組大鼠心肌組織CAT、SOD表達(dá)水平逐漸升高,且DMI組升高更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組心肌組織大鼠CAT、SOD的表達(dá)水平比較

3 討論

研究顯示,DM的病發(fā)與內(nèi)分泌失調(diào)、氧化應(yīng)激、環(huán)境、感染等因素關(guān)系密切,其中MI是重要的一種并發(fā)癥［12］。氧化應(yīng)激是機(jī)體在受到相關(guān)外界刺激時(shí),體內(nèi)產(chǎn)生的ROS和RON高活性分子過(guò)多,超出機(jī)體清除能力,會(huì)致使機(jī)體氧化還原系統(tǒng)失調(diào),進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等氧化性損傷,最終造成組織器官損傷和細(xì)胞凋亡［13］。為維持機(jī)體氧化還原平衡,機(jī)體會(huì)對(duì)多余的自由基進(jìn)行清除。而Nrf2-ARE信號(hào)通路是近年抗氧化研究的熱點(diǎn),其介導(dǎo)的多種基因表達(dá)被認(rèn)為是抗氧化的重要機(jī)制［14］。Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活可以有效降低ROS和RON的產(chǎn)生,同時(shí)還可改善機(jī)體胰島素抵抗?fàn)顩r,糾正患者生化功能紊亂,從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的功能,在DM合并心肌梗死的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用［15］。

Nrf2-ARE通路的核心分子是Nrf2-和HO-1。有研究顯示,其在解毒、免疫調(diào)節(jié)、抗組織損傷抗炎、抗氧化等過(guò)程均具有重要作用,通過(guò)調(diào)節(jié)此通路可以發(fā)揮抗心臟、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用［16］。而氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS和RON會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)大分子生物的生理功能產(chǎn)生間接或直接的影響,是引發(fā)糖尿病心肌梗死患者的重要病理基礎(chǔ)［17］。文中相關(guān)性分析顯示,糖尿病心肌梗死大鼠Nrf2-ARE通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),這可能是由于機(jī)體在受到氧化應(yīng)激損傷時(shí),會(huì)形成一種復(fù)雜的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)。近年研究顯示,Nrf2-ARE通路在抵抗外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激損傷中作用顯著,是目前最重要的一種內(nèi)源性抗氧化通路［18］。有研究顯示,對(duì)敲除Nrf2基因的小鼠,誘導(dǎo)性和基礎(chǔ)性基因的表達(dá)顯著降低,而小鼠ROS和RON生成量大大增加,氧化應(yīng)激損傷程度增加,這也說(shuō)明了Nrf2-ARE通路在小鼠氧化應(yīng)激調(diào)控過(guò)程中作用顯著［19］。本文結(jié)果顯示,糖尿病心肌梗死組大鼠心肌組織CAT、SOD表達(dá)水平更高,故Nrf2-ARE通路可能是通過(guò)對(duì)CAT、SOD的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗氧化應(yīng)激的作用。這主要是由于CAT、SOD是Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的代表物質(zhì),可以有效地對(duì)機(jī)體系統(tǒng)內(nèi)的自由基進(jìn)行有效清除,從而對(duì)ROS和RON的產(chǎn)生具有較好的預(yù)防作用。SOD是以超氧化物陰離子自由基為主要底物,可以對(duì)體內(nèi)歧化作用生成過(guò)氧化氫產(chǎn)生催化作用,是機(jī)體氧自由基重要的清除劑［20］。另外,在外界化學(xué)物質(zhì)或者自由基的刺激下,Nrf2可以被快速磷酸化,從而解離Keap1,兩者均被活化,被活化的Nrf2在進(jìn)入細(xì)胞核以后,會(huì)與ARE相互結(jié)合,進(jìn)而對(duì)下游的蛋白酶體/分子伴侶、Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄基因產(chǎn)生啟動(dòng)作用,促使CAT、SOD等分子的大量表達(dá),起抵抗外界有害刺激的功效［21］。而HO-1等氧化還原基因還是一種重要的內(nèi)源性保護(hù)基因。上述蛋白相互之間會(huì)產(chǎn)生一種抗氧化的協(xié)同作用,對(duì)過(guò)量的ROS和RON等分子產(chǎn)生清除效果,具有較好的細(xì)胞氧化應(yīng)激對(duì)抗和氧化還原狀態(tài)維持作用［22］。

綜上所述,糖尿病心肌梗死大鼠Nrf2-ARE信號(hào)通路可能通過(guò)CAT、SOD分子對(duì)其氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)而避免細(xì)胞和組織免受損傷,具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。