龐碧瀅,黃娜娜,黃曉霞,李 馨,熊文婷,孔 波,姚 焱

(廣州大學生命科學學院,廣東 廣州 510000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)常與以肥胖、2型糖尿病、胰島素抵抗、血脂異常等代謝綜合征密切相關(guān),NAFLD全球患病率高達25%,我國NAFLD患病率已趕超歐美發(fā)達國家,成為我國最大的慢性肝病,嚴重危害國民健康和社會發(fā)展［1］。 NAFLD發(fā)病機制復雜,發(fā)展周期長,其病理機制尚未完全闡明,無高效的微創(chuàng)診斷工具［2］。近年多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)不同細胞來源的外泌體miRNA串擾細胞間信息交流,調(diào)控脂肪肝、肝臟炎性反應、肝纖維化的形成,參與NAFLD疾病各階段的發(fā)展,是潛在的非侵入性生物標志物,具有NAFLD疾病分期診斷潛力。本文就外泌體miRNA對脂肪肝、肝臟炎性反應和肝纖維化的影響,探討外泌體miRNA作為生物標志物在NAFLD疾病中的作用機制和診斷價值,為其在NAFLD進展中的基礎(chǔ)研究和診斷應用提供新的見解。

1 外泌體miRNA的生物形成

miRNA作為短的非編碼序列,廣泛表達且穩(wěn)定存在,是調(diào)節(jié)基因表達的重要手段。成熟的miRNA與其他蛋白等成分運輸進入細胞外囊泡(EVs),根據(jù)大小和來源,EVs主要分為外泌體、微囊泡(MVs)和凋亡小體,EVs通過質(zhì)膜向外出芽的微囊泡途徑以及內(nèi)體膜內(nèi)向出芽的外泌體途徑進行細胞釋放,是運輸細胞間和組織器官間的通訊及細胞外循環(huán)生物標志物的重要載體,對疾病診斷和預后具有重要意義［3］。成熟的miRNA常通過誘導沉默復合體(RISC)相關(guān)途徑、miRNA基序介導的異質(zhì)性核蛋白(hnRNPs)依賴途徑、神經(jīng)酰胺依賴途徑和3′miRNA序列依賴途徑進入外泌體中,被釋放出細胞,通過與受體細胞膜融合、吞噬作用或配體受體結(jié)合的方式傳遞給受體細胞,進行細胞間信號轉(zhuǎn)導［3-4］。

2 肝臟外泌體miRNA的主要來源

影響NAFLD疾病的外泌體miRNA主要來自脂肪組織、免疫細胞和肝臟細胞的分泌。脂肪組織作為動態(tài)的內(nèi)分泌器官,是外泌體miRNAs的主要來源,脂肪組織代謝和功能受損釋放的miRNAs與肥胖相關(guān)疾病發(fā)病機制密切相關(guān)［5］。脂肪組織和肝臟等主要代謝器官在功能受損時,脂肪組織中的脂肪細胞和免疫細胞改變循環(huán)中外泌體miRNA池,脂肪組織來源外泌體miRNA常將脂質(zhì)過剩信號傳導至肝臟,引起肝臟脂質(zhì)堆積,脂肪組織駐留的巨噬細胞的活化與脂毒性的雙重作用加劇NASH的發(fā)生［6］。肝臟健康或受損時,肝臟自身分泌的外泌體miRNA介導肝細胞間,肝實質(zhì)細胞與肝非實質(zhì)細胞間重要的通訊連接,肝臟免疫細胞和肝非實質(zhì)細胞活化促進肝臟炎癥因子和纖維化產(chǎn)生［7-8］。脂肪組織將外泌體miRNA分泌至肝臟調(diào)節(jié)代謝,肝臟也通過感知不同的代謝狀態(tài)分泌外泌體miRNA發(fā)送相應的信號以應對脂質(zhì)過載時的代謝變化［9］。外泌體miRNAs是連接肝臟和脂肪組織內(nèi)分泌調(diào)節(jié)回路的基礎(chǔ)。目前,串擾NAFLD發(fā)病的不同組織來源外泌體miRNA的作用機制仍是一大研究挑戰(zhàn)。

3 外泌體miRNA在NAFLD疾病發(fā)展中的作用

NAFLD是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn),脂質(zhì)大量堆積,持續(xù)性NAFLD進一步導致肝細胞的脂肪毒性、庫普弗細胞的氧化應激升高和促炎因子的激活以及肝星狀細胞的活化,促進NAFLD的發(fā)展。脂肪組織、免疫細胞和肝臟細胞來源的外泌體miRNA與肝細胞間的信號通訊在脂肪變性、肝臟炎性反應和肝纖維化發(fā)生過程中起到至關(guān)重要的作用。因此,了解不同來源外泌體miRNA與脂質(zhì)代謝、炎性反應和肝纖維化的串擾機制,對認識NAFLD疾病發(fā)展的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀有重要意義。

3.1外泌體miRNA與脂肪肝:體內(nèi)循環(huán)中的脂肪酸超過組織儲存和氧化能力時,游離脂肪酸被攝入肝細胞內(nèi),脂肪酸在肝內(nèi)代謝失衡,脂質(zhì)大量堆積,容易引起脂肪變性［10］。外泌體miRNA在脂質(zhì)合成、脂肪酸氧化等脂質(zhì)代謝中起重要調(diào)節(jié)作用。脂肪細胞衍生的外泌體(ADEs)含豐富的miR-122,miR-122直接結(jié)合NAD依賴性去乙酰化酶(Sirt1)的3′UTR抑制其表達,Sirt1過表達可逆轉(zhuǎn)ADEs誘導的細胞凋亡、糖脂代謝、肝臟炎性反應和纖維化的增加,抑制ADEs中miR-122可緩解NAFLD的進展、脂質(zhì)和糖代謝、肝臟炎性反應和纖維化［11］。研究表明,miR-122通過靶向Sirt1抑制LKB1/AMPK通路促進肝臟脂肪生成［12］。抑制miR-122可阻斷TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路,緩解油酸誘導的人原代肝細胞脂質(zhì)積累和炎性反應［13］?？芍?富含miR-122的外泌體對降低脂肪酸β氧化,誘導脂肪變性形成脂肪肝的作用尤為突出。除了外泌體miR-122外,肥胖小鼠外泌體miR-192、miR-27a-3p和miR-27b-3p增加,降低脂肪組織和肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)表達和脂肪酸氧化能力,肝臟吸收過量脂肪酸,誘發(fā)肝臟脂肪變性［14］。miR-199a-5p在小鼠脂肪組織和HEK293細胞的外泌體中高表達,下調(diào)哺乳動物不育20樣激酶1 (MST1)表達,影響固醇調(diào)控序列結(jié)合蛋白(SREBP-1c)表達和AMPK信號級聯(lián),上調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1α)和脂肪酸合酶(FASN)的表達,抑制脂肪分解,促進肝脂滴形成,加劇肝細胞脂質(zhì)積累,使用含anti-miR-199a-5p的外泌體可減輕脂肪變性［15］。在脂肪肝形成過程中,脂肪組織常通過外泌體miRNAs將脂質(zhì)代謝失調(diào)的信號傳導至肝臟,在肝臟脂肪酸氧化、脂肪合成與分解等脂質(zhì)代謝過程起動態(tài)調(diào)節(jié)作用,誘導肝臟吸收過量游離脂肪酸,大量蓄積脂肪。

3.2外泌體miRNA與肝臟炎性反應:脂毒性肝細胞周圍的中性粒細胞浸潤是NASH的標志性特征,脂肪組織巨噬細胞的數(shù)量和狀態(tài)與炎性反應緊密相關(guān),巨噬細胞從抗炎的M2型轉(zhuǎn)換成促炎的M1型的過程中,產(chǎn)生促炎細胞因子,加劇炎性反應。脂肪毒性和巨噬細胞介導的炎性反應在NASH的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用,驅(qū)動脂肪肝向更加嚴重的NASH演變［16］。脂毒性損傷可誘導肝細胞源的外泌體miR-192-5p高水平釋放,通過調(diào)節(jié)Rictor/Akt/FoxO1信號通路,介導促炎巨噬細胞的激活,誘導一氧化氮合酶、白細胞介素6和腫瘤壞死因子α表達增加,同時抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素不敏感伴侶(Rictor)的蛋白表達,從而進一步抑制Akt和叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1 (FoxO1)的磷酸化水平,誘導炎性反應,外泌體miR-192-5p是NASH的潛在無創(chuàng)生物標志物和治療靶點［17］。脂肪毒性還通過誘導肝細胞溶酶體功能障礙,抑制細胞外囊泡的降解,增加外泌體miR-122-5p釋放,引起M1巨噬細胞極化發(fā)生炎性反應,因此,改善溶酶體功能并抑制miR-122水平可能是NASH潛在的治療手段［18］。抑制細胞外囊泡相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)可消除細胞間肝miR-122向肝巨噬細胞的轉(zhuǎn)移并減少性反應［19］。此外,研究發(fā)現(xiàn)肝巨噬細胞-庫普弗細胞(KCs)在NASH的發(fā)病中起重要作用,KCs產(chǎn)生內(nèi)源性miR-690,通過外泌體分泌到肝細胞、肝巨噬細胞(RHMs)和肝星狀細胞(HSC)中,直接抑制肝星狀細胞中的纖維生成、RHMs中的炎性反應和肝細胞中的新生脂肪生成,庫普弗細胞miR-690的特異性敲除可促進NASH發(fā)病［20］。有研究表明,肥胖小鼠中性粒細胞來源的外泌體miR-223被肝細胞上的低密度脂蛋白受體(LDLR)選擇性攝取,抑制肝巨噬細胞活化,減少活性氧的產(chǎn)生和促炎介質(zhì)的產(chǎn)生,中性粒細胞與肝細胞之間的通訊在控制NAFLD的進展中起著重要作用［6］。脂肪細胞源外泌體miR-34a分泌到巨噬細胞中,作為促炎的關(guān)鍵介質(zhì)通過抑制Kruppel樣因子4的表達來抑制M2極化,刺激炎性反應發(fā)生,將脂質(zhì)過剩的信號傳遞給脂肪駐留的巨噬細胞,加劇肥胖誘導的包括肝臟在內(nèi)的全身炎性反應和代謝失調(diào)［21］。這些機制表明外泌體miR-690、miR-122、miR-223和miR-34a是減少肝臟炎性反應發(fā)生的干預靶標,脂毒性誘導的外泌體miRNAs介導的巨噬細胞活化和遷移是推動肝臟發(fā)生炎性反應損傷的主要因素。脂肪細胞、免疫細胞和肝細胞間外泌體miRNA信息的串擾,不僅加速肝細胞死亡,還促進NAFLD疾病向關(guān)鍵的NASH階段發(fā)展。因此,深入研究肝細胞、外泌體miRNA與巨噬細胞的互作機制和通訊交流,對延緩甚至阻斷NAFLD發(fā)展具有重要意義。

3.3外泌體miRNA與肝臟纖維化:肝纖維化發(fā)生在慢性肝損傷過程中,肝星狀細胞(HSCs)的活化是肝纖維化的關(guān)鍵原因。在免疫細胞、肝巨噬細胞造血干細胞與肝星狀細胞間外泌體miRNA信息的串擾在驅(qū)動肝纖維化發(fā)生中都起著至關(guān)重要的作用。脂毒性肝細胞源性外泌體miR-1297過表達,通過上調(diào)肝星狀細胞中纖維化促進基因(PCNA)表達,下調(diào)磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)表達,調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路,促進肝星狀細胞的活化和增殖,加速NAFLD的進展［22］。酸感離子通道1a (ASIC1a)可導致HSC-T6細胞活化,活化的HSC-T6細胞產(chǎn)生的外泌體miR-301a-3p被靜止的HSC-T6細胞重吸收,靶向B細胞易位基因1(BTG1),促使HSC活化,促進肝纖維化過程［23］。THP-1巨噬細胞的外泌體miR-103-3p可通過靶向Kruppel樣因子4(KLF4)促進HSC的增殖和活化,肝纖維化患者血清外泌體miR-103-3p是肝纖維化的生物標志物,巨噬細胞和HSC之間的串擾在肝纖維化發(fā)病中起重要作用［24］。巨噬細胞可分化為促炎M1表型和抗炎M2表型,M1型巨噬細胞可促進肝纖維化的發(fā)展。M1巨噬細胞來源的外泌體miR-125b-5p過表達靶向抑制Star相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移域基因(Stard13),提高HSC中MMP2、TIMP金屬肽酶抑制劑1(TIMP1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(COL1)和NF-κB的表達,促進HSC活化［25］。間充質(zhì)干細胞(MSCs)的旁分泌外泌體miRNA是細胞間通訊的重要信使,富集在MSCs外泌體中的miR-148a通過抑制信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路,靶向Kruppel樣因子6(KLF6),抑制巨噬細胞炎性反應,防止肝臟纖維化,miR-148a通過KLF6/STAT3信號調(diào)節(jié)肝內(nèi)巨噬細胞功能,為肝纖維化提供了潛在的治療靶點［26］。

4 外泌體miRNA作為NAFLD疾病診斷的生物標志物

外泌體miRNAs作為脂肪組織和肝臟基因表達的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子,介導組織細胞間信息串擾,參與NAFLD疾病各階段發(fā)生過程。

4.1目前NAFLD的診斷手段:侵入性的肝臟活檢仍是臨床NAFLD疾病診斷的主要手段,但其經(jīng)濟成本巨大、取樣誤差大、可及性和重復性低［27］。臨床中,與NAFLD相關(guān)的脂肪變性、肝實質(zhì)炎癥和纖維化三種病理特征可能共存于同一肝臟內(nèi),并且特定區(qū)域有不同病理程度,影響肝活檢評估肝臟狀態(tài)的可靠性［28］。近年研究聚焦于非侵入性評估手段,現(xiàn)已引入超聲、計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)和質(zhì)子磁波譜等非侵入性成像檢測手段替代活檢,但這些技術(shù)嚴重依賴于專業(yè)人員和昂貴的設(shè)備［29-30］。因此迫切需要改進用于NAFLD疾病診斷分期的非侵入性微創(chuàng)工具。研究表明,外泌體miRNA參與NAFLD發(fā)展的病理生理過程,具有較高的特異性和敏感性、微創(chuàng)性、測量成本低、易量化等特點,在NAFLD疾病分期中具有巨大的診斷應用潛力。

4.2外泌體miRNA在NAFLD疾病分期中的診斷價值:NAFLD嚴重程度的無創(chuàng)診斷手段有限。有研究根據(jù)NAFLD患者的炎性反應、脂肪變性、腫脹評分和NAFLD活動評分(NAS),分析外泌體miRNAs譜、臨床及生化指標與mRNA表達的相關(guān)性,證實血清外泌體miRNAs可用于評估NAFLD疾病分期,這有助于確定NAFLD治療的潛在靶點［31］。血清外泌體的相關(guān)指標可評價NAFLD和肝癌患者的嚴重程度,外泌體miRNA可用于診斷和預后評估［32-33］。miR-34a、miR-122和miR-21在肝細胞中豐度高,能反映肝臟毒性,是調(diào)控NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子途徑中研究廣泛的miRNA。NAFLD患者肝臟miR-34a的表達水平隨著疾病進展而不斷升高,通過增加線粒體連接蛋白p66Shc的表達來增加肝細胞凋亡,將氧化應激信號傳遞到凋亡,同時,miR-34a/SIRT1/p53信號通路也在肝細胞中特異性激活,參與肝細胞凋亡和HSC活化,肝細胞分泌的miR-34a促使NAFLD發(fā)展到NASH階段［34-35］。miR-122是人原代細胞高水平的肝臟特異性miRNA,由脂肪細胞和肝細胞分泌,在NAFLD早期脂肪肝階段中,肝臟miR-122高水平存在,促進脂肪肝的形成,隨著NASH的進展和纖維化的進展逐漸降低［36］。miR-21的表達水平隨著NAFLD的進展而升高,在脂質(zhì)堆積階段受STAT3調(diào)控,靶向PPARα促進脂肪變性,還通過抑制肝細胞核因子4α(HNF4α)、PTEN和LDL受體相關(guān)蛋白6(LRP6)等基因表達,活化肝星狀細胞和肝細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)誘導纖維化,促進NAFLD向NASH發(fā)展,并在肝硬化和肝癌中保持高水平［36］。目前大部分外泌體miRNA的細胞來源不明確,但在體液中穩(wěn)定存在,分泌到血液循環(huán)外泌體miRNA已被證明可作為特定人類疾病的生物標志物。血液miRNA譜分析證實外泌體miRNA具有改善NAFLD/NASH診斷的潛力,miR-122、miR-34a和miR-192的升高有助于區(qū)分NASH和NAFL,miR-122和miR-34a可區(qū)分NAFLD和健康對照狀態(tài)以及NASH和NAFL,診斷準確性較高,miR-34a、miR-122和miR-99a這類miRNA 作為總的血清學生物標志物對NAFLD疾病分期具有較好的診斷效果,miRNA對NASH的診斷效果優(yōu)于NAFLD,在區(qū)分NASH和NAFL方面具有很高的準確性［37-38］。

5 小結(jié)

NAFLD發(fā)病機制的復雜性仍是開發(fā)高效診斷工具和有效治療方法的重大挑戰(zhàn),近年許多研究揭示不同細胞來源外泌體miRNA在人類NAFLD發(fā)病中的串擾,是該疾病演變機制的關(guān)鍵,外泌體miRNA作為NAFLD疾病分期的生物標志物和作為延緩或阻止疾病進展的治療靶標均表現(xiàn)出巨大的前景,但作為一項新的診斷治療工具還處在早期研究階段,許多機制研究尚未明晰,深入研究外泌體miRNA在NAFLD進展中的作用機制,將有助于診斷工具開發(fā)和臨床治療。