崔煥煥，鄭 帥，劉曉云，何戎華，陳歡歡*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，江蘇 南京 210029；2無錫市惠山區(qū)人民醫(yī)院內分泌科，江蘇 無錫 214000

近年來全球糖尿病的發(fā)病率逐年提高，雖然臨床上可供選擇的降糖藥層出不窮，但在臨床工作中仍會遇到一些比較棘手的病例，即使嘗試多種降糖方案后治療效果仍不理想?；蛟\斷技術的發(fā)展日新月異，為進一步尋找這些患者的病因提供了有力支持。筆者發(fā)現(xiàn)了1 個褪黑激素受體1B（melatonin receptor 1B，MTNR1B）基因突變合并胰島素受體（insulin receptor，INSR）基因突變的家系，現(xiàn)報道如下，希望為該類患者的診治提供新思路。

1 病例資料

患者（先證者）為女性，42 歲，18 年前孕期產檢時發(fā)現(xiàn)血糖升高，產后復查血糖仍高，糖耐量試驗檢查后診斷為“糖尿病”，予二甲雙胍控制血糖。2年前患者因肢體麻木住院時調整為門冬胰島素、二甲雙胍及阿卡波糖治療，監(jiān)測血糖控制欠佳?；颊邽樽阍骂^位順產，出生時身長50 cm，體重3.8 kg，母親無糖尿病病史。既往有“慢性乙型肝炎”病史。家族史：祖母、父親及兄弟3 人，患者及兄弟姐妹4 人和兒子均患有“糖尿病”。體格檢查：身高161 cm，體重61 kg，體重指數(shù)（body mass index，BMI）23.53 kg/m2，血壓130/82 mmHg，正常體型，頸部及腋下未見黑棘皮。查糖化血紅蛋白為10.9%，糖尿病自身抗體均為陰性，胰島功能檢查結果見表1，胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）為空腹血糖×空腹胰島素/22.5，其中空腹血糖單位為mmol/L，空腹胰島素的單位為U/mL，22.5為校正因子，該患者的HOMA-IR為3.40。

患者的姐姐在23歲因胰腺炎住院時確診為“糖尿病”，正常體型，胰島素抵抗明顯，頸部可見黑棘皮（圖1），懷孕期間每日胰島素最大用量接近200 U，有高雄激素血癥病史，多次因血糖控制不佳調整降糖方案。2018年12月因血糖控制不佳再次住院，查糖化血紅蛋白為12.0%，糖尿病自身抗體均為陰性，門冬胰島素及甘精胰島素合計用量為77 U，同時服用阿卡波糖片（100 mg，每日3次）和格列美脲片（2 mg，每日1次），血糖控制基本達標，胰島功能檢查結果見表1，HOMA-IR為3.64。

圖1 患者姐姐背部黑棘皮照片

患者的弟弟自幼飲食不控制，活動量少，體型肥胖，36 歲時因糖尿病性酮癥酸中毒住院，無高雄激素血癥病史，頸部未見黑棘皮，其降糖方案包括利格列?。? mg，每日1 次）、阿卡波糖片（50 mg，每日3次）、門冬胰島素（早12 U、中12 U、晚10 U）及甘精胰島素（22 U），查糖化血紅蛋白為13.3%，糖尿病自身抗體均為陰性，胰島功能檢查結果見表1，HOMA-IR為0.76。

患者的妹妹因腦梗死住院時確診為“糖尿病”，目前口服降糖藥物治療，血糖控制一般。此外患者的兒子21 歲，已確診為“糖尿病”，但尚未正規(guī)治療?；颊叩母赣H和伯伯等均在20 歲左右時發(fā)現(xiàn)糖尿病。該家系成員糖尿病發(fā)病早，考慮不排除特殊類型糖尿病可能，為此征得患者及家屬同意后，對患者及其家系成員的所有已知單基因遺傳病相關基因（包括全部外顯子，已報道的所有內含子、啟動子位點）進行檢測。

抽取患者及其家系成員外周血2 mL，提取DNA。利用捕獲芯片將目標區(qū)域的DNA 片段進行富集后再借助高通量二代測序平臺進行測序，采用靶向捕獲測序。將原始測序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA 軟件將過濾后的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫人類基因組參考序列（hg19）比對，利用GATK軟件分析得出單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）和插入缺失突變（insertion deletion mutation，INDEL）的相關信息。然后通過ANNOVAR軟件對所有的SNP 和INDEL 進行注釋。利用PCR和Sanger 測序驗證經過分析篩選得到的變異位點。利用Primer 3.0 在線軟件設計PCR 引物。PCR 產物經過Sanger 測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer上進行分析。再在家系成員中進行共分離驗證。最后通過生物信息學蛋白功能預測軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL對突變基因位點的致病性進行預測［1］。突變基因的篩選標準：在軟件篩選基礎上根據(jù)有無糖尿病病史，最后挑選出研究的基因。

基因檢測結果發(fā)現(xiàn)患者家系中有兩個位點的基因發(fā)生雜合突變，包括INSR基因（IVS7+/-5C＞T，即c.1610+5G＞A）和MTNR1B 基因（c.457C＞T，p.R153W）（圖2），未發(fā)現(xiàn)其他符合臨床表型的突變基因。INSR 基因位于chr19-7167974，突變位于外顯子前后5個堿基處，即7號內含子上第5個堿基由C 突變?yōu)門，該突變發(fā)生在內含子，會引起mRNA 剪接突變，可能會保留內含子或缺失外顯子，導致翻譯的多肽鏈發(fā)生改變，是否影響蛋白的剪切需要動物模型實驗進行驗證，蛋白功能預測軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL的預測結果均為未知（表2）。另一個突變基因為MTNR1B 基因，其位于chr11-92714846，該編碼區(qū)域的第457 號核苷酸中的胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，導致合成的氨基酸發(fā)生改變（第153 號氨基酸由精氨酸變異為色氨酸），為錯義突變，根據(jù)ACMG指南，初步判定該突變?yōu)榕R床意義未明，蛋白功能預測軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL的預測結果分別為有害、有害、良性（表2）。該患者家系圖（圖3）及基因突變位點的驗證結果如下（表3）。

圖2 INSR與MTNR1B基因突變位點測序結果

圖3 患者家系圖

表2 生物信息學蛋白功能預測軟件分析結果

表3 患者家系基因檢測報告匯總表

2 討論

糖尿病及其相關并發(fā)癥是全球疾病死亡的主要原因之一，2015—2017年我國18歲及以上人群的糖尿病患病率為11.2%［2］。國際糖尿病聯(lián)合會估計，到2035 年，將有5.92 億人患糖尿病。糖尿病的發(fā)病機制復雜，其發(fā)病與環(huán)境、遺傳等多種因素相關。不管1型糖尿病還是2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），均存在明顯的遺傳異質性。迄今為止，T2DM的致病機制仍不清楚。然而，越來越多的證據(jù)顯示T2DM 的發(fā)病機制與遺傳變異相關，其中胰島素的信號轉導和分泌途徑相關基因之間的相互作用在個體對T2DM的易感性方面發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有的降糖藥物均有一定不良反應，因此發(fā)現(xiàn)一種可以有效幫助糖尿病管理的新型生物分子至關重要。

褪黑素是一種負責調節(jié)晝夜節(jié)律的激素，由哺乳動物和人類的松果體產生，分布于各靶器官和組織，研究顯示其可通過影響晝夜節(jié)律來影響葡萄糖代謝［3］。褪黑素受體（melatonin receptor，MTNR）分為MTNR1和MTNR2兩個亞型，主要分布于海馬、下丘腦、視網膜等部位。MTNR1B基因編碼的MTNR1B是褪黑激素受體家族的成員，其可在許多組織中表達，包括胰島［4］，褪黑素通過MTNR1B和下游的Raf-1/ERK信號通路對胰島素基因轉錄發(fā)揮作用［5］。研究顯示小鼠體內MTNR1缺失時，其糖代謝能力降低，推測激活MTNR1 能夠促進葡萄糖的代謝能力，從而改善胰島素抵抗，維持機體血糖穩(wěn)態(tài)［6］。另有研究表明MTNR激動劑提高經棕櫚酸處理過的脂肪細胞脂聯(lián)素、脂聯(lián)素受體1的表達，激活AMPK氧化應激通路，提高經棕櫚酸處理過的脂肪細胞糖代謝能力，從而改善胰島素抵抗，降低血糖。已有研究發(fā)現(xiàn)MTNR1B rs10830963 位點基因多態(tài)性與早期胰島素反應缺陷和β細胞葡萄糖敏感性降低有關。全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)MTNR1B 的遺傳變異在調節(jié)空腹血糖水平和影響T2DM發(fā)病風險中發(fā)揮了重要作用，特別是由MTNR1B 調控的MTNR2，經鑒定MTNR2 功能喪失與T2DM 有關［7］。因此，研究認為褪黑素和MTNR1B 的遺傳變異與T2DM 易感性有關［8］。褪黑素在動植物、真菌、細菌體內皆可發(fā)現(xiàn)，許多降糖中藥（如黃芩、大黃、麥冬、連翹）中含有褪黑素成分，其中黃芩中的褪黑素含量高達0.7%，具有潛在的降血糖作用，為降糖藥物研發(fā)提供參考。

INSR是一種細胞表面糖蛋白，屬于酪氨酸激酶家族的受體，成熟的INSR由2個α亞單位和2個β亞單位組成，胰島素通過與膜外的α亞單位結合，將信息通過跨膜的β亞單位傳遞至細胞膜內，引起受體及其底物發(fā)生一系列磷酸化反應，從而介導INSR生物效應的發(fā)揮。T2DM的發(fā)生與胰島素分泌不足及胰島素抵抗有關。胰島素發(fā)揮作用必需由INSR 介導，因此INSR的數(shù)目及功能缺陷均會導致胰島素抵抗的發(fā)生。研究顯示INSR 基因突變通過以下幾個方面引起胰島素抵抗的發(fā)生：①抑制受體的生物合成，最常見的是形成成熟前鏈終止密碼，使受體結構不完整；②INSR受體基因突變使受體向膜的轉運發(fā)生障礙，導致細胞膜表面受體數(shù)目減少；③降低受體與胰島素的親和力；④抑制受體酪氨酸激酶活性；⑤加速受體降解［9］。

目前臨床上與INSR基因相關的疾病有：①家族性高胰島素血癥性低血糖癥5 型，也稱為先天性高胰島素血癥、胰島細胞增生癥和嬰兒持續(xù)性高胰島素低血糖癥，其特點為嬰兒期持續(xù)低血糖，該病主要是由于血糖水平低下對胰島素分泌形成負反饋調節(jié)所致［10］；②松果體增生、胰島素抵抗性糖尿病伴體細胞異常，又稱為Rabson-Mendenhall 綜合征，本病屬于一組極端胰島素抵抗綜合征（其中還包括矮妖精貌綜合征、脂營養(yǎng)不良以及A 型和B 型胰島素抵抗綜合征），它是一種發(fā)病率未知的罕見??；③胰島素抵抗性糖尿病伴黑棘皮癥，主要表現(xiàn)是嚴重的胰島素抵抗、黑棘皮病和青春期女性患者的卵巢雄激素過多，女性患者經常表現(xiàn)為多毛癥、痤瘡、閉經或月經稀發(fā)和男性化。與MTNR1B 基因相關的疾病則為非胰島素依賴性糖尿病，通常在兒童期或成年早期發(fā)?。ㄒ话阍?5歲之前），主要表現(xiàn)為發(fā)病初期胰島素分泌缺陷和胰島素依賴，臨床表現(xiàn)為胰島素抵抗和T2DM。

對該家系成員進行基因檢測，結果顯示家系中存在2 個突變的基因位點，包括位于chr19-7167974的INSR 基因（c.1610+5G＞A）和chr11-92714846 的MTNR1B 基因（c.457C＞T）。從患者及其家系位點驗證報告可知，家系中已確診的糖尿病患者中，除患者的弟弟2 個位點均未發(fā)現(xiàn)突變，妹妹僅MTNR1B 基因存在突變外，其余糖尿病患者均存在2個位點的突變。已有文獻報道MTNR1B基因多態(tài)性與胰島素受體底物（insulin receptor substrate 2，IRS2）基因變異相互作用，影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)［11］。該家系中先證者的弟弟無上述2 個基因位點的突變，糖尿病自身抗體為陰性，結合其自幼飲食不控制、體型肥胖，T2DM可能大，檢查也提示其胰島素抵抗指數(shù)較其他存在基因突變者低，這些基因表型上的區(qū)別值得研究和隨訪。

研究發(fā)現(xiàn)MTNR 基因與胰島素敏感性、糖尿病和代謝綜合征有關，提示MTNR 基因可能是多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）的候選基因［12］。Shabani 等［13］發(fā)現(xiàn)給PCOS 患者補充褪黑素可明顯降低HOMA-IR，并明顯提高定量胰島素敏感性指數(shù)。此外，多個研究提示褪黑素和MTNR1B的遺傳變異與T2DM胰島素抵抗也密切相關。分析該家系臨床特點發(fā)現(xiàn)，INSR和MTNR1B基因未發(fā)生突變或僅存在MTNR1B 基因突變者胰島素抵抗相對較輕，而2 個位點均突變者存在更嚴重的胰島素抵抗，INSR基因的這一突變位點尚無報道，是新發(fā)現(xiàn)的突變位點，值得臨床關注?；颊呓憬愕腍OMA-IR為3.64，胰島素抵抗明顯，考慮可能與其INSR 和MTNR1B基因均存在突變有關。研究顯示許多中藥（如麥冬等）含有褪黑素成分，有潛在的降血糖作用，參芪降糖顆粒聯(lián)合利拉魯肽治療胰島素控制效果不佳的T2DM患者療效顯著［14］。文獻報道，MTNR1B SNP 與IRS2 基因變異相互作用，與心外膜脂肪組織的數(shù)量相關，并影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)和血脂譜，從而影響心臟代謝風險［11］。岳穎等［15］研究顯示，MTNR激動劑Neu-p11 可改善由線粒體融合蛋白2 介導的T2DM 大鼠的胰島素抵抗、糖代謝異常及肝糖代謝酶mRNA 異常表達，達到保護肝臟、治療糖尿病的作用。推測以MTNR 和INSR 為靶點的藥物將成為以后的研究方向。

對于該家系來說，家系成員發(fā)病年齡早，大多數(shù)在25歲之前，有明顯的家族遺傳傾向。根據(jù)該家系特點考慮為常染色體顯性遺傳，部分家系成員目前尚未診斷為糖尿病，但不能排除他們以后不會發(fā)病，建議定期監(jiān)測血糖變化。研究顯示存在INSR和MTNR1B 基因突變者的胰島素抵抗明顯，無基因突變者胰島素抵抗較輕，患者妹妹僅存在MTNR1B基因突變，考慮MTNR1B基因為其致病的主效基因可能大，蛋白功能預測軟件SIFT、PolyPhen-2、REVEL分析MTNR1B 基因突變位點結果分別為有害、有害、良性，與臨床表現(xiàn)相符。但INSR 基因突變位點的蛋白功能預測分析提示為未知，INSR基因突變是否與患者的發(fā)病有關，以及INSR和MTNR1B基因是否存在相互影響，仍需對子代其他人員觀察隨訪后進一步探討。

基因檢測技術的發(fā)展為精準醫(yī)療奠定了基礎。臨床上對于治療效果差的患者，要積極尋找病因，從基因層面進行疾病的診斷，從而為患者選擇最佳的治療方案。相信隨著醫(yī)學的不斷進步，越來越多的糖尿病致病基因會被發(fā)現(xiàn)，從而為攻克糖尿病創(chuàng)造條件。