鄭建月,張杰,曾健勇,3,王華玲,4,李會(huì)平,4

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北 保定 071000;2山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,山西 晉中 030600;3河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071000;4河北省城市森林健康技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071000)

桑天牛又名粒肩天牛、桑褐天牛,屬鞘翅目天?？茰厦勌炫喛?是楊樹、構(gòu)樹、桑樹、蘋果等多種林木的主要蛀干害蟲,幼蟲成蟲都能對(duì)林木造成危害,嚴(yán)重威脅著林、果、蠶業(yè)的發(fā)展[1]。為了尋求有效的防治桑天牛方法,國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了大量研究并取得了顯著成果。蘇筱雨等總結(jié)多年研究成果,提出了一套桑天牛無(wú)公害控制技術(shù):應(yīng)用桑天牛卵長(zhǎng)尾嚙小蜂、白僵菌、滅幼脲和樹種抗性等綜合作用來(lái)防治不同時(shí)期的桑天牛[2]。隨著技術(shù)的發(fā)展,關(guān)于腸道微生物的研究逐漸深入,學(xué)者們認(rèn)為通過改良操縱昆蟲腸道細(xì)菌實(shí)現(xiàn)害蟲的防治是一個(gè)全新的視角[3]。

在協(xié)同進(jìn)化過程中,昆蟲體內(nèi)形成了與宿主昆蟲生命活動(dòng)緊密相關(guān)的復(fù)雜的功能微生物群落[4]。這些微生物可以協(xié)助宿主昆蟲消化,為宿主提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),可以協(xié)助宿主昆蟲降解有毒化合物,使宿主具有更強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力[5-6]。但昆蟲腸道微生物的多樣性受到腸道特殊結(jié)構(gòu)、昆蟲性別、發(fā)育齡期等多種因素影響,即使是同一目的昆蟲也具有不同的優(yōu)勢(shì)菌門及菌屬[7]。受發(fā)育齡期影響,甜菜夜蛾幼蟲腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬會(huì)隨宿主齡期發(fā)生變化;其中不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度隨宿主齡期的變化出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),在第 5 齡時(shí)相對(duì)豐度最大;而噬氫菌屬和噬酸菌屬的相對(duì)豐度則隨著宿主的齡期變化呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)[8]。在梨小食心蟲中則表現(xiàn)為早期幼蟲(1 齡和2 齡)的細(xì)菌多樣性顯著高于末期幼蟲(3 齡至5 齡);與末期幼蟲相比,雄性蛹和成蟲的細(xì)菌豐富度再次增加[9]。因此,發(fā)育齡期對(duì)昆蟲微生物多樣性具有很大影響,并且不同菌種在不同昆蟲中會(huì)呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。在先前關(guān)于桑天牛的研究中并未關(guān)注這一現(xiàn)象。

目前關(guān)于桑天牛腸道微生物的研究主要集中在其生活史的某一發(fā)育階段(成蟲或幼蟲),但對(duì)不同發(fā)育階段菌群組成及多樣性變化的研究還未見報(bào)道。因此本研究利用 16S rRNA 技術(shù)對(duì)桑天牛不同發(fā)育階段(卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲、雌雄成蟲)的細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了探究,旨在明確桑天牛不同發(fā)育階段的細(xì)菌群落組成,探究共生微生物在桑天牛生長(zhǎng)中的重要作用,為通過生物途徑防治桑天牛奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

成蟲:采集自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園(河北保定),寄主植物為桑樹。

卵:將野外采集的成蟲帶回室內(nèi)養(yǎng)蟲籠中飼養(yǎng),以1年生細(xì)嫩桑枝補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),另放入標(biāo)本園內(nèi)采集的 2～3 年生(直徑 1～3 cm)毛白楊枝條用于產(chǎn)卵,1 周后自產(chǎn)卵枝條中將卵取出[10]。

初孵幼蟲:自枝條中取出的卵放在含有濕潤(rùn)濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中讓其孵化,隨時(shí)觀察,獲得初孵幼蟲。

老熟幼蟲:采集自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園,寄主植物為毛白楊。

1.2 材料前期處理

將采集的桑天牛初孵幼蟲、老熟幼蟲、雌雄成蟲饑餓處理48 h。然后將雌雄成蟲、幼蟲以及卵的樣本在75%乙醇中浸泡3 min,然后用無(wú)菌水沖洗3遍,最后在超凈工作臺(tái)內(nèi)用解剖鏡及高溫滅菌的鑷子解剖幼蟲及成蟲,取出其整條腸道。將卵和解剖獲得的腸道轉(zhuǎn)移至含100 μL PBS 緩沖液的 2 mL 離心管中,用液氮速凍后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱保存?zhèn)溆肹11]。每個(gè)樣本保留4個(gè)重復(fù)。

1.3 細(xì)菌16S rRNA 測(cè)序

使用糞便DNA提取試劑盒(QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit)提取腸道內(nèi)容物總DNA。并用引物341 F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806 R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)如下:PCR master mix(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)25 μL,上下游引物各2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,55℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,共30個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min,4 ℃終止反應(yīng)。采用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳,用凝膠提取試劑盒(QIAquick Gel Extraction kit)(QIAGEN) 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。構(gòu)建好的文庫(kù)使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序[13]。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與OTU注釋

通過PE reads重疊關(guān)系,將配對(duì)后的reads以最小重疊長(zhǎng)度為10 bp的標(biāo)準(zhǔn)合并為1個(gè)序列,最大允許錯(cuò)配比為20%。通過barcode分辨樣本barcode錯(cuò)配允許個(gè)數(shù)為0,引物錯(cuò)配允許個(gè)數(shù)為2。用Usearch軟件在97 %的相似性水平上對(duì)序列進(jìn)行OUT聚類。并利用UCHIME來(lái)識(shí)別和移除嵌合物去除嵌合體,根據(jù)Silva分類數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類注釋[14]。

1.5 細(xì)菌多樣性分析

通過 Mothur (v.1.21.1)軟件分析獲得多樣性指數(shù)、Rank-Abundance曲線、物種累積曲線,并利用 R 語(yǔ)言工具包制作成圖[15]。本研究統(tǒng)計(jì)的多樣性指數(shù)有Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、ACE指數(shù)、測(cè)序深度指數(shù)和均勻度指數(shù)。采用維恩圖(Venn)展示桑天牛細(xì)菌樣本共有及特有OTU。利用 R 語(yǔ)言工具繪制樣本聚類樹與柱狀圖。使用R語(yǔ)言PCoA分析和vegan軟件包進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)分析和基于Beta多樣性距離的非度量多維尺度分析(NMDS)。通過FAPROTAX軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑天牛不同發(fā)育階段細(xì)菌OUT聚類分析

本試驗(yàn)中共有 20 個(gè)樣品,分為卵(E)、初孵幼蟲(NL)、老熟幼蟲(ML)、雌成蟲(FA)與雄成蟲(MA)5個(gè)組,每組 4 個(gè)重復(fù)。測(cè)序文庫(kù)共獲得1 536 330條序列,其中有效序列有1 533 509條,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生28 916條,平均產(chǎn)生51 211條,平均序列長(zhǎng)度為423.89 bp。結(jié)果顯示測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,可以用作后續(xù)分析。

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段的物種累積曲線和Rank-Abundance曲線見圖1。

(a) (b)圖1 桑天牛不同發(fā)育階段的物種累積曲線和Rank-Abundance曲線Figure 1 Species accumulation curves and Rank-Abundance curves in different developmental stages of Apriona germari注:E代表卵;NL代表初孵幼蟲;ML代表老熟幼蟲;FA代表雌成蟲;MA代表雄成蟲。

由圖1可知,隨樣本量增大,物質(zhì)積累曲線逐漸趨于平緩,說(shuō)明抽樣數(shù)據(jù)足夠充分,可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(圖1a)。初孵幼蟲Rank-Abundance曲線水平方向跨度較大,垂直方向上平滑程度小(圖1 b),說(shuō)明桑天牛初孵幼蟲時(shí)期腸道菌群組成比較豐富,但物種分布的均勻度較低。其余發(fā)育階段樣品在水平方向跨度較小,說(shuō)明豐富度相對(duì)較低,均勻度相對(duì)較高。

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段腸道組間OUT情況統(tǒng)計(jì)見圖2。

圖2 桑天牛不同發(fā)育階段腸道組間的共有以及特有OTUsFigure 2 Common and specific OTUs in different developmental stages of Apriona germari

由圖2可知,桑天牛在卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲、雌性成蟲和雄性成蟲中共有的細(xì)菌OTU僅為1個(gè),而卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲、雌雄成蟲特有OTUs分別為33、400、6、14和16個(gè)。說(shuō)明桑天牛的不同發(fā)育階段的腸道細(xì)菌的種類有很大的差異。卵與初孵幼蟲共有OTUs為3個(gè),初孵幼蟲與老熟幼蟲共有OTUs為13個(gè),雌雄成蟲共有OTUs為33個(gè)。卵與雌雄成蟲共有OTUs為18個(gè)。因此,桑天牛雌雄成蟲細(xì)菌OTU相似度較高,其次為卵與雌雄成蟲和初孵幼蟲與老熟幼蟲。

2.2 桑天牛不同發(fā)育階段細(xì)菌Alpha多樣性分析

關(guān)于桑天牛腸道菌群的Alpha多樣性分析見表1。

表1 不同發(fā)育階段桑天牛腸道菌群的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果及Alpha多樣性分析Table 1 Reads number and Alpha diversity index statistics in different developmental stages of Apriona germari

由表1可知,測(cè)序深度指數(shù)coverage表明每個(gè)樣本的覆蓋率都達(dá)到99.84%以上,說(shuō)明可檢測(cè)出大多數(shù)物種,能客觀反映各樣本物種信息。桑天牛在初孵幼蟲階段的微生物Chao1 、Shannon、ACE指數(shù)明顯高于其他發(fā)育階段,其次為卵和老熟幼蟲階段,而Simpson指數(shù)明顯小于其他發(fā)育階段,表明桑天牛初孵幼蟲階段的細(xì)菌多樣性高于桑天牛卵期、老熟幼蟲、雌雄成蟲3個(gè)階段。

2.3 不同發(fā)育階段細(xì)菌Beta多樣性分析

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段的Beta多樣性分析見圖3。

(a) PCOA分析圖 (b)NMDS分析圖圖3 桑天牛不同發(fā)育階段的PCoA 分析圖與NMDS分析圖Figure 3 PCoA and NMDS plots of bacterial communities in different developmental stages of Apriona germari注:E代表卵;NL代表初孵幼蟲;ML代表老熟幼蟲;FA代表雌成蟲;MA代表雄成蟲。

圖3的PCoA與NMDS分析結(jié)果顯示,桑天牛的雌雄成蟲菌群有交疊在一起的現(xiàn)象,卵期、初孵幼蟲期、與老熟幼蟲期沒有交互現(xiàn)象,說(shuō)明桑天牛雌雄成蟲的細(xì)菌群落結(jié)果較為相似,與其他 3 個(gè)發(fā)育階段間相互存在差異。

2.4 桑天牛不同發(fā)育階段細(xì)菌組成分析

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段不同分類階元統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 桑天牛不同發(fā)育階段在不同分類階元的組成數(shù)目統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics on the number of components at each classification level in different developmental stages of Apriona germari

本研究共注釋到26門46綱91目144科269屬238種桑天牛細(xì)菌。由表2可知,在門與綱水平組成數(shù)目相同,從目到種水平出現(xiàn)差異,其中初孵幼蟲階段的注釋數(shù)目最多,明顯高于其他發(fā)育階段。

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段樣本聚類情況見圖4。

圖4 桑天牛不同發(fā)育階段樣本聚類樹與柱狀圖組合分析圖(門水平)Figure 4 Microbial community barplot and sample cluster tree in different developmental stages of Apriona germari(Phylum level)注:Egg代表卵;Newly hatched larvae代表初孵幼蟲;Mature larvae代表老熟幼蟲;Female adults代表雌成蟲;Male adults代表雄成蟲。

由圖4可知,桑天牛初孵幼蟲與老熟幼蟲樣本聚類成簇,卵與雌雄成蟲聚類成簇,說(shuō)明初孵幼蟲與老熟幼蟲相似度較高,而卵與雌雄成蟲相似度較高。

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段腸道中幾種主要菌門的豐度差異見表3。

表3 桑天牛不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌主要菌門差異性分析Table 3 Difference analysis of main bacterial phyla of gut bacteria in different developmental stages of Apriona germari

在門分類水平共注釋到了放線菌門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、疣微桿菌門、酸桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、脫硫桿菌門、彎曲桿菌門、梭菌門等26個(gè)門。不同發(fā)育階段的優(yōu)勢(shì)菌門有所不同(圖3)。卵期的優(yōu)勢(shì)菌門為放線菌門(64.78%)、次優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(31.02%),其次為擬桿菌門(2.07%)。初孵幼蟲階段的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(38.40%),其次為變形菌門(25.31%)、擬桿菌門(24.91%)、疣微桿菌門(9.16%)。在老熟幼蟲階段,變形菌門(93.47%)為優(yōu)勢(shì)菌門,其次為厚壁菌門(3.50%)和擬桿菌門(2.89%)。在雌雄成蟲階段優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門(86.46%、86.35%),次優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(10.00%、10.22%)。桑天牛在不同發(fā)育階段具有不同的優(yōu)勢(shì)菌門,相對(duì)豐度也有所差異,但厚壁菌門和變形菌門幾乎存在于桑天牛的各個(gè)發(fā)育階段。變形菌門在卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲3個(gè)階段中豐度較高,其中老熟幼蟲期占比顯著高于卵期其他發(fā)育階段。而厚壁菌門在初孵幼蟲、雌雄成蟲2個(gè)階段豐度都較高,其中雌雄成蟲期占比最高。初孵幼蟲時(shí)期的疣微桿菌門明顯高于其他階段,放線菌門卵時(shí)期明顯高于其他階段。

關(guān)于屬水平桑天牛不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌的組成見圖5。

圖5 桑天牛不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌的組成(屬水平)Figure 5 Composition of bacterial communities in different developmental stages of Apriona germari(Genus level)注:E代表卵;NL代表初孵幼蟲;ML代表老熟幼蟲;FA代表雌成蟲;MA代表雄成蟲。

在屬水平,共注釋到269屬細(xì)菌。桑天牛卵期的細(xì)菌主要包括紅球菌屬(60.23%)、假單胞菌屬(8.33%)、腸桿菌屬(6.19%)、Massilia(4.11%)、慢生根瘤菌屬(2.76%)、Corynebacteriales(2.73%)、Methylovirgula(1.97%)和不動(dòng)桿菌(1.93%)等。初孵幼蟲細(xì)菌組成為科未知屬(12.43%)、Akkermansia(9.15%)、Lachnospiraceae NK4A136 group(8.69%)、不動(dòng)桿菌屬(7.89%)、檸檬酸細(xì)菌屬(5.20%)、埃希氏志賀氏菌菌屬(4.28%)、擬桿菌屬(3.41%)、瘤胃球菌屬(3.35%)、腸球菌屬(2.76%)、金黃桿菌屬 (2.62%)、Gibbsiella(2.47%)、普氏菌屬 (1.89%)、乳桿菌屬 (1.64%)和假單胞菌屬(1.35%)等,其種類比較豐富,但豐度都相對(duì)較低。在老熟幼蟲中為Gibbsiella(77.94%)、腸桿菌屬(6.35%)、不動(dòng)桿菌屬(4.76%)、鞘氨醇桿菌屬(1.82%)、檸檬酸細(xì)菌屬(1.54%)和腸球菌屬(1.38%)等。雌雄成蟲的優(yōu)勢(shì)菌均為乳球菌屬,占比分別為75.15%、85.14%。但其次優(yōu)勢(shì)菌屬不相同,雌成蟲的次優(yōu)勢(shì)菌屬為腸球菌屬(10.25%)、Gibbsiella(5.62%)和慢生根瘤菌屬 (1.32%)。雄成蟲的次優(yōu)勢(shì)菌屬為慢生根瘤菌屬(3.25%)和Methylovirgula(2.38%)。假單胞菌屬在卵期、初孵幼蟲期均存在,并且占比有減少趨勢(shì)。不動(dòng)桿菌屬在卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲3個(gè)階段均存在,占比先升高后降低。檸檬酸細(xì)菌屬同時(shí)存在于初孵和老熟2幼蟲階段,有降低趨勢(shì)。腸球菌屬在初孵幼蟲、老熟幼蟲與雌成蟲腸道內(nèi)均存在,在雌成蟲中占比較高。Gibbsiella在初孵幼蟲、老熟幼蟲與雌成蟲腸道內(nèi)均存在,占比有先升高后降低趨勢(shì)。Methylovirgula存在于卵與雄成蟲,二者占比相似。

2.5 細(xì)菌功能預(yù)測(cè)

關(guān)于桑天牛不同發(fā)育階段腸道細(xì)菌菌群功能預(yù)測(cè)結(jié)果見圖6。

圖6功能預(yù)測(cè)結(jié)果表明,化學(xué)異養(yǎng)、發(fā)酵及好氧性化學(xué)異養(yǎng)在桑天牛各個(gè)發(fā)育階段的占比都比較豐富。除此之外,硝酸鹽呼吸、動(dòng)植物及人類病原體、動(dòng)物腸道等也幾乎存在于桑天牛各個(gè)階段。甲醇氧化、甲基營(yíng)養(yǎng)、錳氧化、硝酸鹽還原、尿素分解、芳香烴降解、芳香族化合物降解、脂肪族非甲烷烴降解、烴降解、木質(zhì)素分解、塑料降解、暗硫化物氧化、暗硫代硫酸鹽氧化等功能在桑天牛卵期較為明顯,其中甲醇氧化與甲基營(yíng)養(yǎng)還存在于雄成蟲內(nèi),芳香烴降解存在于雌成蟲內(nèi),芳香族化合物降解存在于老熟幼蟲。氮呼吸、亞硝酸氨化、延胡索酸呼吸、硫酸呼吸、硫化合物呼吸、纖維素水解等在初孵幼蟲中較為豐富。固氮作用在卵和雌雄成蟲階段較為明顯。參與調(diào)控需氧化能異養(yǎng)的細(xì)菌種類繁多但占比都不高,主要有不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、金黃桿菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬。化能異養(yǎng)功能受紅球菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、金黃桿菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、Akkermansia、乳桿菌屬、乳球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬等多菌屬作用。擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、Akkermansia、乳桿菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬都對(duì)發(fā)酵功能有貢獻(xiàn),其中乳球菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬占比較大。固氮作用主要受慢生根瘤菌屬影響。植物病原體主要受乳球菌屬、假單胞菌屬影響。假單胞菌屬主要控制暗硫代硫酸鹽氧化、暗硫化物氧化、錳氧化等氧化作用和木質(zhì)素分解功能。與動(dòng)物腸道相關(guān)的菌主要有腸桿菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬。與動(dòng)物寄生體或共生體相關(guān)細(xì)菌為腸桿菌屬、Massilia、普氏菌屬、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、假單胞菌屬。芳香烴降解功能由紅球菌屬和假單胞菌屬2菌屬控制。芳香族化合物降解受不動(dòng)桿菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬調(diào)控。芳香族非甲烷烴降解只受沙雷氏菌屬調(diào)控。烴降解的調(diào)控菌主要有沙雷氏菌屬、假單胞菌屬。氮呼吸、硝酸鹽呼吸和硝酸鹽還原功能主要受假單胞菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、腸桿菌屬3菌調(diào)控;在前兩個(gè)呼吸作用中3菌豐度都較低,而在還原作用中腸桿菌屬占比較高。塑料降解主要受假單胞菌屬控制。由此可見,細(xì)菌群落在桑天牛各發(fā)育階段發(fā)揮著不同的作用。

3 討論

隨著宏基因組及測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,關(guān)于桑天牛微生物的研究也更加深入,但關(guān)于不同發(fā)育階段之間菌群差異的研究還未見報(bào)道。本研究利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)桑天牛卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲、雌雄成蟲的腸道細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序探究了不同發(fā)育階段天牛細(xì)菌多樣性。由于桑天牛生活史較長(zhǎng),且本試驗(yàn)室并未完成其世代連續(xù)培養(yǎng),因此各階段材料來(lái)源并不完全一致,為減小環(huán)境因素影響,本研究盡量保持桑天牛寄主一致,室內(nèi)飼養(yǎng)天牛枝條與田間采集枝條來(lái)源一致。本研究中不同階段桑天牛由不同菌群組成,初孵幼蟲包含不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、擬桿菌屬等13個(gè)屬的細(xì)菌;而卵期有8個(gè)菌屬,老熟幼蟲有6個(gè)菌屬,雌成蟲有 4 個(gè)菌屬,雄成蟲 3 個(gè)菌屬。初孵幼蟲可能是由于剛剛破除卵殼,發(fā)育還不穩(wěn)定,因此需要種類繁多的菌群來(lái)補(bǔ)足自身發(fā)育需求,但由于本試驗(yàn)中初孵幼蟲來(lái)自于濕潤(rùn)培養(yǎng)皿而不是來(lái)自樹木,可能會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)充菌群不足,因此出現(xiàn)豐度較低的現(xiàn)象。與本研究結(jié)果相似,在草地貪夜蛾的整個(gè)生命周期中微生物多樣性會(huì)隨著發(fā)育在大階段(變態(tài))間逐步降低,但不同的是它在不同齡的幼蟲間多樣性逐步增加。草地貪夜蛾的卵期微生物多樣性最高,孵化成幼蟲后多樣性急劇下降,但其體內(nèi)微生物種類隨幼蟲發(fā)育逐漸增多,到 6 齡時(shí)多樣性最高,而成蟲期群落豐富度最低[16]。細(xì)菌豐度隨年齡逐漸減少的趨勢(shì)在其他昆蟲中也有所體現(xiàn)。大分舌蜂隨著幼蟲生長(zhǎng)階段的遞進(jìn),其腸道微生物的多樣性會(huì)出現(xiàn)逐步降低的現(xiàn)象,這可能與昆蟲進(jìn)食及腸道微生物驅(qū)動(dòng)的環(huán)境適應(yīng)有關(guān)[17]。同理,本研究中老熟幼蟲與成蟲階段可能因?yàn)榘l(fā)育更為成熟、對(duì)環(huán)境適應(yīng)力更高,已經(jīng)在桑天牛體內(nèi)形成了較為穩(wěn)定且固定的細(xì)菌群落,在不受新刺激的情況下對(duì)新菌群的需求較少,因而這2個(gè)階段腸道細(xì)菌多樣性較低且優(yōu)勢(shì)菌屬明顯。其中,老熟幼蟲中Gibbsiella屬占比達(dá)到了77.83%,乳球菌屬在雌雄成蟲中占比分別為75.76%、85.27%。由此推測(cè)乳球菌屬可能是來(lái)自昆蟲腸道內(nèi)的常駐菌屬。此外,本研究結(jié)果顯示桑天牛雌雄成蟲間、初孵與老熟2幼蟲間具有相似的細(xì)菌組成;卵期細(xì)菌OUT則更為接近雌雄成蟲,其次為初孵幼蟲。因此推測(cè)桑天牛雌雄成蟲到卵、卵到初孵幼蟲、初孵幼蟲到老熟幼蟲等相鄰的發(fā)育階段間存在垂直傳播的現(xiàn)象,具有相同的腸道菌群。如假單胞菌屬同時(shí)存在于卵期與初孵幼蟲期;檸檬酸細(xì)菌屬同時(shí)存在于初孵和老熟2幼蟲階段;不動(dòng)桿菌屬同時(shí)存在于卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲3個(gè)階段;腸球菌屬同時(shí)存在于初孵幼蟲、老熟幼蟲、雌成蟲3個(gè)階段,極有可能由初孵幼蟲到老熟幼蟲一直穩(wěn)定存在并傳播至雌成蟲。與本研究結(jié)果相似,家蠶卵與成蟲及低齡幼蟲的腸道微生物結(jié)構(gòu)類似,而高齡幼蟲間較為相似[18]。

腸道細(xì)菌是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的重要組成部分,它可以幫助昆蟲適應(yīng)生存環(huán)境,通過改造腸道細(xì)菌阻礙昆蟲發(fā)育是生物防治的新方法[3]。FAPROTAX 功能預(yù)測(cè)顯示桑天牛腸道內(nèi)大部分菌株也在不同階段表現(xiàn)出了多種作用。假單胞菌屬參與了所注釋到的大多功能,尤其是氧化降解相關(guān)功能;而假單胞菌屬在卵期與初孵幼蟲期存在,說(shuō)明這2個(gè)階段氧化與降解等代謝活動(dòng)旺盛。有報(bào)道證明,假單胞菌屬與昆蟲間存在多種相互作用,既可以是昆蟲的致病菌,通過口腔或傷口感染進(jìn)入宿主后釋放毒素或其他致病因素致使昆蟲發(fā)育遲緩、身體畸形等,最終導(dǎo)致昆蟲死亡;也可以是昆蟲體內(nèi)有益的共生微生物,在低濃度時(shí)對(duì)昆蟲生長(zhǎng)有益;其中有些菌株也可以將昆蟲作為載體,在合適的時(shí)機(jī)由昆蟲傳播到植物寄主,在此期間菌與昆蟲表現(xiàn)出中性關(guān)系[19]。在本研究中沙雷氏菌屬并不是桑天牛的主要優(yōu)勢(shì)菌屬,但也存在于桑天牛體內(nèi)并參與了多種功能的調(diào)控。傅慧靜等研究表明松褐天牛幼蟲腸道內(nèi)黏質(zhì)沙雷氏菌可通過產(chǎn)生木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶降解木質(zhì)素,且降解能力較強(qiáng)[20]。昆蟲腸道細(xì)菌生物學(xué)功能復(fù)雜多樣,通過分離培養(yǎng)獲得益生菌,對(duì)其進(jìn)行改造并發(fā)掘其應(yīng)用潛力對(duì)昆蟲資源開發(fā)和害蟲防治具有重大意義[7]。

家蠶成蟲、卵以及1-2齡幼蟲的腸道微生物結(jié)構(gòu)類似,以假單胞菌和不動(dòng)桿菌為主;高齡幼蟲(3～5 齡)之間較為相似,以甲基桿菌屬屬和鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌為主;腸球菌屬、葡萄球菌屬和微小桿菌屬細(xì)菌在各齡期內(nèi)均有存在[18]。與家蠶相似,桑天牛不同發(fā)育階段的優(yōu)勢(shì)菌屬也存在一定差異。桑天牛卵期的優(yōu)勢(shì)菌屬為紅球菌屬;雌雄成蟲的優(yōu)勢(shì)菌均為乳球菌屬;老熟幼蟲的優(yōu)勢(shì)菌屬為Gibbsiella、腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、檸檬酸桿菌屬和腸球菌屬,其中Gibbsiella的豐度最高。Gibbsiella在桑天牛初孵幼蟲、老熟幼蟲與雌成蟲腸道內(nèi)均存在且占比有先升高后降低趨勢(shì),出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于腸道內(nèi)Gibbsiella同時(shí)來(lái)源于前一階段的蟲體和取食的寄主植物:一部分菌通過垂直傳播,自幼蟲腸道至成蟲階段一直存在,但由于完全變態(tài)時(shí)腸道結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致菌群減少。已有研究顯示完全變態(tài)發(fā)育的昆蟲在成蟲階段,幼蟲的腸道會(huì)完全消失,但是有些腸道微生物可以通過隱窩結(jié)構(gòu)保留[21]。另一部分菌則來(lái)源于寄主植物的橫向傳播,幼蟲后期取食寄主植物導(dǎo)致菌占比增加。因此,本課題組通過從桑天牛不同發(fā)育階段以及不同寄主2部分出發(fā),探究了桑天牛腸道菌群的組成及變化,希望能在桑天牛生物防治中找到新的出發(fā)點(diǎn)[22]。但本試驗(yàn)也存在一些不足之處,如沒有獲得桑天牛蛹期樣本,沒有對(duì)幼蟲進(jìn)行詳細(xì)的齡期劃分,可能會(huì)導(dǎo)致研究不夠全面。

4 結(jié)論

本研究從桑天牛不同發(fā)育階段出發(fā),探究了桑天牛卵、初孵幼蟲、老熟幼蟲以及雌雄成蟲的細(xì)菌群落組成。在桑天牛不同發(fā)育階段存在著不同的優(yōu)勢(shì)菌落,但一些菌落存在于桑天牛多個(gè)發(fā)育階段,可能是桑天牛的定殖菌群,在桑天牛體內(nèi)穩(wěn)定存在;另一些則可能是通過取食寄主植物獲得過路菌群,二者均為桑天牛適應(yīng)寄主發(fā)揮作用。如卵期和初孵幼蟲期微生物種類眾多,同時(shí)各種與生命活動(dòng)相關(guān)的功能也繁多,說(shuō)明這2個(gè)階段桑天牛代謝活動(dòng)旺盛,為后期的生長(zhǎng)發(fā)育打下基礎(chǔ)。