查建棟,徐志淵,陳文琦

香港大學深圳醫(yī)院 廣東省深圳市,518053

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,嚴重威脅人類健康。食管癌在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排名第6[1-2],患者5 年總生存率僅為20 %～40 %[3]。由于腫瘤細胞具有很強的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力,需要高能量代謝來提供所需的能量。隨著腫瘤體積的增加,腫瘤不可避免地會出現(xiàn)缺氧狀態(tài)。因此,腫瘤細胞有其特定的細胞代謝機制,即以糖酵解為主的代謝模式[3-5]。如果能有效抑制癌癥細胞的糖酵解途徑,就可以有效地控制腫瘤進展。

環(huán)狀RNA (CircRNA) 來源于前體微小RNA(microRNA,mRNA) 轉(zhuǎn)錄物的反向剪接,是一類新型的非編碼內(nèi)源性RNA,具有獨特的單鏈閉環(huán),缺乏5′-3′極性和多腺苷酸化尾[6-7]。由于下一代測序和生物信息學方法的發(fā)展,已經(jīng)鑒定出更多功能的CircRNA[8]。越來越多的研究表明,CircRNAs參與許多生物學過程,如增殖、凋亡和遷移,并參與各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。

而miRNAs 也是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子,參與轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控[12]。研究表明,CircRNA 可以調(diào)控miRNAs 來調(diào)節(jié)腫瘤中的下游基因[6,13]。環(huán)狀RNA 溶血磷脂酸受體(circular RNA lysophosphatidic acid receptor 3,CircLPAR3) 在口腔鱗狀細胞癌中抑制腫瘤進展和糖酵解[14];CircUBE2Q2 通過調(diào)節(jié)細胞自噬和糖酵解促進胃癌的惡性進展[15];Circ-FOXM1 通過調(diào)節(jié)miR-143-3p/FLOT2 軸來抑制黑色素瘤的細胞凋亡,同時促進細胞增殖、侵襲和糖酵解等[16],表明CircRNA 可以通過調(diào)控miRNA來調(diào)節(jié)癌癥細胞的增殖、凋亡和糖酵解途徑存在緊密的聯(lián)系。

去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUB)是泛素依賴性蛋白質(zhì)降解途徑的關(guān)鍵成分,調(diào)節(jié)許多代謝過程,包括細胞生長、分化和細胞凋亡[17]。泛素特異性蛋白酶14 (ubiquitin-specific protease 14,USP14) 是蛋白酶體的主要調(diào)節(jié)劑,也是3 種蛋白酶體相關(guān)的DUB 之一[18]。同時有研究表明USP14 乳腺癌糖酵解存在緊密聯(lián)系[19]。故我們推測USP14 在食管癌中的作用可能與糖酵解途徑相關(guān),同時認為食管癌細胞糖酵解可能受到Circular RNA LPAR3/miR-143-5p/USP14 通路的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與分組

正常人食管上皮細胞(normal human esophageal epithelial cells,Het-1A) 和食管癌細胞系(包括TE-10、KYSE150 和TE-1 細胞),購自Procell (中國武漢)。食管癌細胞系(KYSE450) 獲自Cobioer Bioscience (中國南京)。使用含有10 %胎牛血清(FBS;Gibco,USA) 和1 %青霉素/鏈霉素(Phygene,Fzhou,China) 的Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640;Biosun,Shanghai,China)培養(yǎng)基,在37 ℃和5 % CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

細胞分組如下: Het-1A (不經(jīng)任何處理的正常人食管上皮細胞組);TE-10 組(不經(jīng)任何處理的食管癌細胞系TE-10);KYSE150 組(不經(jīng)任何處理的食管癌細胞系KYSE150);TE-1 組(不經(jīng)任何處理的食管癌細胞系TE-1);KYSE450 組(不經(jīng)任何處理的食管癌細胞系KYSE450);si-NC 組(將si-CircLPAR3-NC 轉(zhuǎn)染至KYSE450 細胞內(nèi));si-CircLPAR3 組(將si-CircLPAR3 轉(zhuǎn)染至KYSE450細胞內(nèi));si-CircLPAR3 +NC 組(將si-CircLPAR3與inhibit NC 轉(zhuǎn)染至KYSE450 細胞內(nèi));CircLPAR3 +inhi 組(將si-CircLPAR3 與miR-143-5p inhibit 轉(zhuǎn)染至KYSE450 細胞內(nèi))。其中靶向CircLPAR3 的siRNA 由RiboBio (中國廣州) 設(shè)計合成,miR-143-5p 模擬物和相應(yīng)的對照序列由GenePharma 設(shè)計和合成。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 進行細胞轉(zhuǎn)染,48 h 后用于后續(xù)實驗。

1.2 qRT-PCR 分析

根據(jù)制造商的說明,使用TRIzol 試劑(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 提取總RNA。使用NanoDrop-1000 (Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 測量RNA 濃度。然后根據(jù)制造商的建議進行cDNA 合成。簡而言之,使用ReverAid First Strand cDNA 試劑盒(Thermo Fisher Scientific) 結(jié)合CircLPAR3、miR-143-5p 和USP14的引物對RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。GAPDH 用于標準化circRNA 和線性mRNA 的相對表達水平,而U6 用于標準化miRNA 表達水平。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,使用LightCycler 480 SYBR-Green I Master 和Light-Cycler 480 實時PCR 系統(tǒng)(均來自Roche Applied Science) 檢 測CircLPAR3、miR-143-5p 和USP14 mRNA 的表達。CircLPAR3、miR-143-5p 和USP14的相對表達量由2-ΔΔCt法計算所得。相關(guān)引物序列皆由上海英拜生物科技有限公司設(shè)計合成。引物序列如表1 所示。

表1 qRT-PCR 中所用引物序列

1.3 細胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率(OCR) 測定

參見文獻[20] 的方法,使用Seahorse XF 24細胞外通量分析儀(Seahorse Bioscience) 測量細胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率 (OCR)。ECAR和OCR 分別使用Seahorse XF 糖酵解壓力測試試劑盒和Seahorse XF 細胞線粒體壓力測試試劑盒(Agilent Technologies) 進行測量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

使用RIPA 裂解緩沖液勻漿來自細胞的總蛋白質(zhì)。并且通過BCA 蛋白質(zhì)試劑 (Sangon Biotech Co.,Ltd.,China,Shanghai) 測定蛋白質(zhì)濃度。參見文獻[21] 的方法進行蛋白質(zhì)印跡分析。一抗為人HK2 (己糖激酶Ⅱ) 敲除HCT116 細胞系(ab273721,Abcam,USA,1∶1 000);二抗為抗己糖激酶Ⅱ抗體 (ab209847,Abcam,UK,1 ∶20 000)。抗β-肌動蛋白抗體用作內(nèi)參。使用Bio-Rad 數(shù)碼圖像系統(tǒng)拍照并保存分析圖片,采用Image J 軟件(National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA) 對目的條帶進行灰度值分析。

1.5 熒光素酶報告基因測定

CircLPAR3 的野生型(Wild type,WT) 和突變型(Mutant type,MUT) 質(zhì)粒以及USP14 的3′-非翻譯區(qū)(3′UTR) 由上海英拜生物科技有限公司設(shè)計合成,分別將其命名為CircLPAR3-WT,CircLPAR3-MUT,USP14-3′UTR-WT 和USP14-3′UTRMUT。野生型報告質(zhì)粒包含miR-143-5p 的結(jié)合位點,而突變型報告質(zhì)粒不包含與miR-143-5p 的結(jié)合位點。然后,根據(jù)上述方法,將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到具有miR-143-5p 模擬物或模擬物對照的KYSE150細胞中。孵育48 h 后,使用Dual-Lucy Assay Kit(Solarbio) 檢測熒光素酶活性。

1.6 統(tǒng)計學分析

本研究數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 (SPSS,Inc,Chicago,IL,USA) 和GraphPad Prism 8.01 (Graph-Pad Software Inc) 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖。連續(xù)變量的正態(tài)分布采用Kolmogorov-SmiRnov 驗證,數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗或者One-way ANOVA,事后檢驗采用Tukey’s multiple comparisons test。

2 結(jié)果

2.1 CircLPAR3 在食管癌細胞中高表達

為了確定CircLPAR3 與食管癌進展的關(guān)聯(lián),我們首先通過qRT-PCR 法分析了CircLPAR3 在正常食管細胞Het-1A 與食管癌細胞TE-10、KYSE150、TE-1 和KYSE450 中的表達。結(jié)果表明,與Het-1A組比較,TE-10、KYSE150、TE-1 和KYSE450 組中的CircLPAR3 顯著高表達(P均＜0.05,圖1A),同時qRT-PCR 的結(jié)果顯示,在所選擇的4 種食管癌細胞中,KYSE450 中CircLPAR3 的表達顯著高于其他3 組(P均＜0.05,圖1B)。

表明KYSE450 細胞系與正常食管細胞Het-1A的CircLPAR3 表達差異較大,可以用于進行后續(xù)的相關(guān)實驗。

2.2 抑制CircLPAR3 的表達能抑制食管癌細胞的糖酵解

隨后我們通過抑制CircLPAR3 表達以分析對KYSE150 細胞糖酵解行為的相應(yīng)影響。首先通過qRT-PCR 的結(jié)果確定了CircLPAR3 表達成功被抑制(圖2A)。隨后細胞外通量分析儀的分析結(jié)果與WB 的檢測結(jié)果顯示,與Het-1A 組比較,KYSE450 組中的關(guān)鍵糖酵解酶HK2 的蛋白表達水平增加,同時細胞外酸化率(ECAR) 增加,整體糖酵解耗氧率(OCR) 減少(圖2B、C、D,P均＜0.05),表明在食管癌細胞促進了糖酵解途徑。在成功抑制CircLPAR3 的表達后,與si-NC 組比較,si-CircLPAR3 組中的關(guān)鍵糖酵解酶HK2 的蛋白表達水平降低,同時細胞外酸化率(ECAR) 減少,整體糖酵解耗氧率(OCR) 增加(圖2B、C、D,P均＜0.05),表明抑制CircLPAR3 的表達能抑制食管癌細胞的糖酵解途徑。

圖2 CircLPAR3 在食管癌細胞中高表達

2.3 miR-143-5p 是CircLPAR3 的靶基因

為了進一步探究CircLPAR3 與miR-143-5p 的關(guān)系,首先通過starbase 在線數(shù)據(jù)庫 (http://starbase.sysu.edu.cn/) 預測 CircLPAR3 與 miR-143-5p 之間的結(jié)合位點(圖3A)。隨后通過雙熒光素酶測定進行驗證,結(jié)果表明: 與共轉(zhuǎn)染mimics-NC 和CircLPAR3-WT 的KYSE450 細胞比較,共轉(zhuǎn)染 mimics-miR-143-5p 和 CircLPAR3-WT 的KYSE450 細胞熒光素酶活性降低(P＜0.01),而用CircLPAR3-MUT 轉(zhuǎn)染的軟骨細胞中熒光素酶活性沒有顯著變化(圖3B)。同時,qRT-PCR 的結(jié)果表明,與Het-1A 組比較,KYSE450 組中的miR-143-5p 顯著低表達;與si-NC 組比較,si-CircLPAR3 組的miR-143-5p 表達顯著升高,表明在抑制CircLPAR3 的表達調(diào)控了miR-143-5p 的表達(圖3C)。

圖3 miR-143-5p 是CircLPAR3 的靶基因

上述結(jié)果表明,miR-143-5p 是CircLPAR3 的靶基因。

2.4 CircLPAR3 通過調(diào)控miR-143-5p 抑制食管癌細胞的糖酵解

在明確了CircLPAR3 與miR-143-5p 的靶向關(guān)系后,為探索CircLPAR3 是否通過miR-143-5p 來抑制食管癌細胞的糖酵解,我們首先通過qRTPCR 的結(jié)果確定了miR-143-5p 成功在KYSE450 完成了過表達(圖4A);隨后細胞外通量分析儀的分析結(jié)果與WB 的檢測結(jié)果顯示,與si-CircLPAR3+NC組比較,si-CircLPAR3+inhi 組的關(guān)鍵糖酵解酶HK2 的蛋白表達水平增加,同時細胞外酸化率(ECAR) 增加,整體糖酵解耗氧率(OCR) 減少(圖4B、C、D,P均＜0.05)。上述結(jié)果表明,CircLPAR3 通過調(diào)控miR-143-5p 抑制食管癌細胞的糖酵解。

圖4 CircLPAR3 通過調(diào)控miR-143-5p 抑制食管癌細胞的糖酵解

2.5 miR-143-5p 靶向抑制USP14

對miR-143-5p 調(diào)節(jié)糖酵解途徑的下游靶基因進行了研究。使用targetscan 在線數(shù)據(jù)庫 (http://www.targetscan.org/vert_ 71/) 預測USP14與miR-143-5p 之間的結(jié)合位點。隨后通過雙熒光素酶測定進行驗證,結(jié)果表明:

與共轉(zhuǎn)染mimics-NC 和USP14-WT 的KYSE450細胞比較,共轉(zhuǎn)染mimics-miR-143-5p 和USP14-WT的KYSE450 細胞熒光素酶活性降低(P＜0.01),而用USP14-MUT 轉(zhuǎn)染的軟骨細胞中熒光素酶活性沒有顯著變化(圖5B)。同時,qRT-PCR 的結(jié)果表明,與Het-1A 組比較,KYSE450 組中的USP14顯著高表達;與si-NC 組比較,si-CircLPAR3 組的USP14 表達顯著降低,表明在抑制CircLPAR3 的表達后,miR-143-5p 的高表達抑制了USP14 的表達;與si-CircLPAR3+NC 組比較,si-CircLPAR3+inhi組的的USP14 表達顯著升高,說明抑制了miR-143-5p 的表達后促進了USP14 的表達(圖5C,P均＜0.05)。上述結(jié)果表明,miR-143-5p 靶向抑制USP14。

圖5 miR-143-5p 靶向抑制USP14

3 討論

近年來,CircRNAs 已成為僅次于miRNA 和長鏈非編碼RNA 的疾病相關(guān)研究熱點。越來越多的學者開始研究CircRNA 在腫瘤中的作用,包括食管癌[22]。然而,很少有研究關(guān)注食管癌中CircRNA 的表達和功能。本研究探索了CircLPAR3 在食管癌中的可能機制,即與糖酵解相關(guān)的機制。

我們發(fā)現(xiàn)CircLPAR3 在不同食管癌細胞系中的表達明顯高于正常食管細胞,同時發(fā)現(xiàn)在KYSE450 細胞系中的表達最高。我們進一步證實了食管癌細胞中 CircLPAR3 的表達會影響KYSE450 細胞的糖酵解途徑。在KYSE450 細胞中,糖酵解途徑被激活,而抑制CircLPAR3 的表達后,KYSE450 細胞的糖酵解途徑受到了抑制,說明CircLPAR3 能夠調(diào)控食管癌細胞的糖酵解途徑。據(jù)我們所知,這項研究首次報道了CircLPAR3 在食管癌細胞中對糖酵解途徑的作用。

CircRNA 可分為外顯子CircRNA、內(nèi)含子CircRNA、外顯子-內(nèi)含子CircRNA (EIciRNA) 和基因間CircRNA[23]。其中,外顯子CircRNA 主要位于細胞質(zhì)中,是體內(nèi)最豐富的CircRNA[24]。最近的研究表明,CircRNA 分子中富含miRNA 反應(yīng)元件,可以與miRNA 競爭性結(jié)合,在細胞中發(fā)揮miRNA 海綿的作用,解除miRNA 對其靶基因的抑制,上調(diào)靶基因的表達[25]。本研究通過生物信息學分析預測、qRT-PCR 和熒光素酶測定驗證了CircRNA LPAR3 可靶向調(diào)控miR-143-5p。

大量報道表明,miR-143 在多種癌細胞中表達下調(diào),包括結(jié)直腸癌、鼻咽癌、肺癌和B 細胞惡性腫瘤[26-27]。同時有研究報道,miR-143 通過抑制糖酵解參與內(nèi)皮細胞功能障礙;miR-143-3p/miR-155-5p 通過調(diào)節(jié)多囊卵巢綜合征顆粒細胞的糖酵解來調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育不良[28];LncRNA-SARCC 通過靶向己糖激酶2 的miR-143 介導的糖酵解抑制,使骨肉瘤對順鉑敏感,這與我們的發(fā)現(xiàn)一致,miR-143-5p 能夠影響食管癌細胞的糖酵解途徑,且受到CircRNA LPAR3 的調(diào)控。隨后我們還確定了miR-143-5p 能夠靶向調(diào)控USP14 的表達,而miR-143-5p 是否通過靶向調(diào)控USP14 來影響食管癌細胞的糖酵解途徑尚不明確,我們也將在后續(xù)進行深入研究。

總之,我們報告在食管癌細胞中CircRNA LPAR3 高表達,miR-143-5p 低表達。此外,調(diào)節(jié)CircRNA LPAR3 和miR-143-5p 的表達情況均能夠影響到食管癌細胞的糖酵解途徑。這項研究為CircRNA LPAR3 和miR-143-5p 在食管鱗狀細胞癌發(fā)展中的抗癌機制提供了一個有力證據(jù)。而其下游機制仍有待確定。這些結(jié)果表明,CircRNA LPAR3和miR-143-5p 最終可能構(gòu)成食管癌細胞的有用生物標志物以及治療靶點。