梁偉華,蔣淼

上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院寶山分院) 麻醉科 上海市,200431

結(jié)直腸癌為消化道常見(jiàn)腫瘤之一[1]。由于其起病隱匿,患者就診已為中晚期,當(dāng)前手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療療效仍然不佳、預(yù)后也不理想[2]。據(jù)報(bào)道結(jié)直腸癌晚期患者的5 年生存率僅為13.1 %[3];因此,探究結(jié)直腸癌發(fā)生的致病機(jī)理,挖掘相關(guān)干預(yù)靶點(diǎn)成為臨床亟待解決的問(wèn)題。丙泊酚(Propofol) 為臨床手術(shù)常用麻醉劑。近年研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚除了具有麻醉效果外,還具備抗焦慮、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤活性[4-7]。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道丙泊酚可抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[8-10],但對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞作用報(bào)道不多。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路為結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動(dòng)信號(hào)通路。最新研究發(fā)現(xiàn)Wnt 上游抑制因子分泌卷曲相關(guān)蛋白1 (secreted frizzled-related protein 1,SFRP1) 可因Zeste 同源2 增強(qiáng)子(enhancer of Zeste homologue 2,EZH2) 介導(dǎo)的組蛋白3 甲基化修飾導(dǎo)致表觀沉默,從而活化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路[11-14]。有證據(jù)表明丙泊酚在脂肪干細(xì)胞、肺癌細(xì)胞 中可阻斷Wnt/β-catenin 信號(hào) 通路[15-16],但在結(jié)直腸癌中是否存在此效應(yīng)尚不明確。本研究擬明確丙泊酚對(duì)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用,揭示丙泊酚對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制,為丙泊酚的抗腫瘤活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620 和HT29 購(gòu)自ATCC。丙泊酚購(gòu)自Sigma Aldrich 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620 和HT29 購(gòu)自ATCC。采用含100 U/mL 青霉素、100 U/ml 鏈霉素和10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃,含5 % CO2且濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對(duì)照組(為生理鹽水)和丙泊酚組(其工作終濃為10 μg/mL)。

1.2.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)(CCK-8) 將SW620 細(xì)胞和HT29 細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,分別接種于96 孔板,每孔1 000 個(gè)細(xì)胞,將接種好的96 孔板放入培養(yǎng)箱中。待24 h 細(xì)胞貼壁后,對(duì)照組及丙泊酚組各孔內(nèi)更換對(duì)照及含丙泊酚培養(yǎng)液,并于加藥時(shí)、加藥24、48 和72 h 將10 %的CCK-8 試劑加入待檢測(cè)孔中,37 ℃孵育4 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)各孔的吸光度(A450nm)。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 于6 孔板培養(yǎng)各組細(xì)胞(1.0 ×105個(gè)/孔) 12 h,棄培養(yǎng)液,于底部劃線,除去劃痕間細(xì)胞,測(cè)量劃痕間距(d),記為d0h。培養(yǎng)48 h 后,再次測(cè)量,記為d48h。劃痕愈合率(%)=(d0h-d48h)/d0h×100 %。

(1) 工程案例一。案例引自文獻(xiàn)[9]，滑坡體為黏土和粉質(zhì)黏土為主夾雜碎石，坡體傾斜度為20°，土體重度γ=18 kN/m3，土體抗剪強(qiáng)度參數(shù)c=130 kPa，φ=15°，抗滑樁截面尺寸a=2 m，b=3 m，抗滑樁受荷段長(zhǎng)H=10.5 m。由不平衡荷載傳遞系數(shù)法計(jì)算出抗滑樁處的設(shè)計(jì)滑坡體推力為1 076.6 kN/m。

縣級(jí)思想宣傳機(jī)構(gòu)發(fā)展緩慢，更有甚者舉步維艱，公眾閱讀習(xí)慣的改變使得縣級(jí)傳統(tǒng)媒體快速流失用戶，受到新媒體猛烈的打擊。短視頻可謂是更為徹底的手機(jī)原生態(tài)產(chǎn)品，流量大規(guī)模從傳統(tǒng)媒體傾瀉般涌入短視頻，儼然已是當(dāng)今無(wú)可辯駁的事實(shí)。同時(shí)，可以預(yù)見(jiàn)的是，2020年5G大規(guī)模商用之后，用戶觀看視頻時(shí)長(zhǎng)還將大幅度上升，大概率會(huì)出現(xiàn)視頻APP使用時(shí)間多于社交通信APP的情況，而社交通信類APP也面臨視頻化和三維化的發(fā)展壓力。基于此，短視頻建設(shè)將是縣級(jí)融媒體建設(shè)不可或缺的戰(zhàn)略重鎮(zhèn)。

1.2.6 染色質(zhì)免疫沉淀-定量PCR (ChIP-qPCR) 按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,通過(guò)DNA 與蛋白質(zhì)交聯(lián)、酶處理消化染色質(zhì)為小片段、利用EZH2 及H3K27Me3 抗體將與目的蛋白相結(jié)合的DNA 片段沉淀下來(lái),再通過(guò)洗脫、解交聯(lián)及純化DNA,利用qPCR 檢測(cè)EZH2 及H3K27Me3 沉淀DNA 中靶基因的含量。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。Real-time 定量PCR 條件為: 95 ℃10 min 后,95 ℃15 s,60 ℃1 min,40 個(gè)循環(huán)。Real-time 定量PCR使用ABI 7500 儀器進(jìn)行。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct 值,以GAPDH 作為內(nèi)參照,采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)倍數(shù)變化。各引物如下: E-cadherin 正義鏈為5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′,反義鏈為 5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′;N-cadherin 正義鏈為5′-TGCGGTACAGTGTAACTGGG-3′,反義鏈為5′-GAAACCGGGCTATCTGCTCG-3′;β-catenin 正義鏈為5′-AGCTTCCAGACACGCTATCAT-3′,反義鏈為5′-CGGTACAACGAGCTGTTTCTAC-3′;c-Myc正義鏈為5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3′,反義鏈為5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′;CyclinD1正義鏈為5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′,反義鏈為5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′;SFRP1正義鏈為5′-ACGTGGGCTACAAGAAGATGG-3′,反義鏈為5′-CAGCGACACGGGTAGATGG-3′。

數(shù)據(jù)報(bào)出率：共送樣6596件，報(bào)出項(xiàng)目數(shù)91802個(gè)，未報(bào)出項(xiàng)目數(shù)542個(gè)，各元素的報(bào)出率均在97.86%～100%之間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明,丙泊酚組細(xì)胞遷移愈合面積顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),提示丙泊酚抑制細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力(圖1)。Tranwell 小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),丙泊酚組穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P＜0.01),提示丙泊酚抑制細(xì)胞侵襲能力(圖2)。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制腸癌細(xì)胞增殖

CCK-8 細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明: 腸癌細(xì)胞SW620及HT29 丙泊酚處理24 h 后,丙泊酚組增殖活性顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(表1,P＜0.0001)。

1.2.4 Transwell 小室試驗(yàn) 腸癌細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度至5 ×104個(gè)/mL 接種于Transwell小室(鋪有Matrigel 膠),下室加入正常含胎牛血清完全培養(yǎng)基700 μL,培養(yǎng)48 h 后取出小室。預(yù)冷甲醇,固定10 min,在PBS 中用棉簽刮去小室上層細(xì)胞后,進(jìn)行結(jié)晶紫染色,ddH2O 清洗。倒置顯微鏡取3 個(gè)視野,計(jì)數(shù)取均值。

表1 丙泊酚組和對(duì)照組細(xì)胞增殖活性(A450nm) 的比較(n=6)

2.2 丙泊酚抑制腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件比較不同組別間的差異,2 組獨(dú)立樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。取P＜0.05 為假設(shè)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 對(duì)照組與丙泊酚組腸癌細(xì)胞劃痕愈合能力比較(×100)

圖2 對(duì)照組與丙泊酚組腸癌細(xì)胞侵襲能力比較(×200)

2.3 丙泊酚抑制腸癌細(xì)胞Wnt 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)

隨著時(shí)代的發(fā)展，馬克思主義思想中的生態(tài)哲學(xué)愈來(lái)愈得到人們的重視。曾繁仁的生態(tài)美學(xué)思想就是繼承發(fā)展了馬克思恩格斯唯物實(shí)踐存在論中的生態(tài)理論。通過(guò)對(duì)馬克思恩格斯創(chuàng)立的實(shí)踐觀的研究，證明了其是一種富有革命精神的生態(tài)人文主義，具有濃郁的生態(tài)內(nèi)涵，因此我們把它作為現(xiàn)階段建設(shè)生態(tài)觀和生態(tài)審美觀的理論基礎(chǔ)是完全可行的。

圖3 對(duì)照組及丙泊酚組Wnt 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)比較

表2 對(duì)照組及丙泊酚組Wnt 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)比較(n=3)

2.4 丙泊酚減弱EZH2 對(duì)SFRP1 抑制效應(yīng)

利用ChIP-qPCR 方法,我們檢測(cè)了對(duì)照組細(xì)胞和丙泊酚組細(xì)胞中,EZH2、H3K27Me3 于SFRP1 啟動(dòng)子富集程度的變化。如表3 所示,丙泊酚組SW620 及HT29 細(xì)胞的EZH2、H3K27Me3 在SFRP1 啟動(dòng)子富集程度顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P＜0.01),上述結(jié)果提示EZH2 對(duì)SFRP1 轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱。

我們利用qPCR 檢測(cè)對(duì)照組及丙泊酚組細(xì)胞Wnt 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)變化,如表2、圖3 所示,丙泊酚組腸癌細(xì)胞較對(duì)照組,E-cadherin 顯著上調(diào)(P＜0.0001),而N-cadherin 表達(dá)減低(P＜0.0001),提示丙泊酚促進(jìn)了腸癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。同時(shí),Wnt 信號(hào)通路靶基因β-catenin、c-Myc及CyclinD1 與對(duì)照組比較明顯下調(diào) (P＜0.0001)。Wnt 信號(hào)通路上的抑制因子SFRP1 表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.0001)。

表3 對(duì)照組及丙泊酚組EZH2、H3K27Me3 在SFRP1 啟動(dòng)子富集程度比較(n=3)

3 討論

結(jié)直腸癌為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,手術(shù)仍為主要治療手段。研究發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性吸入性麻醉劑可促進(jìn)機(jī)體進(jìn)入炎癥狀態(tài),增加動(dòng)物小鼠及人發(fā)生癌轉(zhuǎn)移的概率[17],相比之下,丙泊酚通過(guò)抗炎、抗氧化等作用抑制腫瘤生長(zhǎng),減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。臨床研究已發(fā)現(xiàn)丙泊酚與吸入性麻醉劑相比可減少腫瘤復(fù)發(fā)和患者死亡率[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有直接抑制作用。與對(duì)照組比較,丙泊酚可以直接抑制腸癌細(xì)胞SW620 及HT29增殖活性,在作用24 h 即出現(xiàn)明顯抑制現(xiàn)象。此外,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 小室試驗(yàn)表明丙泊酚對(duì)腸癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲有抑制作用,表明丙泊酚具備抑制腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的抗腫瘤功能。

鑒于Wnt 信號(hào)通路為結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的驅(qū)動(dòng)信號(hào)通路,我們利用qPCR 分析丙泊酚是否影響Wnt 信號(hào)通路活性。Wnt 信號(hào)通路激活往往伴隨著上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT),從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力[22-24]。我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚組細(xì)胞較對(duì)照組E-cadherin 表達(dá)顯著上調(diào),N-cadherin 減弱,表明丙泊酚可減弱腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT 能力,與我們的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Tranwell 小室結(jié)果相符。同時(shí),我們檢測(cè)了丙泊酚處理細(xì)胞后Wnt 信號(hào)通路經(jīng)典下游靶基因β-catenin、c-Myc及CyclinD1,結(jié)果表明丙泊酚組細(xì)胞上述3 基因均有不同程度下調(diào)。其中c-Myc可抑制細(xì)胞凋亡,而周期蛋白Cyclin D1 促進(jìn)細(xì)胞G1/S 期轉(zhuǎn)換,均與細(xì)胞增殖活性有關(guān)[25-26]。我們的體外CCK-8 實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了丙泊酚作用腸癌細(xì)胞后增殖活性明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)的丙泊酚新靶點(diǎn)Wnt 信號(hào)通路尚未見(jiàn)類似報(bào)道,豐富了丙泊酚作為抗腫瘤的作用機(jī)制。

近年來(lái),大量研究表明SFRP1 是Wnt 信號(hào)通路表面受體拮抗劑,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制Wnt 配體與受體結(jié)合,增加β-catenin 磷酸化水平,降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin 水平[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以誘導(dǎo)SFRP1 上調(diào),提示了丙泊酚可能通過(guò)增強(qiáng)SFRP1 表達(dá)水平抑制Wnt 信號(hào)通路。最新研究表明SFRP1 可因EZH2 在其啟動(dòng)子富集程度增加后催化組蛋白3 第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化(H3K27Me27),導(dǎo)致其啟動(dòng)子染色質(zhì)構(gòu)象改變,從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄抑制[11-14]。我們推測(cè)丙泊酚可能通過(guò)影響SFRP1 的啟動(dòng)子對(duì)EZH2 的招募,誘導(dǎo)SFRP1 的表達(dá)。利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞EZH2 在SFRP1 啟動(dòng)子富集程度顯著下降,同時(shí)H3K27Me27 形式組蛋白在啟動(dòng)子富集度也明顯降低,證明了丙泊酚可通過(guò)抑制EZH2 介導(dǎo)SFRP1 啟動(dòng)子表觀機(jī)制,誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào),從而抑制Wnt信號(hào)通路活化。本研究首次從SFRP1 表觀調(diào)控角度揭示了丙泊酚抗癌作用,具有重要臨床價(jià)值。

亞里士多德把柏拉圖的理念論倒轉(zhuǎn)為一種目的論，即認(rèn)為人類的一切行為、人類的一切共同體都是為了某種目的，而這種目的就是某種善。城邦是一種最高的、并且包含了其他一切共同體的共同體，即政治共同體，其目的一定是“追求最高的善”，因?yàn)樗艹删妥顝V最大的善業(yè)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有抑制腸癌細(xì)胞增殖和侵襲活性。丙泊酚通過(guò)減弱EZH2 對(duì)SFRP1 表觀沉默作用,誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào),從而減低Wnt 信號(hào)通路活性,抑制腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)表型。本研究豐富了丙泊酚抗癌作用理論,為其成為潛在抗癌藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。