楊 婉,丁 莉,羅 珂,劉 美

原發(fā)性肝癌(PLC)中肝細(xì)胞癌(HCC)約占80%～90%,是臨床常見的惡性腫瘤類型,發(fā)病率在全球常見癌癥中居第六位,在癌癥死因中居第三位,而我國由于乙型肝炎病毒(HBV)感染率較高,系肝癌高發(fā)區(qū),肝癌發(fā)病率占全球發(fā)病患者近一半[1]。由于起病往往較為隱匿,HCC早期往往癥狀不明顯,確診時多數(shù)患者已達到局部晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后很差[2]。尋找評估腫瘤狀態(tài)和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物是目前HCC防治研究的熱點和難點[3]。細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)以中間絲蛋白形式參與細(xì)胞骨架形成。細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin 7,CK7)是一種低分子角蛋白標(biāo)記物,主要標(biāo)記腺上皮和移行上皮,在不同肝臟發(fā)育階段呈分化性表達差異,與肝細(xì)胞惡性程度關(guān)系密切[4]。磷脂酞肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)是細(xì)胞膜表面的一種硫酸乙酰肝素糖蛋白,可通過磷脂酰糖基錨定于細(xì)胞膜表面,影響細(xì)胞增殖和分化。此外,GPC3可通過結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)和生長因子等影響腫瘤的形成及轉(zhuǎn)移[5,6]。本研究檢測了HCC組織CK7和GPC3表達水平,分析了它們與組織病理學(xué)特征以及預(yù)后的關(guān)系,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2018年4月～2022年1月我院診治的HCC患者219例,男178例,女41例;年齡為42～79歲,平均年齡為(62.7±8.6)歲。其中乙型肝炎187例,丙型肝炎13例。診斷符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》的標(biāo)準(zhǔn)[7],巴塞羅那(Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLA)分期為B期113例,C期106例;術(shù)后病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)血管侵犯78例;門脈癌栓形成81例;肝外轉(zhuǎn)移37例。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其它惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病,合并心、腦、肺、腎等嚴(yán)重器質(zhì)性功能異常,合并甲狀腺功能亢進癥,合并人類免疫缺陷病毒感染。患者及其家屬簽署知情同意書,本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核、通過。

1.2 肝葉切除術(shù) 常規(guī)開展開腹肝葉切除術(shù)。

1.3 組織CK7和GPC3表達檢測 取肝癌組織和癌旁組織,石蠟包埋、4μm切片,60℃烘烤20 min,二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水,PBS清洗,去離子水沖洗,加入H202阻斷10 min,PBS清洗,抗原熱修復(fù),再次PBS清洗。將切片置于10%BSA下室溫孵育5 min,非特異性位點封閉。分別加入抗CK7鼠抗人多克隆抗體或抗GPC3鼠抗人多克隆抗體(美國Immuno Way公司),4℃孵育過夜,PBS清洗。滴加HRP標(biāo)記的SP(北京中杉金橋生物技術(shù)公司),37℃孵育30 min,PBS清洗,DAB顯色10 min,PBS清洗,加蘇木素復(fù)染,鹽酸酒精分化,脫水10 min,封片,鏡下觀察。在高倍鏡下隨機選擇5個視野,CK7主要定位于細(xì)胞質(zhì),GPC3主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。依據(jù)陽性細(xì)胞染色強度和比例進行評估。著色情況:無、淡黃、棕黃和棕褐色分別計為0分、1分、2分和3分;陽性細(xì)胞比例:陰性、1%～25%、26%～50%、51%～75%和76%～100%分別計為0分、1分、2分、3分和4分。以著色程度與陽性細(xì)胞比例的乘積判定,<6分代表陰性,≥6分代表陽性。

1.4 隨訪 所有入選患者在接受手術(shù)切除治療后,隨訪1年。定期檢測血清甲胎蛋白(AFP)水平和腹部超聲檢查。當(dāng)發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)存在可疑性占位性病灶時,則進一步行腹部 CT或/和MR檢查。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計數(shù)資料以%表示,采用x2檢驗或Fisher精確概率計算,應(yīng)用Kaplan-Meier曲線和Log Rank檢驗分析患者1 a生存率的差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織CK7和GPC3表達陽性率比較 癌組織CK7和GPC3陽性表達率顯著高于癌旁組織(P<0.05,圖1和表1)。

表1 癌組織與癌旁組織CK7和GPC3陽性率(%)比較

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征的癌組織CK7和GPC3表達陽性率比較 不同腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目和肝硬化患者癌組織CK7和GPC3陽性表達率比較,差異無顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);低分化腫瘤、BCLC C期、有血管侵犯、有癌栓形成和有肝外轉(zhuǎn)移患者癌組織CK7和GPC3陽性表達率顯著高于中高分化、BCLC B期、無血管侵犯、無癌栓形成或無肝外轉(zhuǎn)移組織(P<0.05,表2)。

表2 不同臨床和病理學(xué)特征癌組織CK7和GPC3陽性率(%)比較

2.3 癌組織CK7和GPC3陽性與陰性的HCC患者生存分析 隨訪1年,HCC患者生存166例(75.8%),死亡53例(24.2%);隨訪發(fā)現(xiàn),癌組織CK7陰性患者1 a生存率為80.1%(117/146),顯著高于CK7陽性患者的67.1%(49/73,P<0.05,圖2);癌組織GPC3陰性患者1 a生存率為85.0%(68/80),顯著高于GPC3陽性患者的70.5%(98/139,P<0.05,圖3)。

圖2 癌組織CK7陽性與陰性患者1a生存率比較

圖3 癌組織GPC3陽性與陰性患者1 a生存率比較

3 討論

CK是角質(zhì)細(xì)胞主要骨架蛋白,作為中間絲于所有上皮細(xì)胞和部分非上皮細(xì)胞中存在,維持上皮組織的完整性和連續(xù)性,在上皮源性腫瘤異常表達,可作為輔助診斷腫瘤的指標(biāo)之一[8-10]。CK7是CK的一個亞型,分子量為54 kDa,是一種堿性細(xì)胞角蛋白,于正常組織腺上皮和移行上皮細(xì)胞表達,如肺、子宮內(nèi)膜、乳腺等均可呈陽性表達,而一般在非上皮來源細(xì)胞,如正常血液和骨髓則無表達[11]。卵圓細(xì)胞為肝臟干細(xì)胞,其分化過程及其機制復(fù)雜,具有多向分化潛能。在正常肝臟,干細(xì)胞可遷移進入肝實質(zhì),分化為肝細(xì)胞,但在致癌環(huán)境的作用下可異常分化為HCC[12]。CK7為肝卵圓細(xì)胞表達水平相對較高的標(biāo)志物。本研究顯示HCC癌組織CK7陽性表達率顯著高于癌旁組織。當(dāng)卵圓細(xì)飽向正常肝細(xì)胞分化時,CK7表型被抑制,即呈陰性表達;當(dāng)細(xì)胞癌變時,則可表現(xiàn)出干細(xì)胞的某些表型,如CK7陽性表達[13]。此外,本研究顯示CK7陽性表達與細(xì)胞分化程度、BCLC分期、血管侵犯、癌栓形成和肝外轉(zhuǎn)移均有一定的關(guān)系。CK7陽性率隨分化程度降低、BCLC分期增高、血管侵犯、癌栓形成和肝外轉(zhuǎn)移呈升高態(tài)勢,提示CK7參與了HCC進展。 CK7在正常肝細(xì)胞中不表達,僅于膽管細(xì)胞表達。當(dāng)發(fā)生癌變時,癌細(xì)胞重新表達CK7,且其表達水平隨細(xì)胞分化程度增加而降低。腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞外基質(zhì)屏障被破壞,CK7分子可與基底膜重要成分層黏連蛋白結(jié)合,觸發(fā)免疫反應(yīng),破壞基底膜,可能是CK7高表達下腫瘤侵襲性增加的重要機制之一[14]。本研究結(jié)果顯示CK7陰性表達的HCC患者術(shù)后1 a生存率為80.1%,顯著高于CK7陽性表達患者的67.1%。癌組織CK7高表達可在一定程度上預(yù)示患者預(yù)后不良。既往研究顯示[15]影響HCC預(yù)后的主要病理學(xué)因素有腫瘤大小、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移、門靜脈癌栓形成、包膜侵犯和肝硬化等。CK7陽性表達的肝癌細(xì)胞分化程度低,發(fā)生門靜脈癌栓的幾率大,更容易出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者生存期大大縮短。

GPC3是一種硫酸類肝素糖蛋白聚糖,在生物體內(nèi)分布具有明顯的組織特異性和組織分化時相特異性。在成人,除胎盤組織GPC3呈現(xiàn)高表達外,僅于腎臟、心臟、肺臟和卵巢等少數(shù)組織呈現(xiàn)低水平表達,正常肝組織則無GPC3表達。GPC3在腫瘤細(xì)胞生長、分化和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16,17]。研究顯示[18],GPC3在HCC組織表達明顯強于肝硬化、不典型增生和局灶性結(jié)節(jié)性增生組織。本研究采用免疫組化法檢測了手術(shù)切除的肝癌組織和其對應(yīng)的癌旁組織,結(jié)果顯示肝癌組織GPC3蛋白表達較為廣泛,其表達陽性率為63.5%,顯著高于癌旁組織的21.9%。GPC3參與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。經(jīng)典Wnt信號通路激活與HCC發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。GPC3增加細(xì)胞膜上Wnt水平,促進 Wnt與卷曲蛋白受體結(jié)合,增強Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子β-聯(lián)蛋白遷移到細(xì)胞核,驅(qū)動多個基因表達,促進細(xì)胞增殖,刺激肝癌細(xì)胞生長,促進惡性轉(zhuǎn)化。GPC3參與HCC組織胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、刺猬刺激分子、成纖維細(xì)胞生長因子和骨形成蛋白等,上調(diào)生長因子及其受體間的作用,引起肝細(xì)胞持續(xù)增殖,導(dǎo)致肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[19,20]。經(jīng)Kaplain-Maier法描繪生存曲線,比較GPC3陽性與陰性表達患者生存率的差異,結(jié)果顯示陽性表達患者1 a生存率顯著低于陰性表達患者。GPC3可能是HCC發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子,細(xì)胞表面錨定的GPC3可作為某些生長因子的輔助因子,促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的高效運行,促進了細(xì)胞轉(zhuǎn)化。