鄒 濤,張 敏,楊 凡,王 麗,喻 峰

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是我國常見的病毒性肝炎,HBV長期感染導致肝纖維化,逐漸進展為肝硬化[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn),信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)[2-3]以及可溶性CD30分子(soluble CD30,sCD30)參與了肝纖維化的基因調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導,但它們的作用機制仍存在爭議。在肝損傷早期階段,STAT3可促進肝細胞再生,有利于肝細胞修復。隨著肝臟免疫炎癥反應加重,STAT3過度表達可促使肝纖維化病變的發(fā)生[4,5]。CD30是腫瘤壞死因子受體超家族成員,CD30與其配體結(jié)合可介導細胞增殖、活化、分化、凋亡,在肝纖維化的免疫炎癥信號傳導過程中具有關(guān)鍵的作用[6]。本研究檢測了CHB和乙型肝炎肝硬化患者血清STAT3和sCD30水平,并分析了其與病情進展的關(guān)系,為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2019年12月～2021年12月我院診治的CHB患者45例(男35例,女10例,年齡25～58歲,平均年齡36.2±5.7歲,HBeAg陽性25例)和乙型肝炎肝硬化患者38例(男30例,女8例,年齡33～62歲,平均年齡45.0±7.6歲,失代償期16例)。符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[7]和《肝硬化診治指南(2019年版)》[8]診斷標準。納入患者就診3個月內(nèi)未應用過α-干擾素或核苷(酸)類似物治療。排除標準:(1)合并其他嗜肝病毒感染;(2)合并嚴重的心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、腎功能不全;(3)認知功能障礙或精神病。另選擇同期在我院體檢的健康人40例(男32例,女8例,年齡32～60歲,平均年齡為45.4±7.9歲)。本研究通過我院醫(yī)學倫理委員批準實施,患者簽署知情同意書。

1.2 外周血單個核細胞(PBMC)STAT3 mRNA水平檢測 采集外周靜脈血,采用淋巴細胞分離液分離出PBMCs,加入Trizol試劑提取細胞總RNA,加入氯仿0.2 ml,混勻30 s,冰浴靜置3 min。然后,在4℃下,12000 r/m離心15 min。取上層水相移到新的EP管中,加入異丙醇0.5 ml,混勻,冰浴10 min。在4℃下,12000 r/m離心10 min。傾倒上層液體,用75%冰乙醇溶解下層沉淀物。在4℃下,12000 r/m 離心5 min。干燥下層沉淀物,加入DEPC處理水溶解RNA,-80℃保存。采用RT-PCR法擴增[試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,Biometra TRobot II 384G實時熒光定量PCR擴增儀購自德國耶拿分析儀器有限公司]。試劑包括10×gDNA Eraser Buffer 1 μl,gDNA Eraser 0.5 μl,RNA Template1 10 pg～1 μg,加入RNase-Free水至10 μl。渦旋震蕩混勻,短暫離心,使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育2 min。在反應結(jié)束后,短暫離心,置于冰上冷卻。引物由Invitrogen公司合成,STAT3 mRNA上游引物:5’-GGTTAGAACCCTACACGAAG-3’,下游引物:5’-CTACAGA GCCCACTATCCG-3’。RT-PCR反應體系:2×SuperReal PreMix Plus 10 μl,上游引物(10 μM)0.6 μl,下游引物(10 μM)0.6 μl,cDNA100 ng,RNase Free ddH2O 20 μl。95℃ 15 min,95℃10 s,53～58℃ 30 s,72℃ 30 s,循環(huán)40次。以 GADPH為內(nèi)參,采用2-△△CT法進行相對定量分析。

1.3 血清sCD30 采用ELISA法檢測血清sCD30水平(德國IBL公司)。設置標準品孔和樣本孔,在標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl,在樣本孔先加待測血清10 μl,再加樣本稀釋液40 μl,空白對照孔不加血清。除空白對照孔外,在標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體,使用洗板機重復洗板5次。每孔加入底物a、b各50 μl,37℃避光孵育 15 min。每孔加入終止液50 μl,15 min內(nèi)在800TS酶標儀(美國BioTek公司)450 nm波長處測定各孔的吸光度OD值。以OD值為縱坐標(Y),以標準品濃度為橫坐標(X對數(shù)坐標),繪制標準曲線,將待測血清樣品的OD值代入回歸方程,計算出其血清濃度。

1.4 治療方法 給予兩組患者恩替卡韋(安徽貝克生物制藥有限公司,國藥準字H20140037)0.5 mg口服,1次/d或富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(正大天晴藥業(yè)集團,國藥準字H20173303)300 mg口服,1次/d。給予乙型肝炎肝硬化患者綜合治療,除抗病毒藥物外,給予復方甘草酸苷片(北京凱因科技股份有限公司,國藥準字H20083001)2片口服,3次/d,安絡化纖丸(森隆藥業(yè)有限公司,國藥準字Z20010098)6 g口服,2次/d。對于存在腹水的患者,給予利尿劑、白蛋白、腹腔穿刺放腹水等措施。

2 結(jié)果

2.1 三組有關(guān)指標比較 CHB患者血清ALT水平升高,肝硬化患者血清膽紅素水平升高,而白蛋白水平降低;肝硬化患者PBMC STAT3 mRNA和血清sCD30水平顯著高于CHB組或健康人(P<0.05,表1)。

表1 三組有關(guān)指標比較

2.2 不同狀態(tài)CHB和肝硬化PBMC STAT3 mRNA和血清sCD30水平比較 HBeAg陽性的CHB患者PBMC STAT3 mRNA和血清sCD30水平顯著高于HBeAg陰性患者(P<0.05),失代償期肝硬化患者STAT3 mRNA和sCD30水平顯著高于代償期患者(P<0.05,表2)。

表2 不同狀態(tài)CHB和肝硬化患者STAT3 mRNA和sCD30水平比較

2.3 治療前后CHB和肝硬化患者PBMC STAT3 mRNA和血清sCD30水平比較 與治療前比,在治療3個月和6個月后,兩組STAT3 mRNA和sCD30水平均顯著下降(P<0.05,表3)。

表3 兩組治療前后STAT3 mRNA和sCD30水平比較

3 討論

肝纖維化是肝臟結(jié)締組織異常增生的病理學過程。在肝纖維化早期,膠原、糖蛋白、蛋白多糖等細胞外基質(zhì)生成和降解之間的不平衡是可逆的,但在HBV感染引起的免疫炎癥反應反復刺激下,促纖維化細胞激活增殖,發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化反應[9],促使肝細胞和肝內(nèi)膽管上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞,肝纖維化加重,肝臟微細結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂,肝細胞結(jié)節(jié)樣再生,形成假小葉結(jié)構(gòu),逐步進展為肝硬化。此時,慢性肝病的病程已難以逆轉(zhuǎn)[10,11]。STAT3是肝纖維化和肝細胞增殖與凋亡平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[12]。有研究[13]表明,在小鼠肝臟模型可檢測到STAT3蛋白磷酸化。本研究也發(fā)現(xiàn),CHB和乙型肝炎肝硬化患者PBMC STAT3 mRNA水平上調(diào),顯著高于健康人,給予抗病毒和抗炎護肝藥物治療后,STAT3 mRNA水平逐漸下降。血清HBeAg陽性、失代償期肝硬化和發(fā)病期間STAT3 mRNA水平高于HBeAg陰性、代償期肝硬化和治療后病情穩(wěn)定患者,也提示STAT3 mRNA水平與病情進展和預后密切相關(guān)。一般認為,STAT3在肝纖維化進展過程中具有雙向調(diào)節(jié)作用。一方面,STAT3信號通路介導白細胞介素6(IL-6)相關(guān)的肝臟保護機制,抑制肝臟免疫炎癥反應;另一方面,細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子通過IL-6/ STAT3信號通路抑制促凋亡蛋白,拮抗γ干擾素,誘導抗凋亡蛋白,減輕肝纖維化[14]。不過,隨著肝臟免疫炎癥反應加重,STAT3過度表達經(jīng)由非受體型酪氨酸蛋白激酶(JAK2)途徑,使促纖維化細胞激活增殖,誘導肝纖維化[15,16]。有動物實驗探討了IL-6/ STAT3信號通路在肝纖維化發(fā)生過程中的作用,應用IL-6處理肝星狀細胞,與未處理細胞相比,處理后的細胞STAT3磷酸化水平顯著提高,提示STAT3過度表達可促進肝星狀細胞增殖,促進肝纖維化[17]。利用外泌體作為遞送導管特異性靶向STAT3,將成纖維細胞樣間充質(zhì)干細胞的外顯子體工程化,攜帶靶向STAT3的siRNA,抑制了小鼠肝纖維化發(fā)展過程中STAT3表達和細胞外基質(zhì)沉積,并顯著改善了肝功能[18]。

CD30是腫瘤壞死因子受體超家族成員。本研究發(fā)現(xiàn),CHB和乙型肝炎肝硬化患者血清sCD30水平顯著高于健康人,而肝硬化患者血清水平有顯著高于CHB患者,提示CD30表達上調(diào)可能與肝纖維化密切相關(guān)。隨著治療進步,血清sCD30水平也呈下降趨勢。另外,HBeAg陽性的CHB患者血清sCD30水平顯著高于HBeAg陰性者,失代償期肝硬化患者sCD30水平也顯著高于代償期患者,說明sCD30水平與肝病活躍程度有關(guān)。CD30在Th1型細胞免疫應答過程中的活躍性降低,無法抑制HBV持續(xù)復制,肝細胞表面病毒抗原大量表達,刺激大量炎癥因子生成,引起肝臟免疫炎癥反應[19,20]。在Th2型細胞免疫應答過程中,CD30活躍度增加,輔助B細胞活化,發(fā)揮體液免疫反應作用,能有效抑制HBV復制,提高病毒清除效率,減輕肝細胞損傷。

綜上所述,CHB和乙型肝炎肝硬化患者PBMC STAT3和血清sCD30水平上調(diào),可能與病情進展和預后密切相關(guān)。