卜宣尹 楊衛(wèi)麗

黎藥膽木內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性研究及其基因功能預(yù)測(cè)分析

卜宣尹1,2楊衛(wèi)麗1

（1. 海南醫(yī)學(xué)院 海南?？?571199；2. 三明醫(yī)學(xué)科技職業(yè)學(xué)院 福建三明 365000）

以海南省5個(gè)產(chǎn)區(qū)采集的膽木為材料，采用高通量16S rRNA測(cè)序技術(shù)分析了膽木的根、莖、葉和表皮4個(gè)組織的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性，并通過PICRUSt分析其內(nèi)生細(xì)菌的潛在功能。結(jié)果表明，膽木在16S rRNA V3-V4區(qū)高質(zhì)量序列片段共得到3759378條有效序列，劃分為3475個(gè)OUTs，內(nèi)生細(xì)菌分為30門、82綱、183目、326科、764屬，具有豐富的菌群多樣性，組間差異顯著。對(duì)內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析可知，共有優(yōu)勢(shì)菌屬為d（25.11%）、芽孢桿菌屬（15.16%）、伯克霍爾德氏菌屬（7.06%）、羅爾斯通菌屬（5.03%）、馬賽菌屬（4.60%）。其中，根優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬）、伯克霍爾德氏菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、固氮根瘤菌（）、根瘤菌屬（Rhizobium）；莖優(yōu)勢(shì)菌屬為、羅爾斯通菌屬（）、馬賽菌屬（）、Mitochondria_unclassified；葉優(yōu)勢(shì)菌屬為短小桿菌屬（）；表皮優(yōu)勢(shì)菌屬為賴氨酸芽胞桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）。PICRUSt分析顯示，膽木不同組織內(nèi)生細(xì)菌主要涉及6個(gè)生物代謝通路及36個(gè)子功能。不同組織的內(nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層預(yù)測(cè)基因種基本無差異，但基因豐度具有顯著差異，代謝為影響膽木植株內(nèi)生細(xì)菌多樣性和豐富度的重要因素。通過全面揭示膽木不同組織內(nèi)生細(xì)菌多樣性的變化趨勢(shì)和規(guī)律，能為其內(nèi)生細(xì)菌的進(jìn)一步應(yīng)用、充分挖掘其蘊(yùn)含的豐富微生物資源奠定理論基礎(chǔ)。

膽木；內(nèi)生細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；多樣性；基因功能

內(nèi)生細(xì)菌為定居在植物組織中不對(duì)宿主植物有負(fù)面影響的微生物。內(nèi)生細(xì)菌可以從無菌的根、莖和葉等植物組織中分離出來[1]，與植物宿主形成互利共生關(guān)系。有益的內(nèi)生細(xì)菌有維持植物生長(zhǎng)健康、影響及調(diào)控植物代謝、產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物等作用[2]。同時(shí)，宿主植物能為內(nèi)生細(xì)菌提供生長(zhǎng)所必需的能量和營(yíng)養(yǎng)，這種有益效果是通過產(chǎn)生具有重要生物活性（如抗真菌和抗病毒）的植物激素和次級(jí)代謝產(chǎn)物，并通過促進(jìn)礦物質(zhì)吸收或固氮的增加來實(shí)現(xiàn)[3-4]。

膽木[（Pierre ex Pitard）Merr. & Chun]為茜草科（Rubiaceae）烏檀屬（）的多年生喬木，是我國(guó)特有的源生烏檀屬植物，也是海南黎藥資源重點(diǎn)研究保護(hù)物種[5]，是海南省重點(diǎn)研究傳統(tǒng)黎族藥用植物之一。目前有關(guān)膽木的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、抗炎作用等方面[6]，鮮有對(duì)膽木內(nèi)生菌的探究。對(duì)膽木內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行探究有利于豐富和完善膽木內(nèi)生細(xì)菌種質(zhì)資源，對(duì)解決膽木因在自然條件下生長(zhǎng)緩慢、人工種植產(chǎn)量不高、品質(zhì)不佳等問題提供方向，對(duì)開拓膽木輔助育種新方向具有重要意義。本研究基于Illumina MiSeq第二代高通量測(cè)序技術(shù)，以海南省5個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的膽木為材料，對(duì)其不同組織的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行全面解析，并進(jìn)行相關(guān)的基因功能預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步闡明內(nèi)生細(xì)菌與膽木的相互作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為不同組織內(nèi)生細(xì)菌功能菌株的挖掘和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品均采集自海南省，包括鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)、瓊中黎族苗族自治縣、興隆植物園、尖峰嶺、儋州市。詳見表1。

表1 樣品采集信息表

注：PR～P3R、PJ～P3J、PL～P3L、PK～P3K分別表示在鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)坡告嶺采集的根、莖、葉、皮；WR、WJ、WL、WK分別表示在鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)青蛙嶺采集的植物根、莖、葉、皮；YR、YJ、YL、YK分別表示在鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)牙師村采集的植物根、莖、葉、皮；ZR、ZJ、ZL、ZK分別表示在鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)壯賀村采集的植物根、莖、葉、皮；JR、JJ、JL、JK分別表示在鸚哥嶺自然保護(hù)區(qū)青介村采集的植物根、莖、葉、皮。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集前處理 樣品采集：在每個(gè)樣品采集地分別挑選間距8 m以上的5株健康的野生膽木作為采樣對(duì)象。使用鐵鍬小心挖至根末級(jí)，用剪刀剪下新鮮的莖、葉組織，用小刀剝?nèi)⌒迈r干皮。分別做好標(biāo)記后將膽木組織樣品裝入塑封袋內(nèi)并做好標(biāo)記后放入便攜式保溫箱干冰冰凍保存。具體分組見表1。

1.2.2 樣品表面消毒 參照Inuwa等[7]預(yù)處理方法，將5個(gè)采集地的各組織進(jìn)行細(xì)菌的分離實(shí)驗(yàn)。先用自來水沖洗至表面無明顯雜質(zhì)，無菌濾紙吸干表面水分。于超凈臺(tái)內(nèi)取出樣品后，75%的酒精溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3次，再用5%次氯酸鈉溶液浸泡3～5 min，無菌水沖洗3次，保證其無菌，取最后1次沖洗的無菌水200 μL涂布于LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，檢驗(yàn)滅菌效果，確保表面滅菌徹底，分離出的為內(nèi)生細(xì)菌。最后挑取形態(tài)、顏色及大小有明顯差異的菌株，與40%甘油進(jìn)行1∶1混合，保存于–80℃冰箱中，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 微生物總DNA提取 根據(jù)制造商的說明，使用Magnetic Soil And Stool DNA Kit試劑盒（中國(guó)北京天根生物技術(shù)有限公司）從植物樣品中提取總DNA。對(duì)于具體的提取過程，參考Liu等[8]的CTAB方法。最后加入40 μL無菌水溶解DNA，于–20℃冰箱內(nèi)保存。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。

1.2.4 目的片段PCR擴(kuò)增及測(cè)序 以16sRNA反映菌群組成和多樣性的目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，使用Phusion酶進(jìn)行一步PCR，細(xì)菌PCR所用引物[9]：V3-V4通用引物，341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）。使用NovaSeq 6000測(cè)序儀進(jìn)行2×250 bp的雙端測(cè)序。所得樣品DNA委托杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 使用QIIME2（2019.4）平臺(tái)DADA2方法進(jìn)行序列處理。通過qiime dada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接和去嵌合體，得到ASVs（amplicon sequence variants）?；诩?xì)菌數(shù)據(jù)庫silva 132，采用OIIME2的classify-sklearn算法進(jìn)行物種分類學(xué)注釋。使用R軟件（VennDiagram）進(jìn)行細(xì)菌分類OTU（操作單元）劃分，UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）方法對(duì)樣品進(jìn)行聚類。使用Mothur軟件計(jì)算細(xì)菌物種豐度和多樣性?；贙EGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫，利用PICRUSt（Phylogenetic Investigationof Communities by Reconstruction of Unobserved States）對(duì)微生物群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行高質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：所采集膽木根、莖、皮、葉樣品中分別得到1 006 154、997 701、1 005 124、1 092 532條 Raw Tags；經(jīng)過濾掉低質(zhì)量或短長(zhǎng)度tags后,分別獲得898 836、930 230、905 957、1 024 355條有效序列。隨著測(cè)序數(shù)量的增加，各個(gè)樣品中所包含的序列均被檢測(cè)到，表明各樣品測(cè)序深度范圍大，文庫覆蓋率高，數(shù)據(jù)合格且可靠。

2.2 物種注釋及OUTs分布Venn圖

圈和圈重疊部數(shù)目代表樣本間共有的ASV數(shù)目，沒有重疊的部分代表每個(gè)組特有的ASV數(shù)目。綠色代表膽木葉樣品；黃色代表膽木皮樣品；藍(lán)色代表膽木根樣品；紅色代表膽木莖樣品。

通過物種注釋可得到膽木根莖皮葉中共有內(nèi)生細(xì)菌30門、82綱、183目、326科、764屬，具有豐富的菌群多樣性。通過Venn圖（圖1）直觀地呈現(xiàn)各分組共有和特有的ASV數(shù)目。結(jié)果顯示：膽木根、莖、皮、葉共有的OTUs個(gè)數(shù)為144，其中根樣品中特有的OTUs個(gè)數(shù)為418，莖樣品中特有的OTUs個(gè)數(shù)為810，皮樣品中特有的OTUs個(gè)數(shù)為506，葉樣品中特有的OTUs個(gè)數(shù)為931。說明膽木葉中特異性最高，群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，根中OTUs特異性最低，群落結(jié)構(gòu)較單一。其順序?yàn)椋喝~>莖>皮>根。由此可知，不同生長(zhǎng)環(huán)境條件下，膽木各組織內(nèi)生細(xì)菌基于不同分類水平均存在數(shù)量上的差異。

圖1 膽木內(nèi)生細(xì)菌物種（OTUs）組成的Venn圖

2.3 Alpha多樣性分析

如圖2，Chao1（圖2-a）指數(shù)用來估計(jì)物種的總數(shù)。物種總數(shù)順序?yàn)椋喝~>莖>皮>根。Coverage（圖2-b）指微生物覆蓋率。膽木根、莖、皮、葉的coverage指數(shù)均為1，表明測(cè)序深度已經(jīng)覆蓋到樣本中的所有物種。Shannon（圖2-c）微生物多樣性的指數(shù)值與群落多樣性呈正相關(guān)。膽木內(nèi)生細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)最高的是莖，其次是葉；最低是根。其多樣性為莖>葉、皮>根。這表明膽木莖中內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性豐富，不確定性大，根中內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性相對(duì)較低。

藍(lán)色.根；黃色.莖；紅色.葉；紫色.皮。

2.4 膽木內(nèi)生細(xì)菌群落組成分析

基于物種注釋統(tǒng)計(jì)表，將通過門和屬水平的聚類圖對(duì)物種豐度進(jìn)行展示分析，見圖3。從門的分類水平看。膽木根莖皮葉中共有優(yōu)勢(shì)菌門主要由變形桿菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、（Campylobacterota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單孢桿菌門（Gemmatimonadota）等組成，其平均相對(duì)豐度分別為42.18%、25.19%、24.83%、4.15%、3.09%、0.20%、0.12%、0.05%和0.02%。膽木根、莖和葉3個(gè)不同組織中，出現(xiàn)了大量變形桿菌門（Proteobacteria）。菌群豐度分別達(dá)到45.40%、42.90%、44.95%，但同時(shí)期皮部的豐度較低（35.85%）；皮、莖和葉發(fā)現(xiàn)少量的綠彎菌門（Chloroflexi），豐度為0.02%～0.10%，在根中并未發(fā)現(xiàn)；莖和葉中還發(fā)現(xiàn)了微量芽單孢桿菌門（Gemmatimonadota），豐度為0.01%～0.04%，但在根和皮中均未發(fā)現(xiàn)。

從屬水平分類上看，所有樣本共有18個(gè)屬的平均相對(duì)豐度大于1.0%，分別是、芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、羅爾斯通菌屬（）、馬賽菌屬（）、（）、賴氨酸芽胞桿菌屬（）、假單胞菌屬（）、短小桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、腸桿菌屬（）、固氮根瘤菌（）、羅氏甲基桿菌（）、黏液桿菌屬（）、根瘤菌屬（）、泛菌屬（）及克雷伯氏菌屬（）。其中平均豐度最高的屬為（25.11%），其次是芽孢桿菌屬（15.16%）、伯克霍爾德氏菌屬（7.06%）、羅爾斯通菌屬（5.03%）、馬賽菌屬（4.60%）。

圖中展示相對(duì)豐度前30的門類群。

由圖4可知，在膽木莖、皮和葉3個(gè)不同組織中，出現(xiàn)了大量。菌群豐度分別達(dá)到31.84%、26.89%、31.77%，但同時(shí)期根部的豐度較低（9.94%）；在根中存在比其他組織具有較高占比的菌群芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、固氮根瘤菌（）、根瘤菌屬（）。莖、皮和葉中還發(fā)現(xiàn)少量短小桿菌屬（）（豐度為0.42%～8.30%），而根中沒有。

圖中展示相對(duì)豐度前30的屬進(jìn)行排序。

2.5 功能預(yù)測(cè)分析

PICRUSt是基于比對(duì)微生物群落的豐富度與數(shù)據(jù)庫，從而在不可觀測(cè)的情況下推測(cè)出生物群落的功能信息?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)和KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)膽木不同組織內(nèi)生細(xì)菌在一級(jí)功能層共包含6類生物代謝通路（表2），即：遺傳信息處理、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、環(huán)境信息處理、人體疾病、新陳代謝。其中，根在環(huán)境信息處理通路的豐度最高，葉在遺傳信息處理、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病、新陳代謝5個(gè)通路中豐度均高，皮在參與調(diào)控各種代謝通路的豐度均較低。

同時(shí)，針對(duì)膽木不同組織的內(nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)生細(xì)菌基因二級(jí)功能層由36個(gè)子功能組成（圖5）。其中，代謝過程相關(guān)的基因數(shù)最多，占總基因數(shù)的33.3%。主要包括多糖合成與代謝、碳水化合物代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝等代謝過程；其次為生物體系統(tǒng)過程，占總基因數(shù)的20.5%，主要涉及消化系統(tǒng)、排泄系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等過程；人類疾病過程占總基因數(shù)的12.8%，主要涉及免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病、代謝性疾病等過程。

表2 膽木不同組織內(nèi)生細(xì)菌KEGG（Leve1）功能豐度分析

3 結(jié)論

目前，關(guān)于膽木微生態(tài)結(jié)構(gòu)的報(bào)道，僅有陳燕艷等[10]對(duì)于膽木根際的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究，其根際土壤細(xì)菌共有優(yōu)勢(shì)菌門芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planc-tomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria），與本研究結(jié)果相似，但豐度均有不同；而優(yōu)勢(shì)菌屬中，僅有芽孢桿菌屬（）與本研究結(jié)果相似，且豐度差異大。其結(jié)果說明，雖為同種植物，但由于分離部位的不同及采集環(huán)境差異的影響導(dǎo)致膽木微生態(tài)菌群結(jié)構(gòu)基于在不同分類水平上均存在菌群種類及豐度上的差別。

Alpha多樣性分析顯示，膽木莖中表示細(xì)菌群落豐度和多樣性的相關(guān)指數(shù)均高于膽木根、葉、皮內(nèi)生細(xì)菌群落對(duì)應(yīng)的相關(guān)指數(shù)，這可能是由于莖暴露于物理化學(xué)條件如溫度、濕度、紫外線照射等劇烈變化的環(huán)境中，而且莖中含有淀粉、糖和木質(zhì)部的其他植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這個(gè)營(yíng)養(yǎng)豐富的生態(tài)系統(tǒng)有利于豐富細(xì)菌的種類[11]，因此莖中的內(nèi)生細(xì)菌多樣性較高。

群落組成分析中，4種不同組織中均有相同的內(nèi)生細(xì)菌定殖，但分布存在一定的組織差異性，并發(fā)現(xiàn)了膽木不同組織中的主要門類、核心屬類和一些低豐度的微生物種群。這表明在膽木不同部位發(fā)現(xiàn)的許多分類群可能有著相似的來源。變形桿菌門（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）為膽木根莖葉皮中共有的優(yōu)勢(shì)菌門。有研究已證實(shí)，變形菌門有助于藥用植物產(chǎn)量及有效物質(zhì)含量的提高[12-13]，且在促進(jìn)植物生長(zhǎng)，防治病害方面發(fā)揮重要作用。變形菌門是常見的植物內(nèi)生細(xì)菌門[14]，表明膽木內(nèi)生細(xì)菌具有一般植物內(nèi)生細(xì)菌的特點(diǎn)。厚壁菌門可以保護(hù)其宿主免受疾病、促進(jìn)生長(zhǎng)、在其他植物上定植[15]，且在生態(tài)中也起著重要作用。魏玉倩等[16]從植物蘇鐵中證實(shí)，藍(lán)細(xì)菌門將空氣中的氮?dú)猓∟2）轉(zhuǎn)化成無機(jī)氮，為蘇鐵的生長(zhǎng)提供氮源，光能和化能自養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌具有產(chǎn)生吲哚乙酸促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的能力。

在屬水平上，含量最高的為未分類細(xì)菌Chloroplast_unclassified，這說明膽木中還蘊(yùn)含大量未知微生物種類，有關(guān)膽木內(nèi)生細(xì)菌在屬水平上的探究還不夠深入，需要采用其他分析手段進(jìn)一步鑒定確認(rèn)。此外，分類學(xué)地位明確的豐度前10的菌屬主要是芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、羅爾斯通菌屬（）、馬賽菌屬（）、賴氨酸芽胞桿菌屬（）、假單胞菌屬（s）、短小桿菌屬（）、類芽孢桿菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、腸桿菌屬（），這些在土壤改良[17]、合成次級(jí)代謝產(chǎn)物和酶[18-19]、固氮解磷促生[20-23]、抗植物病蟲害等方面[24-25]起到關(guān)鍵作用。值得一提的是，在根中存在比其他組織更高占比的菌群，芽孢桿菌屬（）、伯克霍爾德氏菌屬（）、寡養(yǎng)單胞菌屬（）、固氮根瘤菌（、根瘤菌屬（），這些均被證實(shí)有固氮、促氮作用，能促進(jìn)植物次生代謝的積累[26-29]，后續(xù)可依據(jù)其優(yōu)勢(shì)菌群功能進(jìn)行深入研究分析，為解決膽木病變及有效物質(zhì)分子形成機(jī)制提供理論支持。

內(nèi)生菌的生物學(xué)功能跟其所擁有的功能基因密切相關(guān)。本研究采用PIRCUSt對(duì)膽木內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，膽木不同組織的內(nèi)生細(xì)菌含大量關(guān)于碳水化合物、脂質(zhì)、糖類、氨基酸，輔酶及代謝產(chǎn)物合成的基因信息。一方面，碳水化合物是植物生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響植物的品質(zhì)[30-31]，VC是植物代謝過程不可或缺的產(chǎn)物，參與調(diào)控細(xì)胞分裂、體內(nèi)活性氧清除和細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生理過程[32-34]；另一方面，這些代謝過程說明膽木內(nèi)生細(xì)菌可能參與代謝膽木根、莖、葉和表皮中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為膽木植株生長(zhǎng)發(fā)育提供重要的激素、營(yíng)養(yǎng)等，且氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)，環(huán)境脅迫下植物體內(nèi)的游離氨基酸代謝可以對(duì)植物的抗逆性起到指示作用[35]。此外，還預(yù)測(cè)到多糖類化合物和次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因，說明膽木內(nèi)生細(xì)菌有合成藥用活性物質(zhì)的潛力。該研究可為從膽木根、莖、葉和表皮分離出生產(chǎn)有效藥用成分的植物內(nèi)生細(xì)菌提供理論基礎(chǔ)。

[1] El-Tarabily K A. An endophytic chitinase-producing isolate of Actinoplanes missouriensensis, with potential for biological control of root rot of lupine caused by[J]Aust J Bot, 2003, 51(3): 257-266.

[2] 梁振霆, 唐婷. 內(nèi)生菌對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成影響和抗逆功能研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2021, 37(8): 35-45.

[3] Yang R, Liu P, Ye W. Illumina-based analysis of endophytic bacterial diversity of tree peony (Sect. Moutan) roots and leaves[J]. Braz J Microbiol, 2017, 48: 695-705.

[4] Zinniel D K, Lambrecht P, Harris N B, et al. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants[J]. Appl Environ Microbiol, 2002, 68: 2 198-2 208.

[5] Wang G H, Wang H J, Liu H, et al. The rapid profiling and simultaneous determination of 12 major alkaloids inby UPLC-Q-TOF-MS and HPLC-ESI-MS/MS[J]. Analytical methods:advancing Methods and Applications. 2021, 13(47): 5 787-5 803.

[6] 麥?zhǔn)犁? 王怡然, 李永輝, 等.中藥膽木化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)展[J].廣州化工, 2018, 46(16):38-41.

[7] InuwaA B, MaryamY A, Arzai A H, et al.Distribution of culturable endophytic bacteria in lemon grass[J]. Bayero Journal of Pure and Applied Sciences, 2017.

[8] Liu F, Yuan Z S, Zhang X T, et al. Characteristics and diversity of endophytic bacteria in Moso Bamboo () based on 16S rDNA Sequencing[J]. Archives of Microbiology, 2017, 199(6): 1 259-1 266.

[9] Hunter J J K, Ruffner H P. Assimilate transport in grapevines-effect of phloem disruption[J]. Aust J Grape Wine Res, 2001, 7: 118-126.

[10] 陳燕艷, 徐詩濤, 王德立, 等. 不同種植地膽木根際的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào), 2022, 13(5): 488-495.

[11] 劉陳靜. 內(nèi)生菌強(qiáng)化商陸修復(fù)鎘污染土壤效應(yīng)及機(jī)制研究[D]. 北京：北京科技大學(xué), 2023.

[12] Ying Y X, Ding WL, Li Y. Characterization of soil bacterial communities in rhizospheric and nonrhizospheric soil of Panax ginseng[J]. Biochemical genetics, 2012, 50 (11-12) : 848-859.

[13] Jin H, Yang X Y, Yan Z Q, et al.Characterization of rhizosphere and endophytic bacterial communities from leaves, stems and roots ofL. [J]. Systematic and Applied Microbiology, 2014, 37(5): 376-385.

[14] 宋旭紅, 李隆云, 崔廣林, 等.不同生長(zhǎng)年限桔梗根部?jī)?nèi)生細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2020, 51(10):2 358-2366.

[15] Pankaj Kumar, Satyajeet Khare, RC Dubey. Diversity of bacilli from disease suppressive soil and their role in plant growth promotion and yield enhancement[J]. New York Science Journal, 2012.

[16] 魏玉倩, 陳健鑫, 鄭艷玲, 等.不同種蘇鐵珊瑚狀根內(nèi)生微生物多樣性及適應(yīng)性研究[J].微生物學(xué)報(bào), 2022, 62(7):2 835-2849.

[17] 田美, 劉漢湖, 申欣, 等.百樂克(BIOLAK)活性污泥宏基因組的生物多樣性及功能分析[J].環(huán)境科學(xué), 2015, 36(5):1739-1748.

[18] 楊恩東, 崔丹曦, 汪維云.馬賽菌屬細(xì)菌研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào), 2019, 46(6):1537-1548.

[19] 李春燕. 白及內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及內(nèi)生細(xì)菌BSR2010的次級(jí)代謝產(chǎn)物分析[D].武漢: 中南民族大學(xué), 2021.

[20] 孫紅敏, 魏玉珍, 方曉梅, 等.蛇足石杉內(nèi)生細(xì)菌多樣性[J].微生物學(xué)報(bào), 2016, 56(4):614-628.

[21] 向益青, 廖海浪, 李娜, 等.黃連種子內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及功能驗(yàn)證[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2023, 35(2): 191-199.

[22] 杜佳慧, 徐偉芳, 楊曉冬, 等.多花黃精產(chǎn)吲哚乙酸內(nèi)生菌的分離篩選及其對(duì)黃精種子萌發(fā)的影響[J].生物技術(shù)通報(bào), 2022, 38(12):223-232.

[23] 楊琦, 劉淳劼, 郭兵, 等.苧麻根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及促生潛力評(píng)價(jià)[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué), 2020, 42(5):219-226.

[24] 徐亞軍, 趙龍飛, 陳普, 等.植物病原菌拮抗性野生艾蒿內(nèi)生菌的分離、篩選和鑒定[J].生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 33(12):3 697-3705.

[25] Wang K, Wu Y, Ye M Y, et al. Comparative genomics reveals potential mechanisms of plant beneficial effects of a novel bamboo-endophytic bacterial isolateSuichang626[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 686998.

[26] Gage DJ.Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes[J].Microbiol Mol Biol Rev, 2004, 2:280-300.

[27] Cui R Q, Zhang J M, Ma X J, et al. Effects ofsp. T28 strain on the growth of Tomato[J]. Plant Physiology. 2015, 51(11):6.

[28] Tapia-García E Y, Arroyo-Herrera I, Rojas-Rojas F U, et al.sp. nov., a nitrogen-fixing species isolated from rhizoplane ofMill. var.in Mexico[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2020, 43(6): 126133-126133.

[29] Zhou M J. Analysis of underground microbial community of salt-tolerant Jerusalem Artichoke under different nitrogen application treatments and study on the mechanism of endogenous nitrogen-fixing oligomonas promoting the growth of[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2020.

[30] 王永章, 張大鵬. 乙烯對(duì)成熟期新紅星蘋果果實(shí)碳水化合物代謝的調(diào)控[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2000, 27(6): 391-395.

[31] LINCOLNTAIZ, EDUARDOZEIGER. 植物生理學(xué). 第5版[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2015.

[32] Ishikawa T, Shigeoka S. Recent advances in ascorbate biosynthesis and the physiological significance of ascorbate peroxidase in photosynthesizing organisms[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2008, 72(5): 1 143-1 154.

[33] Ishikawa T, Dowdle J, Smirnoff N. Progress in manipulating ascorbic acid biosynthesis and accumulation in plants[J]. Physiologia Plantarum, 2006, 126: 343-355.

[34] Pignocchi C, Foyer C H. Apoplastic ascorbate metabolism and its role in the regulation of cell signalling[J]. Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6(4): 379-389.

[35] 燕輝, 彭曉邦, 薛建杰. NaCl脅迫對(duì)花棒葉片光合特性及游離氨基酸代謝的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 23(7): 1 790-1 796.

Study on Diversity of Endophytic Bacteria Community Structure and Prediction of Gene Function in Medicinalof Li nationality

BU Xuanyin1,2YANG Weili1

(1. Hainan Medical University, Haikou, Hainan 571199, China; 2. Sanming Medical and Polytechnic Vocational College, Sanming, Fujian 365000, China)

The high-throughput 16S rRNA sequencing technology was used to analyze the community diversity of endophytic bacteria in the root, stem, leaf, and epidermis ofcollected from five regions in Hainan Province, and the potential function of endophytic bacteria was analyzed by PICRUSt. The results showed that 3 759 378 effective sequences were obtained from the high-quality sequence fragments in the 16S rRNA V3-V4 region, divided into 3 475 OUTs. Endophytic bacteria were divided into 30 phyla, 82 classes, 183 orders, 326 families, and 764 genera, with rich flora diversity and significant differences among groups. The community structure of endophytic bacteria was analyzed, and the common dominant bacterial genera were(25.11%),(15.16%),(7.06%),(5.03%), and(4.60%). The root-dominant bacteria were,,,and. The dominant stem fungi were,,and. The dominant genus of leaf bacteria was. The dominant genera of Skin wereand. PICRUSt analysis showed that the endophytic bacteria in different tissues ofwere mainly involved in six biological metabolic pathways and 36 subfunctions. The gene species predicted by the secondary functional layer of endophytic bacteria genes from different tissues are unchanged, but the gene abundance is significantly different, and metabolism is a vital factor affecting the diversity and abundance of endophytic bacteria in. Revealing the changing trends and laws of the various endophytic bacteria in different tissues ofcan lay a theoretical foundation for the further application of its endophytic bacteria and fully exploit its rich microbial resources.

; endophytic bacteria; community structure; diversity; gene function

S567

A

10.12008/j.issn.1009-2196.2023.09.010

2023-02-06；

2023-02-20

海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.820RC624）。

卜宣尹（1995—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参飪?nèi)生菌研究，E-mail：1183231729@qq.com。

楊衛(wèi)麗（1979—），女，碩士，教授，主要研究方向?yàn)橹兴庂Y源研究，E-mail：731338097@qq.com。

（責(zé)任編輯 龍婭麗）