楊 衛(wèi),李媛媛,張麗柯,丁 巖

1.南陽市第一人民醫(yī)院河南省腫瘤分子生物學(xué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南陽 473001; 2.南陽市第一人民醫(yī)院放射腫瘤科,南陽 473000

宮頸癌按照組織形態(tài),可分為宮頸鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、腺鱗癌等,其中有兩類最為常見,分別是鱗狀細(xì)胞癌和腺癌,約占宮頸癌的95%[1]。牛蒡子苷(arctiin,ARC)是提取自傳統(tǒng)中藥牛蒡子的有效活性成分之一,具有疏風(fēng)解熱、祛瘀解毒等功效[2],可發(fā)揮抗炎、抗腫瘤等藥理活性[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)ARC對結(jié)腸癌、胃癌、鼻咽癌等惡性腫瘤均具有較好的抗腫瘤活性[6]。本研究旨在探討ARC對宮頸癌細(xì)胞的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YT-CJ-2NB型超凈工作臺(北京亞泰隆醫(yī)療器械公司);MB-530型多功能酶標(biāo)分析儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 試藥

牛蒡子苷(ARC,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%,批號A25101,規(guī)格為20 mg,上海吉至生化科技有限公司);3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)自噬抑制劑(批號R004697,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司);兔抗β-actin(批號K200058M)、兔抗磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K,批號IM0190)、蛋白激酶B(protein kenase B,Akt,批號K004047P)、哺乳動(dòng)物雷帕霉菌靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR,批號IR0010)、哺乳動(dòng)物ATG6同源蛋白(mammalian ATG6 homologous protein,Beclin-1,批號ASK-001)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein light chain 3B,LC3B,批號K008014P)一抗及山羊抗兔二抗免疫球蛋白-G(immunoglobulin G,IgG,批號SE134),均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的青霉素-鏈霉素)。取對數(shù)期細(xì)胞接種于96孔板中,每孔約1×105個(gè)細(xì)胞,分別給予終濃度為0、10、20、40、80 μmol·L-1ARC,在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,孵育4 h,酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm處的吸光度(A)值,以篩選最佳濃度。

2.2 細(xì)胞分組

將HeLa細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、ARC組和ARC聯(lián)合3-MA組。顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長良好且密度適宜即可開始干預(yù),ARC組給予40 μmol·L-1ARC培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù),ARC聯(lián)合3-MA組給予含有40 μmol·L-1ARC和5 mmol·L-13-MA的培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù),對照組給予等量完全培養(yǎng)液。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

2.5 g·L-1胰蛋白酶消化各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1,將細(xì)胞接種于96孔板中,每孔100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。另設(shè)空白組(僅含培養(yǎng)液),CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況(同2.1項(xiàng))。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)]×100%。設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

2.4 DCFH-DA法檢測細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species ,ROS)水平

取對數(shù)期細(xì)胞,用胰蛋白酶消化,按1×105個(gè)·mL-1接種于6孔板中,加入對應(yīng)藥物放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS清洗細(xì)胞,加入配制好的DCFH-DA溶液5 μmol·L-1,孵育1 h。PBS重懸,上機(jī)檢測,于488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長處進(jìn)行檢測。于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光情況并拍照。

2.5 透射電子顯微鏡觀察自噬小體

取對數(shù)期細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液(1×105個(gè)·mL-1),加入對應(yīng)藥物放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞固定于戊二醛中,用切片機(jī)制成玻片,滴加檸檬酸鉛進(jìn)行染色,用透射電鏡進(jìn)行觀察。

2.6 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平

取各組細(xì)胞,用TRIZOL法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。配制反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA樣品2 μL,RNase Free ddH2O 6 μL,進(jìn)行擴(kuò)增。95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,40次。以β-actin作為內(nèi)參,2-△△CT法計(jì)算各樣本之間基因表達(dá)差異。引物設(shè)計(jì)為PI3K-F(5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3′)、PI3K-R:(5′-GGCTACAGTAGTGGGCTTGG-3′);Akt-F:(5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′)、Akt-R:(5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′);mTOR-F:(5′-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3′)、mTOR-R:(5′-GCTGGTCATAGAAGCGAGTAGAC-3′);β-actin-F:(5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′)、β-actin-R:(5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′)。

2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測蛋白表達(dá)水平

取各組細(xì)胞,消化離心后接種于6孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后加入對應(yīng)藥物進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,加入RIPA裂解液100 μL于冰上裂解,提取總蛋白。加入配制好的BCA顯色液,用BCA法(bicinchoninic acid assay)檢測蛋白濃度,統(tǒng)一蛋白上樣量40 μg,進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PDVF膜上,封閉液(5 g·L-1脫脂奶粉)封閉2 h,加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,漂洗,加入二抗(1∶2 000)封閉2 h,ECL顯影成像,凝膠成像分析儀采集圖像,Image J軟件分析結(jié)果。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ARC對細(xì)胞增殖能力的影響

不同濃度ARC作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞48 h后,各組細(xì)胞的增殖能力均明顯降低。與0 μmol·L-1ARC組比較,10、20、40、80 μmol·L-1ARC組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)。ARC作用于HeLa細(xì)胞48 h的IC50約為40 μmol·L-1,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)以40 μmol·L-1為統(tǒng)一給藥濃度。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖能力的比較 n=3)

3.2 各組細(xì)胞增殖抑制率的比較

與24 h比較,48 h后ARC組、ARC聯(lián)合3-MA組的細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)。與ARC組比較,干預(yù)24 h后,ARC聯(lián)合3-MA組的細(xì)胞增殖抑制率降低(P<0.05)。干預(yù)48 h后,ARC聯(lián)合3-MA組的細(xì)胞增殖抑制率降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖抑制率的比較

3.3 各組細(xì)胞ROS水平的比較

DCFH-DA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,ARC組細(xì)胞ROS水平明顯降低(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細(xì)胞ROS水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞ROS水平的比較

3.4 透射電鏡觀察自噬小體

用透射電鏡觀察各組細(xì)胞自噬小體的形態(tài)。對照組細(xì)胞可見正常長條形線粒體結(jié)構(gòu),且脊結(jié)構(gòu)清晰;與對照組比較,ARC組細(xì)胞可觀察到含有細(xì)胞內(nèi)容物的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體,且呈聚集狀態(tài),展現(xiàn)自噬的發(fā)生過程,其線粒體脊結(jié)構(gòu)模糊,呈破碎狀;ARC聯(lián)合3-MA組細(xì)胞自噬小體的數(shù)量明顯降低,未出現(xiàn)自噬小體聚集現(xiàn)象,線粒體結(jié)構(gòu)清晰。見圖1。

3.5 PI3K/Akt/mTOR mRNA水平的比較

結(jié)果顯示,與對照組比較,ARC組細(xì)胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細(xì)胞PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 各組宮頸癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR mRNA水平的比較

3.6 PI3K/Akt/mTOR蛋白水平的比較

與對照組比較,ARC組細(xì)胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細(xì)胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組宮頸癌細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR蛋白水平的比較

3.7 自噬蛋白水平的比較

與對照組比較,ARC組細(xì)胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與ARC組比較,ARC聯(lián)合3-MA組細(xì)胞Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表6。

表6 各組宮頸癌細(xì)胞自噬蛋白水平的比較

4 討論

宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展相對緩慢,從HPV感染到宮頸癌一般需要經(jīng)歷4個(gè)階段,分別是HPV感染、持續(xù)性的病毒感染引起宮頸細(xì)胞上皮細(xì)胞產(chǎn)生病變、宮頸癌上皮細(xì)胞發(fā)生癌前病變和宮頸浸潤癌[7-8]。

牛蒡子含有多種生物活性成分,其主要成分包括揮發(fā)油、油脂類、木脂素類和生物堿,具有藥用價(jià)值的ARC就屬于提取自牛蒡子的木脂素類[9-10]。ARC在抑制腫瘤方面具有良好作用,可通過抑制腫瘤惡性增殖、增強(qiáng)腫瘤對化療藥物的敏感性和減少腫瘤新生血管生成抑制腫瘤的發(fā)展[11-13]。

本研究用不同濃度ARC處理體外培養(yǎng)的人宮頸癌細(xì)胞HeLa,篩選出合適的作用濃度,進(jìn)一步探討ARC對宮頸癌細(xì)胞惡性增殖的影響。結(jié)果顯示,用不同濃度ARC作用于HeLa細(xì)胞時(shí),細(xì)胞增殖活性隨ARC濃度升高而逐漸降低,以80 μmol·L-1ARC對HeLa細(xì)胞增殖能力的抑制作用最為明顯,半數(shù)抑制濃度IC50為40 μmol·L-1。表明不同濃度ARC能夠顯著抑制宮頸癌細(xì)胞增殖能力,降低腫瘤生長活性。用ARC聯(lián)合自噬抑制劑3-MA后表現(xiàn)出細(xì)胞增殖抑制率降低,表明自噬抑制劑的添加影響了ARC對宮頸癌細(xì)胞增殖的抑制作用。在檢測細(xì)胞ROS水平時(shí)發(fā)現(xiàn),用ARC處理可以大幅度降低細(xì)胞的ROS水平,但這一作用在添加了3-MA后呈降低趨勢,進(jìn)一步驗(yàn)證ARC對宮頸癌細(xì)胞的抑制作用與細(xì)胞自噬水平有關(guān)。

自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡,為其他生理活動(dòng)提供能量,PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平的主要通路[14-15]。自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量明顯下降,可見高水平的細(xì)胞自噬可以抑制腫瘤的發(fā)展[16-17]。在本研究中,用ARC處理的細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)水平及PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)水平均呈降低趨勢,同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平也顯著升高。Beclin-1作為自噬水平的負(fù)調(diào)控因子,高度參與細(xì)胞自噬水平的調(diào)控過程[18-20]。表明ARC能夠抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平,結(jié)合自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)水平的升高,細(xì)胞自噬水平升高,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,而這一趨勢在添加3-MA后受到抑制,證實(shí)ARC通過影響PI3K/Akt/mTOR信號通路活性調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平。

綜上所述,ARC對人宮頸癌細(xì)胞HeLa的惡性增殖有一定的抑制作用,并能提高宮頸癌細(xì)胞自噬水平,可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞ROS水平、影響ROS/PI3K/Akt/mTOR信號通路發(fā)揮作用的。