鄒珊珊,鄒 珊,于小雪,馬志超

1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院藥品供應(yīng)科,赤峰 024000;2.赤峰工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院宣傳科,赤峰 024000;3.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程部,赤峰 024000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥,多發(fā)于糖尿病病程在5年以上患者,隨著病程的延長(zhǎng)并發(fā)率逐漸升高,常合并視網(wǎng)膜病變及外周神經(jīng)病變,并誘發(fā)膀胱炎、腎盂腎炎等,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為腎衰竭,是糖尿病患者的主要死亡原因之一[1]。我國(guó)是DN發(fā)病大國(guó),總患病數(shù)已超過2 500萬,且近年來隨著膳食結(jié)構(gòu)的改變,其增長(zhǎng)尤為明顯,已成為我國(guó)公共衛(wèi)生事業(yè)最嚴(yán)峻的問題之一[2]。目前,臨床治療DN多以控制血糖為基礎(chǔ),調(diào)整飲食習(xí)慣及生活方式,配合服用降壓及抑制尿蛋白排出藥物,但此法并不能完全阻止腎功能的惡化[3]。西紅花苷是提取自中藥西紅花的一種中藥單體,具有抗炎、抗氧化、降血壓及降血脂等多種生物學(xué)活性。有學(xué)者認(rèn)為,西紅花苷可抑制腎臟組織氧化應(yīng)激及炎癥損傷,從而對(duì)牙周炎引發(fā)的腎損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[4]。目前關(guān)于其對(duì)DN的治療作用鮮有報(bào)道,且缺乏對(duì)應(yīng)的機(jī)制研究。本研究通過建立DN大鼠模型,觀察西紅花苷對(duì)DN的保護(hù)作用,并探討可能的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS-280全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);Varioskan LUX酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司);SZX16顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 試藥

西紅花苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號(hào)YM-ZY2104,上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司);Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factorκB,NF-κB) p65通路激活劑脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,批號(hào)A-01K98917,上海撫生實(shí)業(yè)有限公司);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號(hào)ml002859)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β,批號(hào)ml037361)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;兔抗大鼠TLR4(批號(hào)ab217274)、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88,批號(hào)ab219413)、p-NF-κB p65(批號(hào)ab239882)、NF-κB p65(批號(hào)ab19870)一抗均購自英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

55只SD大鼠,SPF級(jí),雄性,8周齡,體質(zhì)量為(220±20) g,購自上海靈暢生物科技有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0003。

2 方法

2.1 DN模型復(fù)制

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后建立DN模型,高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg·kg-1溶于檸檬酸鹽緩沖液),繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng),72 h后檢測(cè)尾靜脈血糖及尿蛋白排泄,隨機(jī)血糖>16.7 mmol·L-1且24 h尿蛋白排泄率>30 mg則表明模型建立成功[5]。

2.2 干預(yù)方式

45只大鼠復(fù)制DN模型,成功30只,隨機(jī)分為DN組、西紅花苷組、西紅花苷聯(lián)合LPS組,各10只;另取10只大鼠,基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周,一次性腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液,繼續(xù)用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),設(shè)為對(duì)照組。模型復(fù)制成功次日,參照文獻(xiàn)[6-7]方法,西紅花苷聯(lián)合LPS組灌胃西紅花苷(40 mg·kg-1溶于生理鹽水),2 h后尾靜脈注射LPS(0.4 mg·kg-1溶于生理鹽水);西紅花苷組灌胃西紅花苷(40 mg·kg-1溶于生理鹽水),2 h后尾靜脈注射等量生理鹽水;對(duì)照組、DN組灌胃等量生理鹽水,2 h后尾靜脈注射等量生理鹽水。每日1次,干預(yù)2周。干預(yù)期間觀察大鼠飲食、飲水、排尿量、精神狀態(tài)等一般情況。

2.3 糖脂指標(biāo)、腎功能指標(biāo)的檢測(cè)

末次干預(yù)結(jié)束后次日采集大鼠24 h尿液,經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h尿蛋白定量及晨尿微量白蛋白與尿肌酐比值(albumin/creatinine ratio,UACR);采尿后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,抽取空腹腹主動(dòng)脈血,低溫以3 000 r·min-1離心5 min(離心半徑為8 cm),收集血清,一部分用葡萄糖氧化酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG),用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)空腹胰島素(fasting se-rum lisulin,FINS)、三酰甘油(triglycerides,TG)、總膽固醇(triglycerides,TC)水平,用免疫透射比濁法檢測(cè)尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)及血清肌酐(serum creatinine,Scr)水平;另一部分4 ℃冷藏保存用于炎癥因子水平的檢測(cè)。

2.4 炎癥因子水平的檢測(cè)

取冷藏保存的腹主動(dòng)脈血清,用ELISA法檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平,按照試劑盒說明書要求設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟,用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度值,在坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算血清TNF-α、IL-1β的質(zhì)量濃度。

2.5 組織取材

采血后頸椎脫臼處死大鼠,冰上迅速摘取雙腎,切取部分腎臟組織投入體積分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛,24 h后脫水、透明、浸蠟、包埋,切為厚4 μm的病理切片,用于HE染色,另取部分腎臟組織置于-80 ℃冰箱中冷凍保存,用于蛋白檢測(cè)。

2.6 HE染色檢測(cè)腎組織病理變化

取腎組織切片,脫蠟至水,蒸餾水沖洗,移至蘇木素溶液中染色5 min,蒸餾水沖洗,滴加體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸乙醇分化,經(jīng)碳酸氫鈉溶液漂洗、伊紅溶液二次染色,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,滴加中性樹脂封片,于光鏡下觀察腎組織病理變化并拍照記錄。

2.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)腎組織TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)量

取冷凍保存的腎組織,剪碎后用組織研磨機(jī)充分研磨,PBS勻漿,RIPA液裂解,低溫以10 000 r·min-1離心12 min(離心半徑為15 cm),取其上清經(jīng)BCA(bicinchoninic acid assay)試劑盒定量蛋白。取40 μg樣本蛋白,加入5倍量SDS上樣緩沖液并混勻,加熱變性蛋白,行凝膠電泳分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉,加入1∶500稀釋后兔抗大鼠TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65一抗,4 ℃冷藏過夜,洗膜加入稀釋二抗,室溫孵育2 h二次洗膜,ECL成像,經(jīng)凝膠分析儀掃描并分析各條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,分析TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)水平,計(jì)算p-NF-κB p65/NF-κB p65。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 糖脂指標(biāo)

與對(duì)照組比較,DN組血液FPG、FINS、TG、TC水平均升高(P<0.05);與DN組比較,西紅花苷組血液FPG、FINS、TG、TC水平均降低(P<0.05);與西紅花苷組比較,西紅花苷聯(lián)合LPS組血液FPG、FINS、TG、TC水平均升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠糖脂指標(biāo)的比較

3.2 腎功能指標(biāo)

與對(duì)照組比較,DN組24 h尿蛋白、UACR、Scr、BUN水平均升高(P<0.05);與DN組比較,西紅花苷組24 h尿蛋白、UACR、Scr、BUN水平均降低(P<0.05);與西紅花苷組比較,西紅花苷聯(lián)合LPS組24 h尿蛋白、UACR、Scr、BUN水平均升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腎功能指標(biāo)的比較

3.3 炎癥因子水平

與對(duì)照組比較,DN組血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05);與DN組比較,西紅花苷組血清TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05);與西紅花苷組比較,西紅花苷聯(lián)合LPS組血清TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的比較

3.4 腎組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)完整,腎小球形態(tài)規(guī)則,基底膜厚度正常,系膜區(qū)寬度正常,間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);DN組腎組織結(jié)構(gòu)被破壞,腎小球肥大,基底膜增厚,系膜區(qū)增寬,間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),上皮細(xì)胞空泡壞死;西紅花苷組、西紅花苷聯(lián)合LPS組腎組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,腎小球輕微腫脹,基底膜輕微增厚,系膜區(qū)增寬不明顯,可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),部分上皮細(xì)胞空泡變性,西紅花苷組病理改善更為明顯。見圖1。

注:A.對(duì)照組;B.DN組;C.西紅花苷組;D.西紅花苷聯(lián)合LPS組。

3.5 腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB p65

與對(duì)照組比較,DN組腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量,p-NF-κBp65/NF-κBp65升高(P<0.05);與DN組比較,西紅花苷組腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量,p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(P<0.05);與西紅花苷組比較,西紅花苷聯(lián)合LPS組腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量,p-NF-κB p65/NF-κB p65升高(P<0.05)。見表4、圖2。

注:A.對(duì)照組;B.DN組;C.西紅花苷組;D.西紅花苷聯(lián)合LPS組。

表4 各組腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB p65的比較

4 討論

DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,通常認(rèn)為是由糖代謝紊亂、腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、基因易感性及炎癥反應(yīng)等因素相互作用所致,其中炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是其主要機(jī)制之一[8-9]。持續(xù)高血糖加重腎臟糖負(fù)擔(dān),過量活性氧打破氧化應(yīng)激平衡,炎癥因子大量蓄積,促進(jìn)纖維連接蛋白表達(dá),增加腎小球血管通透性及提升其濾過能力,加之腎臟高灌注的特性,導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管表面積增大,腎臟固有細(xì)胞損傷,進(jìn)而加快DN的發(fā)病進(jìn)程[10]。因此,抑制過度的炎癥反應(yīng)是治療DN的關(guān)鍵。

尿微量白蛋白是一種小分子量蛋白,可穿過腎小球?yàn)V過膜,在高血糖的作用下濾過膜通透性增加,造成微量白蛋白持續(xù)性高溢出,其與肌酐具有高穩(wěn)定性及留取方便的優(yōu)點(diǎn),因此UACR是臨床診斷DN的重要指標(biāo)之一[11]。西紅花取自鳶尾科植物西紅花干燥柱頭,可活血、解毒、化瘀,西紅花苷是西紅花中的一種類胡蘿卜素,可擴(kuò)張腎毛細(xì)血管,增加腎血流量,促進(jìn)免疫復(fù)合物吸收及炎癥損害修復(fù)[12-13]。研究顯示,西紅花苷能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,降低2型糖尿病小鼠血糖水平,抑制糖尿病進(jìn)展[14]。本研究結(jié)果顯示,與DN組比較,西紅花苷組血液FPG、FINS、TG和TC水平、24 h尿蛋白、UACR、Scr和BUN水平及血清TNF-α、IL-1β水平均降低,腎臟組織病理性損傷減輕,表明西紅花苷可降糖、降脂、抑制炎癥、改善DN大鼠腎功能并抑制病情發(fā)展。

TLR4/NF-κB p65通路是機(jī)體重要的免疫炎癥通路之一,在多種器官組織炎癥損傷發(fā)病過程中扮演重要角色[15-17]。TLR4是一種微生物跨膜識(shí)別受體,可介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng),其識(shí)別外源配體后,與其轉(zhuǎn)接蛋白MyD88結(jié)合,誘導(dǎo)下游效應(yīng)蛋白NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核并磷酸化,促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥介質(zhì)并誘導(dǎo)纖維相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄,從而誘發(fā)過量炎癥反應(yīng),加劇腎損傷[18]。ZHANG Q等[19]認(rèn)為,抑制TLR4/NF-κB通路可抑制炎癥反應(yīng),改善急性腎損傷小鼠的病理損傷。此外,另有研究顯示,西紅花苷可通過NF-κB通路抑制草酸引起的腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,DN組腎組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB p65升高,經(jīng)西紅花苷干預(yù)后均降低,且在西紅花苷基礎(chǔ)上增用TLR4/NF-κB p65通路激動(dòng)劑LPS可減弱西紅花苷對(duì)DN大鼠腎臟的保護(hù)作用,表明該通路在DN中異常激活,西紅花苷可能通過抑制該通路保護(hù)DN大鼠腎臟。

綜上所述,西紅花苷可改善糖脂代謝及腎功能,減輕炎癥反應(yīng),從而抑制DN進(jìn)展,推測(cè)其作用機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路有關(guān)。