■ 馬吉喆 吳雨來(lái) 張林梅 葉倩穎 陸筑鳳 李加友* 徐 濤

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江杭州 310018；2.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001)

隨著生物工程技術(shù)、畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的發(fā)展以及中國(guó)居民對(duì)高蛋白類食品需求量的增加[1]，酵母類產(chǎn)品的開發(fā)利用已成為飼料工業(yè)的重中之重。中國(guó)飼料工業(yè)協(xié)會(huì)明確指出：我國(guó)的高蛋白飼料在配方結(jié)構(gòu)、產(chǎn)品創(chuàng)新中更加趨向于酵母培養(yǎng)物類的飼料添加劑[2-3]。酵母飼料是利用酵母的新陳代謝，通過(guò)微生物發(fā)酵技術(shù)制成含有活菌、適口性良好、安全、無(wú)污染、無(wú)殘留的酵母培養(yǎng)物[4-5]。研究報(bào)道酵母飼料[6-7]不僅具有原料來(lái)源廣泛、生產(chǎn)速度快、蛋白質(zhì)含量高的優(yōu)點(diǎn)，而且可以調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、提高飼料利用率、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力[8-12]，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。但酵母存在的培養(yǎng)產(chǎn)量低、效率差等問(wèn)題，使得酵母鉻、酵母葡聚糖、生物多肽等相關(guān)酵母飼料成本過(guò)高[13-15]。研究表明，提高酵母的生長(zhǎng)性能主要采用添加輔助因子[16]和培養(yǎng)基優(yōu)化改良[17]等方法。其中，通過(guò)添加海藻糖等輔助因子可以增強(qiáng)酵母免疫力，使酵母具有高生物活性，但價(jià)格昂貴不便于投入到工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中。因此有必要進(jìn)一步研究酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分之間的相互作用，通過(guò)添加發(fā)酵桔皮和酵母培養(yǎng)基優(yōu)化相結(jié)合，觀測(cè)酵母的生長(zhǎng)趨勢(shì)變化，從而在酵母飼料工業(yè)中做到降本增效、改善生產(chǎn)工藝、提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

桔皮，寧波市象山華宇罐頭廠；葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）1118，嘉興學(xué)院發(fā)酵食品開發(fā)與分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），安琪酵母股份有限公司；葡萄糖（食品級(jí)），浙江一諾生物科技有限公司；酵母浸膏，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿素（純度≥99.5%）、無(wú)水硫酸鎂（純度≥99.5%）、磷酸二氫鉀（純度99%）、蛋白胨，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖100、酵母浸膏10、尿素2、無(wú)水硫酸鎂2 、磷酸二氫鉀5。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-200B 型全溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；CT14RD11臺(tái)式離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FR124CN 型分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 發(fā)酵桔皮的制備

稱取適量干燥桔皮，研磨過(guò)篩（10目篩網(wǎng)）置于發(fā)酵桶中，加入桔皮粉干重1.5 倍質(zhì)量的水，混合均勻，用直徑1 cm打孔器從匍枝根霉1118的PDA固體培養(yǎng)基上取2 個(gè)菌苔，加入培養(yǎng)基中，使菌種與桔皮粉充分接觸。于28 ℃恒溫培養(yǎng)15 d。對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾除渣，制成浸膏狀水溶性發(fā)酵桔皮（干物質(zhì)含量21%），4 ℃下冷藏保存，備用。

2.2 酵母培養(yǎng)

菌種活化：將1 g釀酒酵母活性干酵母加入100 mL葡萄糖含量為2%的培養(yǎng)基中，38 ℃、220 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)30 min，對(duì)菌種進(jìn)行活化，制得種子菌液。

釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)：取1 mL 種子菌液接種至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)。

2.3 酵母濃度測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中1 mL 的樣液于顯微鏡下計(jì)數(shù)，將樣液分別梯度稀釋10、20、30、40、50 倍，并測(cè)定OD600，繪制OD600與對(duì)應(yīng)酵母活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 檢測(cè)方法

參照參考文獻(xiàn)[18]，采用吸光光度法對(duì)發(fā)酵液的生物量進(jìn)行測(cè)定。并將發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋至1/20，利用分光光度計(jì)于600 nm 處測(cè)定吸光度，結(jié)果記為OD600，并以此讀數(shù)作為培養(yǎng)基中的酵母濃度。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 單因素試驗(yàn)

以釀酒酵母初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別考察發(fā)酵桔皮、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏等不同添加量對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響，每次處理只改變初始發(fā)酵培養(yǎng)基的一個(gè)因子。按1%（W/V）接入活化釀酒酵母，28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h檢測(cè)OD600，確定各單因素的最佳水平。

2.4.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵桔皮（A）、葡萄糖（B）、蛋白胨（C）及酵母浸膏（D）為考察對(duì)象，采用L8(2)7正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化。各因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平（g/L）

2.4.3 Box-Benhnken響應(yīng)面分析

在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析對(duì)發(fā)酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏（G）等三個(gè)主要影響因子進(jìn)行優(yōu)化。各因素Box-Benhnken設(shè)計(jì)方法與水平見表2。

表2 響應(yīng)面分析各因素與水平(g/L）

2.4.4 桔皮發(fā)酵物成分檢測(cè)

用常規(guī)方法檢測(cè)桔皮發(fā)酵物中橙皮苷[19]、黃酮[20]等藥效成分含量以及多糖[21]、蛋白質(zhì)[22]、脂肪[23]等營(yíng)養(yǎng)成分。

2.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)進(jìn)行5 次平行測(cè)定，借助Minitab 16、Design-Expert 13.0 和Origin 2021 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05 為差異顯著，P>0.05 為差異不顯著，0.05≤P<0.10表示具有差異顯著趨勢(shì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 培養(yǎng)基組分對(duì)吸光度指標(biāo)的影響

見表3，對(duì)發(fā)酵樣液中酵母活菌進(jìn)行鏡檢并按梯度進(jìn)行稀釋。記錄活菌數(shù)與OD600的對(duì)應(yīng)變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.201 27x-0.129 62，其中R2為99.157。表明采用OD600作為酵母生物量的測(cè)定中，培養(yǎng)基組分對(duì)吸光度沒(méi)有影響。

圖1 酵母活菌數(shù)對(duì)應(yīng)OD600標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 活菌記錄結(jié)果

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.2.1 發(fā)酵桔皮濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加相關(guān)的輔助因子能夠促進(jìn)酵母生長(zhǎng)、增強(qiáng)代謝、彌補(bǔ)酵母營(yíng)養(yǎng)缺失的物質(zhì)[24]。在實(shí)驗(yàn)室對(duì)桔皮進(jìn)行發(fā)酵處理后得到其水溶性浸膏狀物質(zhì)，并將其作為生長(zhǎng)刺激劑添加到原始培養(yǎng)基中，研究不同濃度的發(fā)酵桔皮對(duì)酵母生長(zhǎng)代謝的影響，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果表明不同濃度的發(fā)酵桔皮可以不同程度提高培養(yǎng)體系中的釀酒酵母活菌數(shù)量，當(dāng)發(fā)酵桔皮初提物濃度為2 g/L 時(shí)效果最好，酵母活菌檢測(cè)值從0.302 提高到0.561，說(shuō)明發(fā)酵桔皮對(duì)酵母的生長(zhǎng)代謝具有良好的刺激作用。

圖2 發(fā)酵桔皮添加濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

3.2.2 葡萄糖濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

葡萄糖是微生物生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，初始濃度對(duì)生長(zhǎng)和代謝都有重要影響[25]。在發(fā)酵桔皮濃度為2 g/L 的條件下，研究不同濃度的葡萄糖對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)葡萄糖濃度為100 g/L 時(shí)，酵母濃度提高到0.572；繼續(xù)添加葡萄糖至160 g/L 時(shí)酵母濃度下降明顯。說(shuō)明葡萄糖濃度過(guò)高對(duì)酵母對(duì)生長(zhǎng)具有抑制作用。

圖3 葡萄糖濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

3.2.3 酵母浸膏濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

酵母浸膏富含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是釀酒酵母培養(yǎng)基的常用組分。通過(guò)改變?cè)寂囵B(yǎng)基中酵母浸膏的添加量，考察酵母浸膏對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖4。當(dāng)酵母浸膏添加量為12 g/L 時(shí)，酵母濃度最高可達(dá)0.609；酵母浸膏繼續(xù)增加菌體濃度稍有下降。

圖4 酵母浸膏濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

3.2.4 蛋白胨濃度對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

不同微生物對(duì)氮源的需求不盡相同，蛋白胨是酵母生長(zhǎng)的常用氮源[26]。蛋白胨添加量對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響見圖5，結(jié)果表明：在蛋白胨添加量為8 g/L時(shí)，酵母濃度達(dá)到最高值0.638。但是，在考察的蛋白胨濃度范圍內(nèi)（7～11 g/L），酵母濃度的最大差異僅為3%，變化并不顯著。

圖5 蛋白胨濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

3.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，根據(jù)各單因素的最佳添加量，并結(jié)合不同因素之間的交互影響，采用7因素2 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表4。根據(jù)極差（R）大小比較不同因素對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響：發(fā)酵桔皮（A）>葡萄糖（B）>葡萄糖與發(fā)酵桔皮的交互作用AB>酵母浸膏（D）>蛋白胨（C）；另一方面，葡萄糖和發(fā)酵桔皮具有交互作用，可能是發(fā)酵桔皮有利于促進(jìn)葡萄糖的代謝，具體機(jī)理有待深入研究。從表4 可以看出，培養(yǎng)基各因子的最優(yōu)組合為A2B2C2D1。但蛋白胨濃度的影響水平只有0.02，相對(duì)較小，因此進(jìn)行單因素最佳水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)時(shí)不作為主要考慮因素。理論最優(yōu)培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖110、蛋白胨9、酵母浸膏11、發(fā)酵桔皮2.2、無(wú)水硫酸鎂2、尿素2、磷酸二氫鉀5。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

3.4 Box-Benhnken響應(yīng)面結(jié)果及分析

3.4.1 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果分析

設(shè)OD600讀數(shù)（Z）為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)原理，考察發(fā)酵桔皮（E）、葡萄糖（F）、酵母浸膏（G）三個(gè)因素對(duì)OD600讀數(shù)（Z）的影響。OD600讀數(shù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。由表5可以看出，不同添加量的E、F、G對(duì)OD600讀數(shù)（Z）的影響各不相同。

表5 Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果分析

3.4.2 OD600讀數(shù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)回歸模型及方差分析

將OD600讀數(shù)（Z）響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，結(jié)果見表6。

表6 各因素影響的主效應(yīng)分析

由表6 可以看出，目標(biāo)函數(shù)R的響應(yīng)面模型P值遠(yuǎn)小于0.01，表示模型的顯著性極好，所得多項(xiàng)回歸方程可以準(zhǔn)確反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。模型中的自變量一次項(xiàng)變量E、F、G和二次項(xiàng)EF、EG、E2、F2、G2的P值都小于0.05，說(shuō)明E、F、G是重要的模型項(xiàng)且具有顯著作用。其中預(yù)測(cè)系數(shù)R2與決定系數(shù)R2差值為0.015 7 表明該模型的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的合理一致性，準(zhǔn)確性>4，表示該單因素響應(yīng)面模型信號(hào)充足，可以用于模型預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)。其決定系數(shù)R2為0.996 1，表明99.61%以上的響應(yīng)值均可由該模型解釋。因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

通過(guò)Design-Expert 13軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型：

式中：Z——OD600讀數(shù)；

E——發(fā)酵桔皮濃度（g/L）；

F——葡萄糖濃度（g/L）；

G——酵母浸膏濃度（g/L）。

3.4.3 三維響應(yīng)面分析

根據(jù)二次多項(xiàng)回歸方程繪制出響應(yīng)面，發(fā)酵桔皮濃度與葡萄糖濃度的響應(yīng)曲面如圖6，發(fā)酵桔皮濃度與酵母浸膏濃度的響應(yīng)曲面如圖7，葡萄糖濃度與酵母浸膏濃度的響應(yīng)曲面如圖8。

圖6 E與F響應(yīng)面3D建模

圖7 E與G響應(yīng)面3D建模

圖8 F與G響應(yīng)面3D建模

根據(jù)發(fā)酵桔皮濃度、葡萄糖濃度與酵母浸膏濃度兩兩之間的響應(yīng)曲面表明，在發(fā)酵桔皮濃度E坐標(biāo)軸上，OD600讀數(shù)變化最快，而在酵母浸膏濃度G的坐標(biāo)軸方向，OD600讀數(shù)變化較慢，說(shuō)明發(fā)酵桔皮濃度的影響水平較大。其中圖6 的響應(yīng)面扭曲最大，說(shuō)明發(fā)酵桔皮濃度與葡萄糖濃度之間是具有明顯交互作用；圖7 的響應(yīng)面扭曲程度也是顯著的，說(shuō)明發(fā)酵桔皮濃度與酵母浸膏濃度之間是具有交互作用。其中EF的P值小于0.05，證實(shí)正交試驗(yàn)中發(fā)酵桔皮濃度和葡萄糖濃度之間的交互影響作用，說(shuō)明發(fā)酵桔皮的添加對(duì)OD600讀數(shù)的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其中二次項(xiàng)EF、EG的P值小于一次項(xiàng)E、F的P值，且P值均小于0.05；說(shuō)明該發(fā)酵桔皮對(duì)培養(yǎng)基中主要成分的交互影響作用大于其自身，表明發(fā)酵桔皮的添加可以刺激釀酒酵母的生長(zhǎng)與代謝。

3.5 酵母發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

3.5.1 優(yōu)化前后酵母數(shù)量的對(duì)比

通過(guò)Design-Expert 13軟件優(yōu)化結(jié)果見圖9，在此預(yù)測(cè)條件下酵母濃度為0.709，具有97.9%的可信度。通過(guò)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行培養(yǎng)后酵母濃度為0.695，達(dá)到了響應(yīng)面分析預(yù)測(cè)值的98.3%；相對(duì)于不添加發(fā)酵桔皮的優(yōu)化培養(yǎng)基，酵母濃度提高了37.4%；與不添加發(fā)酵桔皮的初始培養(yǎng)基相比，酵母濃度提高了130%（見圖10）。

圖9 響應(yīng)面模型優(yōu)化結(jié)果

圖10 優(yōu)化前后釀酒酵母活菌對(duì)比

3.5.2 酵母生長(zhǎng)曲線繪制

通過(guò)Design-Expert 13 軟件優(yōu)化結(jié)果，表明酵母發(fā)酵最佳培養(yǎng)基為葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、發(fā)酵桔皮濃度1.906 g/L、無(wú)水硫酸鎂2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L?；陧憫?yīng)面分析得到的最優(yōu)培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母，以添加發(fā)酵桔皮的培養(yǎng)基為試驗(yàn)組，不添加發(fā)酵桔皮的培養(yǎng)基為對(duì)照組，繪制出釀酒酵母生長(zhǎng)曲線，如圖11 所示。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵桔皮添加能夠在各個(gè)時(shí)間段明顯提高酵母活菌數(shù)量，并且縮短酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間。

圖11 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線

3.6 桔皮發(fā)酵物成分檢測(cè)結(jié)果

發(fā)酵桔皮與未發(fā)酵桔皮中營(yíng)養(yǎng)成分比較見表7。通過(guò)對(duì)桔皮進(jìn)行發(fā)酵處理后，發(fā)酵桔皮中的脂肪含量下降51.99%，總黃酮含量、橙皮苷含量、多糖、蛋白質(zhì)含量得到了明顯的提高，使得發(fā)酵桔皮中含有更多可供酵母吸收和利用的相關(guān)物質(zhì)。

表7 發(fā)酵桔皮與未發(fā)酵桔皮營(yíng)養(yǎng)成分

4 討論

黃酮是一類具有促生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)、抗菌的天然植物化合物，其來(lái)源廣泛并且應(yīng)用前景廣闊。通過(guò)對(duì)發(fā)酵桔皮和未發(fā)酵桔皮的成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)發(fā)酵后桔皮中相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量大幅度提高，其中發(fā)酵桔皮中的總黃酮含量是未發(fā)酵桔皮的3.24倍，橙皮苷的含量為之前的1.86 倍，蛋白質(zhì)含量為之前的4.71 倍。說(shuō)明通過(guò)對(duì)桔皮進(jìn)行發(fā)酵處理后，不但桔皮中有效的中藥成分總黃酮含量得到了提高，而且降低了其中的脂肪含量，提高了多糖以及蛋白質(zhì)等可供酵母菌生長(zhǎng)的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量。其中橙皮苷是由橙皮素和蕓香糖構(gòu)成的一種重要的二氫黃酮類物質(zhì)，具有較高的抗氧化功能。使得酵母細(xì)胞的衰老速度下降，更具有生物活力，使得酵母的生長(zhǎng)速度提高。左瑞華等[27]研究發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮可以提高肉雞的平均日增重量。楊汝才等[28]在飼料中添加辣木黃酮顯著降低了雛鴨血清中丙二醛（MDA）含量。王詠梅等[29]在飼料中添加桑葉黃酮使得蝦的抗氧化性能得到提高。因此，桔皮經(jīng)過(guò)發(fā)酵后可以憑借其自身無(wú)污染、高蛋白、高抗氧化的特性作為酵母的生長(zhǎng)刺激因子用于酵母高蛋白飼料的生產(chǎn)中。

5 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)選出關(guān)鍵影響因子，結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化分析獲得了釀酒酵母培養(yǎng)基的相關(guān)數(shù)學(xué)模型，推測(cè)出最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖100.756 g/L、蛋白胨8 g/L、酵母浸膏11.906 g/L、發(fā)酵桔皮濃度1.906 g/L、無(wú)水硫酸鎂2 g/L、尿素2 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L。在此條件下酵母濃度為0.695，是初始發(fā)酵培養(yǎng)基的1.3倍。與不添加發(fā)酵桔皮的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，發(fā)酵桔皮可以提高釀酒酵母增殖速率，促進(jìn)釀酒酵母生長(zhǎng)，加快酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，是一種高效的生長(zhǎng)刺激劑。本試驗(yàn)豐富了酵母的繁殖環(huán)境，提高了酵母的發(fā)酵能力，為酵母飼料工業(yè)生產(chǎn)高蛋白飼料、提高相關(guān)酵母培養(yǎng)物產(chǎn)量以及降低生產(chǎn)成本提供一種新的途徑。