■ 朱萬燕 徐文遠(yuǎn)* 張鴻偉 倫才智 鮑春曉 徐 豪 徐久飛 王正國

（1.臨沂海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，山東臨沂 276034；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東青島 266000）

隨著人民生活水平的提高，動物源性產(chǎn)品的數(shù)量已不再是人民首要關(guān)注的問題，其質(zhì)量安全成為人民關(guān)注的重點。飼料質(zhì)量安全是影響動物源性產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素之一。阿奇霉素作為新一代大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗生素，對于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及厭氧菌都具有較好的抗菌效果，受到養(yǎng)殖業(yè)的青睞，被越來越多地作為飼料添加劑應(yīng)用在動物身上。養(yǎng)殖業(yè)不合理使用阿奇霉素，一方面可誘發(fā)耐藥菌株，通過食物鏈遷移到人體，產(chǎn)生耐藥性[1]；另一方面，人食用含有阿奇霉素殘留的動物食品后，會在體內(nèi)蓄積，損害胃腸、肝膽、血液、神經(jīng)系統(tǒng)。有關(guān)調(diào)查表明，因阿奇霉素的濫用已產(chǎn)生耐藥菌株。因此，建立飼料中阿奇霉素的檢測方法對于監(jiān)控飼料質(zhì)量安全、進(jìn)而保證食品安全具有重要意義。

獸藥殘留檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫法[2]、氣相色譜質(zhì)譜法[3]、高效液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-7]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點，成為目前積極推廣應(yīng)用的檢測方法。目前，報道較多的是關(guān)于阿奇霉素在動物性食品中的殘留檢測研究[8-10]，飼料中阿奇霉素的殘留檢測鮮有報道[11]。QuEChERS 技術(shù)因具有簡單、快速、環(huán)保、成本低等特點，已越來越多地被應(yīng)用在獸藥殘留前處理中[12-14]。本試驗以飼料為檢測基質(zhì)，以QuEChERS 方法進(jìn)行前處理，建立了飼料中阿奇霉素的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）檢測方法，方法準(zhǔn)確、簡單、快速、省時省力，可以為飼料中阿奇霉素的安全監(jiān)督提供技術(shù)支持，從而有效控制動物源性產(chǎn)品污染。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290-6470 型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，購自美國Agilent 公司；CR22GⅢ高速冷凍離心機，購自日本HITACHI 公司；ULTRA-TURRAX T25 型均質(zhì)器，購自德國IKA 公司；GENIUS 3 基本型渦旋混勻器，購自德國IKA 公司；HS260 型多用調(diào)速振蕩器，購自德國IKA 公司；Caliper TurboVap LV 氮吹儀，購自美國公司。

阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 號83905-01-5，純度94.4%），BePure 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；乙腈（色譜純），購自美國MREDA 公司；甲醇（色譜純），購自美國LabServ 公司；甲酸（色譜純），購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氯化鈉（分析純），購自天津博迪化工股份有限公司；中性氧化鋁、十八烷基硅膠鍵合相（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、陰離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物（PAX）、石墨化炭黑（GCB）、氨丙基硅膠鍵合相、陽離子交換混合機理的水可浸潤型聚合物（PCX），均購自天津Bonna-Agela 公司；試驗用水為美國Millipore純水系統(tǒng)制得的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取經(jīng)純度折算后的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)50 mg，置于50 mL 燒杯中，用甲醇溶解并定量轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，既得濃度為1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)中間液的配制：準(zhǔn)確量取適量體積的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋成50 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.3 樣品前處理

提?。悍Q取2.0 g 樣品，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入8 mL 水，渦旋1 min，靜置30 min，將樣品充分浸潤分散，再加入3 g 氯化鈉和8 mL 乙腈，振蕩提取30 min，10 000 r/min 離心5 min，取6 mL 上清液待凈化。

凈化：將6 mL 上清液加入含有200 mg 乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）和100 mg 氨基吸附劑的15 mL 離心管中，渦旋1 min，10 000 r/min 離心5 min，再取5 mL 上清液于另一離心管中，氮吹至干，用1 mL 乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比25∶75），復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，上UPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器工作條件

超高效液相色譜條件：Eclipse Plus C18 色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液（內(nèi)含5 mmol/L 乙酸銨），B 為乙腈，梯度洗脫程序：0～2.5 min，10%～95% B；2.5～3.5 min，95% B；3.50～3.51 min，10%～95% B；3.51～8.00 min，10% B；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：AJS 電噴霧離子源，正離子模式/多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM）；干燥氣溫度（Gas Temp）：300 ℃；干燥氣流速（Gas Flow）：10 L/min；霧化氣壓力（Nebulizer）：138 kPa；鞘氣溫度（Sheath Gas Temp）：300 ℃；鞘氣流速（Sheath Gas Flow）：12 L/min；毛細(xì)管電壓（Capillary）：2 500 V；噴嘴電壓（nozzle voltage）：0 V；Delta EMV（+）：400 V；阿奇霉素的母離子、子離子、保留時間、毛細(xì)管出口電壓、碰撞能等參數(shù)見表1。

表1 阿奇霉素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)，阿奇霉素多采用正離子模式監(jiān)測，試驗以1.0 μg/mL阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對象，在不接色譜柱的情況下直接進(jìn)質(zhì)譜儀優(yōu)化參數(shù)。具體在正離子全掃描模式下，確定目標(biāo)化合物的母離子，同時優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓，結(jié)果表明，阿奇霉素的質(zhì)譜響應(yīng)不是很高，只優(yōu)化毛細(xì)管電壓達(dá)不到理想效果，本試驗在廠家推薦的起始離子源參數(shù)基礎(chǔ)上，對離子源參數(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。試驗發(fā)現(xiàn)，噴嘴電壓由500 V降到0 V即去掉噴嘴電壓后，目標(biāo)化合物的響應(yīng)提高了一倍；目標(biāo)化合物的響應(yīng)隨著霧化器壓力的升高反而降低，霧化器壓力由241 kPa調(diào)至138 kPa時，目標(biāo)化合物響應(yīng)提高了50%；此外，在不影響化合物響應(yīng)的基礎(chǔ)上，為了盡量延長鞘氣加熱組件的使用壽命，將鞘氣溫度由400 ℃降至300 ℃。阿奇霉素的質(zhì)譜掃描圖見圖1和圖2。

圖1 阿奇霉素的母離子掃描圖

圖2 阿奇霉素的子離子掃描圖

2.2 色譜條件的選擇

比較了Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），Waters cortees UPLC C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），XBridge peptide BEH C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），HT C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）四種色譜柱，阿奇霉素在Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色譜柱上的峰型、響應(yīng)最好，且可實現(xiàn)阿奇霉素與樣品基質(zhì)的基線分離。

經(jīng)參考文獻(xiàn)，試驗比較了乙腈-0.1% 甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.4%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（內(nèi)含5 mmol/L乙酸銨）四種流動相體系，結(jié)果顯示：隨著甲酸溶液濃度的增加，阿奇霉素的響應(yīng)沒有明顯變化；當(dāng)甲酸溶液中加入5 mmol/L的乙酸銨時，阿奇霉素的響應(yīng)明顯提高，且峰型有所改善，最終選擇乙腈-0.1%甲酸溶液（內(nèi)含5 mmol/L乙酸銨）作為本研究的流動相。阿奇霉素的MRM色譜圖見圖3。

圖3 阿奇霉素（5 μg/L）的MRM譜圖

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)直接用乙腈提取配合飼料中的阿奇霉素時，回收率僅為30%左右，且用空白樣品基質(zhì)提取溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重；而當(dāng)先加入水，之后再用乙腈提取時，回收率明顯提高，達(dá)到80%以上。這可能是由于所用的飼料是干制樣品，加入水后一方面可以使樣品充分分散，有利于阿奇霉素的提取，另一方面樣品中的部分極性干擾物質(zhì)被提取到水中析出，降低了阿奇霉素的基質(zhì)效應(yīng)。試驗進(jìn)一步對水和乙腈的用量進(jìn)行了優(yōu)化，比較了4 mL水+4 mL乙腈、4 mL 水+6 mL 乙腈、4 mL 水+8 mL 乙腈、4 mL水+10 mL 乙腈、6 mL 水+6 mL 乙腈、6 mL 水+8 mL 乙腈、6 mL 水+10 mL 乙腈、8 mL 水+8 mL 乙腈、8 mL水+10 mL 乙腈、10 mL 水+10 mL 乙腈對阿奇霉素提取效率的影響，結(jié)果見圖4。從圖中可以看出，當(dāng)水和乙腈的用量達(dá)到8 mL 時，阿奇霉素的回收率在80%以上，之后隨著水和乙腈用量的增加，回收率沒有明顯變化，綜合考慮回收率及成本、環(huán)保等因素，最終選擇8 mL水+8 mL乙腈為本試驗的提取溶劑。

圖4 提取溶劑不同體積對回收率的影響

2.4 凈化條件的優(yōu)化

凈化條件關(guān)系到整個試驗的效果，在不影響回收率的情況下盡量去除提取液中的雜質(zhì)是試驗的目標(biāo)，試驗過程中分三個步驟對凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化：①吸附劑種類的初篩；②吸附劑去除雜質(zhì)效果的比較；③吸附劑用量的優(yōu)化。

吸附劑種類的初篩。首先考察了各種吸附劑對目標(biāo)化合物的吸附性，具體方法如下：在濃度為20 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別加入中性氧化鋁、C18、PSA、PAX、GCB、NH2、PCX，經(jīng)充分振蕩并離心后，取上清液過濾膜上機測定，比較標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度前后有無變化。結(jié)果顯示，經(jīng)C18、PAX、GCB、PCX 吸附后，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度明顯降低，表明這四種吸附劑對阿奇霉素有很強的吸附作用；而經(jīng)中性氧化鋁、氨基、PSA 吸附后，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度基本沒有變化，表明這三種吸附劑對阿奇霉素的吸附作用小。因此，初步選定中性氧化鋁、氨基、PSA對提取液進(jìn)行凈化。

吸附劑去除雜質(zhì)效果的比較。試驗比較了中性氧化鋁、氨基、PSA 及兩兩組合對提取液的凈化效果及對阿奇霉素回收率的影響。結(jié)果表明，這幾種吸附劑無論是單獨使用還是兩兩組合使用，其回收率相差不大，但PSA 和氨基組合使用時，其基質(zhì)效應(yīng)是最小的，原因可能是，PSA 主要去除提取液中的脂類和糖類物質(zhì)，氨基對提取液中的弱酸性物質(zhì)吸附性強，兩者組合使用凈化效果更好。

吸附劑用量的優(yōu)化。比較了50～400 mg PSA 與50～400 mg氨基按不同比例組合時的凈化效果。結(jié)果表明，200 mg PSA 與100 mg 氨基組合時提取液顏色最淺、凈化效果最好，基質(zhì)效應(yīng)最小。

3 方法學(xué)考察

3.1 基質(zhì)效應(yīng)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，試驗通過比較空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物質(zhì)的峰面積（A1）與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物質(zhì)的峰面積（A2）的大小來評估方法的基質(zhì)效應(yīng)：當(dāng)兩者的比值(A1/A2)等于1 時，表明沒有基質(zhì)影響；當(dāng)兩者比值小于1 時，表明有基質(zhì)抑制效應(yīng)；當(dāng)兩者比值大于1 時，表明有基質(zhì)增強效應(yīng)。具體方法：取空白飼料樣品，按1.3步驟進(jìn)行處理，最后用濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，制得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時配制相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測物質(zhì)的峰面積，結(jié)果見表2。從表2可以看到比值均大于1，表明該法測定飼料樣品中的阿奇霉素存在基質(zhì)增強效應(yīng)，而且低濃度時的基質(zhì)效應(yīng)要強于高濃度時。為抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響，本試驗用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量。

表2 阿奇霉素的基質(zhì)效應(yīng)

3.2 線性關(guān)系和檢出限

取空白配合飼料樣品，按1.3步驟進(jìn)行處理，待氮吹干后，用1 mL 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶，配制成濃度在1～50 μg/L 范圍內(nèi)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，進(jìn)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定；以阿奇霉素的濃度為橫坐標(biāo)，以其定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用上述同樣的方法，配制濃度逐步降低的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，直到獲得目標(biāo)化合物的信噪比等于10的濃度，確定為該化合物的定量限（LOQ）。阿奇霉素的線性關(guān)系及定量限見表3。結(jié)果表明，阿奇霉素在1～50 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.999 1，定量限為2.0 μg/kg

表3 阿奇霉的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

3.3 回收率和精密度

用經(jīng)測定不含有阿奇霉素的配合飼料作為空白樣品，添加3 個質(zhì)量濃度水平（分別為LOQ、2LOQ、4LOQ），按照1.3 步驟進(jìn)行處理，每個水平做6 個平行樣，計算其加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。從表4 可以看出，阿奇霉素的平均加標(biāo)回收率在75%～90%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.3%～8.7%之間。

表4 復(fù)合飼料中阿奇霉素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

4 樣品檢測

從市場上隨機購買30 份配合飼料（6 份產(chǎn)蛋雞配合飼料、6 份肉雞配合飼料、6 份鴨配合飼料、6 份豬配合飼料和6 份牛羊配合飼料），應(yīng)用本試驗建立的方法進(jìn)行測定，其中有1 份產(chǎn)蛋雞配合飼料檢出阿奇霉素，含量為5.2 μg/kg，其余樣品均未檢出。為了驗證該方法，應(yīng)用龔蘭等[11]建立的“固相萃取凈化/高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜測定飼料中7 種大環(huán)內(nèi)酯類藥物含量”的方法對上述陽性樣品進(jìn)行了檢測，檢出結(jié)果為5.5 μg/kg。

5 結(jié)論

試驗采用改良的QuEChERS 法對樣品進(jìn)行處理，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，建立了配合飼料中阿奇霉素殘留量的檢測方法。試驗過程中系統(tǒng)優(yōu)化了色譜條件、質(zhì)譜條件、提取溶劑以及凈化條件等；除此之外，為驗證方法的適用性，還具體考察了方法的基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、回收率和精密度。結(jié)果表明，所建立的方法操作簡單，省時省力，提取回收率高，重復(fù)性好，滿足獸藥殘留分析的要求，可以為飼料質(zhì)量安全監(jiān)督及飼料安全檢測標(biāo)準(zhǔn)體系的完善提供技術(shù)支持。