賈彩霞，周潔如，朱洪希，吳 旦

（常州檢驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證研究院，江蘇常州 213000）

獸藥殘留是指用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體或產(chǎn)品中原型藥物或其代謝產(chǎn)物，包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留[1]。獸藥殘留主要是由于不按規(guī)定、非法使用及濫用獸藥造成獸藥在動(dòng)物體內(nèi)不斷積累而引起[2]。常見(jiàn)的獸藥殘留包括酰胺醇類、磺胺類和喹諾酮類等[3]。其中，磺胺類藥物對(duì)于鏈球菌等細(xì)菌有預(yù)防和治療的作用。該藥物價(jià)格低廉、使用方便以及藥效明顯，在各類畜禽的養(yǎng)殖過(guò)程中大量使用。但該藥對(duì)生態(tài)環(huán)境和對(duì)畜牧生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都有嚴(yán)重危害，且該藥會(huì)引起人過(guò)敏反應(yīng)，甚至有致癌性。

由于生活質(zhì)量越來(lái)越高，動(dòng)物源食品的出口貿(mào)易急劇增長(zhǎng)，人們對(duì)食品質(zhì)量與安全的關(guān)注度大大提高。因此，幾乎每個(gè)國(guó)家都出臺(tái)了動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的檢測(cè)限量。獸藥的最高殘留限量基本都在1 mg·kg-1以下，即百萬(wàn)分之一級(jí)別，許多禁用藥要求會(huì)更低，無(wú)疑屬于痕量分析范疇，所以獸藥殘留的檢測(cè)一直是食品檢測(cè)中的難點(diǎn)[4-7]。常用的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的溶劑萃取、固相萃取、凝膠色譜、多項(xiàng)技術(shù)組合及QuEChERS試劑包等多種方法[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中多種磺胺類藥物殘留量，以滿足實(shí)驗(yàn)室牛肉樣品中18種磺胺類藥物的常規(guī)檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺類混標(biāo)（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺間二甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺間甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺甲氧噠嗪（ANPEL，100 mg·L-1）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（ANPEL，100 mg·L-1）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；乙酸乙酯（色譜純）；甲酸（色譜純）；濃氨水。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津，LCMS-8050）；12孔固相萃取裝置（CNW）；氮吹儀；高速離心機(jī)；渦旋振蕩儀；超聲波清洗器；HLB固相萃取柱（CNW）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取適量有代表性的新鮮或解凍空白牛肉，攪碎并均質(zhì)，-18 ℃保存。

1.2.2 提取

稱取4 g（精確至0.01 g）試樣，用10 mL的乙酸乙酯提取，高速渦旋1 min，再經(jīng)超聲提取20 min，8000 r·min-1冷凍離心5 min，收集上清液于20 mL干凈容量瓶中，剩余殘?jiān)性偌尤? mL乙酸乙酯，重復(fù)前述提取步驟后合并上清液于同一20 mL容量瓶中，定容至刻度。取上清液5 mL，加水5 mL，振蕩1 min，45 ℃氮吹除去乙酸乙酯層。

1.2.3 凈化

HLB固相萃取柱分別依次經(jīng)6 mL甲醇和6 mL水活化，吸取上述經(jīng)氮吹除去乙酸乙酯的液體以每秒1～2滴的速度過(guò)固相萃取柱，依次用6 mL水和6 mL 20%甲醇水淋洗，抽干，再用2×4 mL 5%氨水甲醇∶乙酸乙酯（1∶1）溶液洗脫，收集該洗脫液，45 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL 0.2%甲酸乙腈溶液∶水（2∶3）復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將多種磺胺類混標(biāo)用0.2%甲酸乙腈水（2∶3）配制成濃度分別為2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以牛肉為空白基質(zhì)，通過(guò)提取、凈化、氮吹干后用1 mL前述配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行復(fù)溶，進(jìn)樣。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC T3（100 mm×2.1mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸甲醇+0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.6 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧電離；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液的提取效果。分別稱取4 g陰性樣品，在10 μg·kg-1條件下進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，用Mcllvaine-Na2EDTA、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈溶液進(jìn)行提取、凈化、氮吹復(fù)溶后上液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。由表3可知，乙酸乙酯對(duì)本方法所研究的18種磺胺類藥物的提取效果最佳，因此選用乙酸乙酯為提取溶劑。

表3 加標(biāo)濃度為10 μg·kg-1時(shí)3種提取液的回收率結(jié)果

2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

本文針對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了流動(dòng)相類型以及酸度的實(shí)驗(yàn)。①流動(dòng)相類型通常改變出峰時(shí)間。正常情況下通過(guò)一二級(jí)質(zhì)譜掃描得到磺胺類藥物的離子對(duì)，通過(guò)離子對(duì)即可對(duì)其進(jìn)行定性分析。但本實(shí)驗(yàn)18種磺胺中磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶的分子量及母離子、子離子均一致，只是基團(tuán)位置不同，無(wú)法通過(guò)離子對(duì)進(jìn)行定性分析，需調(diào)節(jié)出峰時(shí)間區(qū)分該3種物質(zhì)。因此，在流動(dòng)相類型方面，選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)，此3種磺胺出峰時(shí)間各不相同（圖1），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)，只出2個(gè)峰，表明峰重合未分開(kāi)（圖2）。因此，實(shí)驗(yàn)選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相。②酸度。選擇水-甲醇和0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇2種。通常加酸調(diào)節(jié)酸度可以提高正離子掃描模式下的離子化強(qiáng)度且改善峰型，因此實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加0.1%甲酸比較酸度增強(qiáng)時(shí)，18種磺胺類藥物的峰型是否有變化。結(jié)果表明，以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，磺胺類藥物峰型出現(xiàn)分裂、拖尾或不尖銳的現(xiàn)象，以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相后峰型所改善，峰型變尖銳且強(qiáng)度增加，響應(yīng)提高。以乙酰胺酸為例，200 ng·mL-1乙酰胺酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，峰型不尖銳，強(qiáng)度為716042，見(jiàn)圖3（a），而以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)，峰型尖銳且強(qiáng)度達(dá)749404，見(jiàn)圖3（b）。綜合考慮，選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相。

圖1 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相時(shí)的質(zhì)譜圖

圖2 磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪和磺胺對(duì)甲氧嘧啶以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈為流動(dòng)相時(shí)的質(zhì)譜圖溶液（200 ng·mL-1）的質(zhì)譜圖

圖3 200 ng·mL-1乙酰胺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰型圖

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

掃描模式采用正離子模式，在正離子掃描模式下得到一級(jí)質(zhì)譜圖后，找到母離子，再用二級(jí)質(zhì)譜掃描得到子離子，分別選定為定性離子和定量離子，再分別對(duì)碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應(yīng)強(qiáng)度時(shí)的最佳碰撞電壓值。多種磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表2，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 18種磺胺類藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量限

在2～200 ng·mL-1，18種目標(biāo)物濃度與其對(duì)應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系。線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見(jiàn)表4。

表4 18種磺胺類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 回收率及精密度

以牛肉為空白基質(zhì)，按照提取、凈化、氮吹、復(fù)溶步驟進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為低（10 μg·kg-1）、中（20 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3個(gè)水平，回收率及精密度結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率以及精密度結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

本方法的18種磺胺類物質(zhì)均在2～200 ng·mL-1內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，方法檢出限為2 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1，回收率為64.87%～105.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～6.8%。本方法提取率高，檢測(cè)步驟快速簡(jiǎn)單。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，能夠滿足日常檢測(cè)需求。