康紹英，劉宇星，趙紅清，李 燦，劉 蘭，張 新

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410017）

?；撬嵊置?-氨基乙磺酸、牛膽素、牛膽酸，因最早從牛黃中提取出來(lái)而得名。牛磺酸是一種含硫氨基酸，但并不是蛋白質(zhì)的組成成分，這種非蛋白氨基酸不參與體內(nèi)蛋白的生物合成，以游離氨基酸形式存在于人體內(nèi)。作為一種特殊的氨基酸，其對(duì)人體健康非常重要，是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素。研究表明牛磺酸具有保肝利膽、降低血壓，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗驚厥和心律紊亂、預(yù)防心腦血管疾病、抑制血糖升高、提高免疫力、抗疲勞等生理作用，特別是對(duì)嬰幼兒提高智力發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺(jué)功能以及鈣的吸收有著非常重要的作用，是一種促進(jìn)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)素。研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒如果缺乏?；撬幔瑫?huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育緩慢，造成智力低下、視覺(jué)功能紊亂等不良后果。牛磺酸廣泛存在于人和動(dòng)物的腦、心臟、肝、腎及乳汁中。嬰兒主要從母乳中獲得?；撬?，而牛奶中幾乎不含?；撬?，所以完全由人工喂養(yǎng)的嬰兒，可能會(huì)造成?；撬岬娜狈?，因此嬰幼兒配方奶粉中必須強(qiáng)化添加一定量的牛磺酸。目前我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 14880—2012）中規(guī)定嬰幼兒調(diào)制乳粉中牛磺酸的允許使用量為0.3～0.5 g·kg-1。

?；撬岬闹饕獧z測(cè)方法有薄層色譜法[1]、酸堿滴定法[2]、比色法[3]、氨基酸分析儀法[4]以及柱前衍生高效液相色譜法[4-11]等，其中最常見(jiàn)的?；撬釞z測(cè)方法為柱前衍生高效液相色譜法。?；撬岱肿邮街袩o(wú)共軛雙鍵，在紫外區(qū)無(wú)吸收，需經(jīng)衍生加入紫外吸光基團(tuán)方可產(chǎn)生吸收，從而進(jìn)行含量測(cè)定。用于測(cè)定?；撬岬闹饕把苌鷦┯朽彵蕉兹5-7]、丹磺酰氯[4,8]、2,4-二硝基氟苯[9]、異硫氰酸苯酯[10]、9-氯甲酸芴甲酯[11]等。本研究采用鄰苯二甲醛（OPA）和丹磺酰氯（Dansyl-Cl）兩種柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定奶粉中?；撬岬暮?，并比較了兩種方法的優(yōu)劣。兩種衍生化方法靈敏度好、分離度高，均可用于奶粉中?；撬岬臏y(cè)定，但實(shí)際樣品分析表明OPA法具有樣品前處理快、分析時(shí)間短、干擾少等優(yōu)點(diǎn)，是較理想的?；撬釡y(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試奶粉來(lái)源于流通領(lǐng)域抽取的食品安全監(jiān)督抽檢樣品。

牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心）；甲醇、乙腈、鹽酸甲胺、丹磺酰氯（色譜純，CNW Technologies）；鄰苯二甲醛（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥）；乙硫醇（分析純，F(xiàn)luka Analytical）；硼酸（分析純，上海山浦）；氫氧化鈉（分析純，天津風(fēng)船）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、鹽酸、無(wú)水碳酸鈉、乙酸鈉（分析純，國(guó)藥）。

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；BS224S電子天平、PB-10 pH計(jì)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-500B超聲波清洗機(jī)，昆山美美超聲儀器有限公司；TG16-WS離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

（1）牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取0.0502 g牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，配成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取適量?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋制備濃度為1 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、15 μg·mL-1和20 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（3）沉淀劑Ⅰ。稱取15.0 g亞鐵氰化鉀用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（4）沉淀劑Ⅱ。稱取30.0 g乙酸鋅用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（5）0.4 mol·L-1硼酸鈉緩沖液。分別稱取2.48 g硼酸、1.41 g氫氧化鈉用水溶解并定容至100 mL容量瓶中。

（6）OPA衍生劑。稱取0.1 g OPA加10 mL甲醇溶解，再加0.1 mL乙硫醇，最后用0.4 mol·L-1硼酸鈉緩沖液稀釋至100 mL容量瓶中。

（7）1 mol·L-1鹽酸溶液。吸取9 mL鹽酸用水定容至100 mL容量瓶中。

（8）0.08 mol·L-1碳酸鈉緩沖液（pH=9.5）。稱取0.424 g無(wú)水碳酸鈉以40 mL水溶解，用1 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5，再用水定容至50 mL容量瓶中。

（9）1.5 g·L-1丹磺酰氯溶液。稱取0.15 g丹磺酰氯，用乙腈溶解定容至100 mL容量瓶中。

（10）20 g·L-1鹽酸甲胺溶液。稱取2.0 g鹽酸甲胺，水溶解定容至100 mL容量瓶中。

巖棉復(fù)合型保溫模板作為一種新型外墻保溫模板，其具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)如下：① 模板免拆除，巖棉復(fù)合型保溫模板直接與外墻混凝土澆筑為一個(gè)整體，可作為永久性構(gòu)件使用；② 安全使用性，模板通過(guò)連接件與建筑結(jié)構(gòu)構(gòu)件進(jìn)行有效連接，有效規(guī)避了傳統(tǒng)外墻保溫材料在后期使用過(guò)程中脫落的問(wèn)題；③ 防火等級(jí)高，模板的組成材料均不具有可燃性，且耐火等級(jí)高，模板在施工中及后期使用中都不存在火災(zāi)安全隱患；④ 施工效率高，外墻澆筑與外墻保溫兩道施工工序合二為一，降低了施工難度，縮短了施工周期；⑤ 飾面作業(yè)便捷，巖棉復(fù)合型保溫模板表面平整，可直接在模板表面進(jìn)行外墻飾面作業(yè)。

（11）0.01 mol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH=4.2）。稱取0.820 g乙酸鈉，用水溶解稀釋至1000 mL容量瓶中，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.2.2 試樣制備

（1）試液提取。稱取1.0 g左右試樣至100 mL容量瓶，加入80 mL 50～60 ℃溫水溶解，充分混勻后超聲提取10 min，冷至室溫。加1.0 mL沉淀劑Ⅰ混勻，再加入1.0 mL沉淀劑Ⅱ混勻，用水定容并充分混勻，提取液于5000 r·min-1離心10 min，取出上清液待衍生用。該上清液在4 ℃暗處可穩(wěn)定保存24 h。

（2）試液衍生化。①OPA衍生化。準(zhǔn)確吸取上清液2.5 mL、OPA衍生劑2.5 mL于10 mL具塞離心管中搖勻，衍生反應(yīng)2 min后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，立即進(jìn)樣分析，標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液從衍生開(kāi)始至上機(jī)分析的時(shí)間應(yīng)盡量保持一致并控制在5 min內(nèi)。②丹磺酰氯衍生化。準(zhǔn)確吸取上清液、碳酸鈉緩沖液和丹磺酰氯溶液各1.00 mL于10 mL具塞玻璃試管中，充分混勻在室溫條件下避光衍生反應(yīng)2 h（中間振搖1次），加0.10 mL鹽酸甲胺溶液搖勻終止衍生反應(yīng)，避光靜置沉淀取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾待分析用。衍生后的溶液在4 ℃避光條件下可保存48 h。標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品溶液同步衍生。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；OPA法流動(dòng)相：乙腈∶水=10∶90；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；丹磺酰氯法流動(dòng)相：10 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液∶乙腈=80∶20；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

在堿性條件下?；撬崤cOPA衍生試劑發(fā)生衍生反應(yīng)，生成具有紫外吸收的衍生產(chǎn)物。衍生產(chǎn)物光譜圖顯示在335 nm處具有最大吸收峰，因此OPA法檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。同樣在堿性條件下牛磺酸與丹磺酰氯發(fā)生衍生反應(yīng)生成具有紫外吸收的衍生產(chǎn)物，該產(chǎn)物在254 nm處具有最大吸收，因此丹磺酰氯法檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

OPA衍生法采用乙腈-水作為流動(dòng)相，并分別考察了30%、20%、10%的乙腈-水對(duì)?；撬岱蛛x的影響，最終選擇10%乙腈-水作為流動(dòng)相，?；撬嵩? min左右出峰，且樣品檢測(cè)無(wú)雜質(zhì)干擾。

丹磺酰氯衍生法首先以10 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液∶乙腈=70∶30為流動(dòng)相，實(shí)際樣品分析時(shí)測(cè)得某奶粉?；撬岷繛闃?biāo)簽標(biāo)示值的2倍，而用OPA衍生法測(cè)得其?；撬岷颗c標(biāo)簽標(biāo)示值一致，進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相比例發(fā)現(xiàn)該衍生方法衍生產(chǎn)物中存在干擾目標(biāo)分析物檢測(cè)的組分，且干擾物衍生產(chǎn)物的光譜圖和牛磺酸衍生產(chǎn)物的光譜圖完全一致，當(dāng)乙酸鈉緩沖液與乙腈的比例為80∶20時(shí)，干擾成分與目標(biāo)物完全分離，測(cè)得奶粉樣品中?；撬岬暮颗c標(biāo)簽標(biāo)示含量基本一致，因此丹磺酰氯衍生法以乙酸鈉緩沖液∶乙腈=80∶20為流動(dòng)相。

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 方法的線性范圍及檢出限

將不同質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別采用兩種衍生法衍生后于優(yōu)化的色譜條件下依次進(jìn)樣分析，以分析物峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到?；撬岬臉?biāo)準(zhǔn)曲線、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。由表1可知，兩種方法在1～20 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r分別為0.9999和0.9996，方法檢出限均為1.5 mg/100 g，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 ?；撬岬木€性關(guān)系和檢出限

2.2.2 回收率及重復(fù)性結(jié)果

分別稱取1 g（精確至0.01 g）奶粉試樣于100 mL容量瓶中，以3種濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平各分別制備5份測(cè)試溶液進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算各濃度添加水平的平均測(cè)定值、平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。由表2可知，兩種方法均可獲得較好的回收率，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤4.30%。

表2 回收率及重復(fù)性比較（n=5）

2.3 兩種方法優(yōu)缺點(diǎn)討論

OPA衍生劑是目前應(yīng)用最為廣泛的測(cè)定?；撬岬闹把苌噭?shí)際樣品檢測(cè)表明OPA衍生法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如OPA衍生劑本身不會(huì)干擾目標(biāo)物的分離檢測(cè)，過(guò)量試劑不必除去；衍生反應(yīng)迅速，2 min內(nèi)即可完成；衍生產(chǎn)物出峰快，分析一個(gè)樣品僅需10 min。但OPA衍生法的最大缺點(diǎn)是衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，要求衍生反應(yīng)結(jié)束后必須在很短的時(shí)間內(nèi)完成進(jìn)樣分析，且每份樣品的時(shí)間必須保持一致，因此嚴(yán)格控制衍生反應(yīng)時(shí)間及進(jìn)樣分析時(shí)間是獲得較好的重復(fù)性的必備條件；樣品不能批量處理；衍生過(guò)程中需加入乙硫醇，乙硫醇?xì)馕洞笄叶拘暂^大。如色譜儀配備有在線衍生系統(tǒng)，則可實(shí)現(xiàn)在線衍生化反應(yīng)，能夠很好地解決以上缺點(diǎn)。無(wú)在線衍生條件的實(shí)驗(yàn)室，只要衍生時(shí)間和進(jìn)樣時(shí)間控制好，也很容易獲得滿意的重復(fù)性。

衍生劑丹磺酰氯目前也被較多地應(yīng)用于?；撬岬臏y(cè)定中，該衍生法具有前處理操作簡(jiǎn)便、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，其主要優(yōu)點(diǎn)是衍生產(chǎn)物非常穩(wěn)定，在4 ℃可避光保存48 h，樣品能夠批量處理。但此衍生法亦有不足之處，如衍生反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，需要2 h；需加入淬滅劑終止反應(yīng)以除去過(guò)量試劑；衍生產(chǎn)物干擾成分多，色譜分析時(shí)間較長(zhǎng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較了OPA和丹磺酰氯兩種柱前衍生法測(cè)定奶粉中?；撬岬臋z測(cè)方法。結(jié)果表明，兩種方法線性關(guān)系良好，回收率高，靈敏度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，均可用于奶粉中?；撬岬臏y(cè)定。但丹磺酰氯法衍生反應(yīng)慢，分析耗時(shí)長(zhǎng)、干擾多。與之相比OPA法具有樣品前處理時(shí)間短、分析時(shí)間短、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，其衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、樣品不能批量處理，但可運(yùn)用在線衍生系統(tǒng)解決，是較為理想的?；撬釡y(cè)定方法。