鄧錦秀

（廣西融安縣疾病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545400）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄球狀排列，無芽孢、無莢膜，廣泛分布于自然界，能引起各種感染和疾病，如皮膚感染、呼吸道感染、食物中毒、敗血癥等[1-2]。金黃色葡萄球菌具有廣泛的多重耐藥性和毒力因子，已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域備受關(guān)注的問題之一，可通過細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定、分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)等對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和診斷。在臨床和食品安全等領(lǐng)域，對(duì)金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)和準(zhǔn)確診斷具有重要意義，可幫助預(yù)防和控制其感染和傳播[3]。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為革蘭氏陰性菌，呈弧狀、棒狀等多形態(tài)，無芽孢，有鞭毛，常存在于海水和海產(chǎn)品中，可引起腸胃感染，癥狀包括腹瀉、腹部絞痛、嘔吐、惡心等[4]。人們主要通過進(jìn)食受污染的海產(chǎn)品感染副溶血性弧菌，潛伏期一般為4～96 h，嚴(yán)重感染者可能導(dǎo)致腸穿孔和敗血癥，甚至危及生命[5]。副溶血性弧菌是我國東南沿海地區(qū)引起食物中毒的重要病原體之一，目前食物中毒已成為主要的突發(fā)公共事件之一[6-7]。

能力驗(yàn)證是指通過對(duì)已知樣品的測(cè)試評(píng)估實(shí)驗(yàn)室在特定領(lǐng)域檢測(cè)能力的精確度、準(zhǔn)確度和可靠性。能力驗(yàn)證不僅可以評(píng)估實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)水平和能力，還能幫助實(shí)驗(yàn)室制定和改進(jìn)質(zhì)量管理體系、提高檢驗(yàn)人員的素質(zhì)和意識(shí)、推動(dòng)技術(shù)創(chuàng)新和學(xué)術(shù)交流，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室良性循環(huán)和發(fā)展。因此，能力驗(yàn)證在現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室管理中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。

本文通過分析本實(shí)驗(yàn)室2022年參加由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織和實(shí)施的食品中金黃色葡萄球菌（定量）[ACAS-PT1328（2022）]、副溶血性弧菌（定性）[ACAS-PT1329（2022）]的檢測(cè)能力驗(yàn)證的檢測(cè)結(jié)果，提升本實(shí)驗(yàn)室對(duì)食品中金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的檢測(cè)能力。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來源于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心，共檢測(cè)2個(gè)項(xiàng)目，每個(gè)項(xiàng)目2個(gè)樣品，樣品為白色凍干塊狀，為人工污染的食品樣品，西林瓶真空包裝。

1.2 試劑與儀器

Baird-Parker瓊脂（北京陸橋）；凍干血漿（北京陸橋）；腦心浸出液肉湯（北京陸橋）；血瓊脂平板（北京陸橋）；TCBS培養(yǎng)基（北京陸橋）；3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂（北京陸橋）；副溶血性弧菌干制生化鑒定試劑盒（北京陸橋）；科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；XDD-84立式電熱壓力蒸汽消毒器；HR40-ⅡA2生物安全柜等。

1.3 檢驗(yàn)依據(jù)

依據(jù)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）[8]第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.7—2013）[9]對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 檢驗(yàn)方法

1.4.1 樣品制備

（1）金黃色葡萄球菌樣品（22-K795、22-Y967）用60 mL稀釋液再水化。樣品開啟后，立即加入5 mL稀釋液再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁2～3次，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液為待測(cè)樣品原液。

（2）副溶血性弧菌樣品（22-L696、22-E161）用60 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水再水化。樣品開啟后，立即加入5 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再反復(fù)用余下的3%氯化鈉堿性蛋白胨水清洗西林瓶內(nèi)壁2～3次，回收清洗液置于上述無菌瓶中，此溶液為待測(cè)樣品原液。

1.4.2 接種、增菌及分離培養(yǎng)

（1）金黃色葡萄球菌樣品。以無菌吸管吸取25 mL金黃色葡萄球菌待測(cè)樣品原液置于盛有225 mL稀釋液的無菌瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液；用微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 mL注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中，充分混勻，制成1∶100的樣品勻液。選擇3個(gè)稀釋度（100、10-1、10-2）的樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接種量分別加入3個(gè)Baird-Parker平板，用無菌涂布棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。平板涂布后靜置10 min，倒置后于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌作陽性對(duì)照。典型的金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤，顏色呈灰黑色或黑色，有光澤，周圍繞以不透明圈，其外常有一清晰帶。

（2）副溶血性弧菌樣品。以無菌操作取25 mL副溶血性弧菌待測(cè)樣品原液置于盛有225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的無菌瓶中，充分混勻，制成1∶10樣品勻液。將樣品勻液于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。22-L696、22-E161增菌液均渾濁生長，取增菌液各一環(huán)分別劃線接種于科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基和TCBS培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)菌株副溶血性弧菌作陽性對(duì)照。

1.4.3 鑒定試驗(yàn)

（1）金黃色葡萄球菌鑒定試驗(yàn)。選擇有典型金黃色葡萄球菌菌落且同一稀釋度3個(gè)平板菌落數(shù)合計(jì)在20～200 CFU的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。從典型菌落中挑取5個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定試驗(yàn)，分別做染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)（36 ℃培養(yǎng)6 h），同時(shí)劃線接種到血平板36 ℃培養(yǎng)24 h。

（2）副溶血性弧菌鑒定試驗(yàn)。挑取3個(gè)可疑菌落接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng)，于36 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行染色鏡檢、生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 金黃色葡萄球菌鑒定試驗(yàn)結(jié)果

金黃色葡萄球菌樣品22-K795、22-Y967在血平板上的菌落形態(tài)均為圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色，菌落周圍可見完全透明溶血圈，鑒定試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 金黃色葡萄球菌鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 副溶血性弧菌鑒定試驗(yàn)結(jié)果

副溶血性弧菌樣品22-L696、22-E161在科瑪嘉弧菌顯色平板上均為淡紫色菌落，在TCBS平板上均為圓形、半透明、表面光滑、綠色菌落，其鑒定試驗(yàn)結(jié)果見表2。樣品22-L696、22-E161均檢出副溶血性弧菌。

表2 鑒定試驗(yàn)結(jié)果

2.2 能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 金黃色葡萄球菌（定量）能力驗(yàn)證結(jié)果

能力驗(yàn)證結(jié)果判定|Z|≤2.0為滿意結(jié)果；2.0＜|Z|＜3.0為可疑結(jié)果；|Z|≥3.0為不滿意（離群）結(jié)果[10]。22-K795、22-Y967樣品的Z值分別為-1.5、0.4，|Z|≤2.0，說明本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)均獲得滿意結(jié)果。

2.2.2 副溶血性弧菌（定性）能力驗(yàn)證結(jié)果

能力驗(yàn)證結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與指定值一致時(shí)，評(píng)價(jià)為滿意，否則為不滿意（假陰性或假陽性）[11]。22-L696、22-E161樣品均檢出副溶血性弧菌，均與指定值一致，說明本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)均獲得滿意結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

能力驗(yàn)證是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、認(rèn)可機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室管理部門判定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要技術(shù)手段之一，也是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的有效補(bǔ)充。能力驗(yàn)證活動(dòng)是判定實(shí)驗(yàn)室能力的國際通行做法，其結(jié)果得到廣泛承認(rèn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室了解、提高和證實(shí)自身能力都具有積極作用。疾控機(jī)構(gòu)的微生物檢驗(yàn)室是為衛(wèi)生行政部門制定疾病預(yù)防與控制策略及采取措施、為衛(wèi)生監(jiān)督提供實(shí)驗(yàn)室技術(shù)支持、為社會(huì)日益增長的衛(wèi)生需要提供衛(wèi)生技術(shù)服務(wù)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)，為保證所提供數(shù)據(jù)的公正、準(zhǔn)確和科學(xué)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室需保證測(cè)定結(jié)果達(dá)到確定的檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果（實(shí)驗(yàn)室代碼ACAS-PT1328-056、ACAS-PT1329-056）均與ACAS-PT1328食品中金黃色葡萄球菌（定量）、ACAS-PT1329副溶血性弧菌（定性）的檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃指定值一致，能力評(píng)價(jià)均為“滿意”結(jié)果，說明本實(shí)驗(yàn)室具有食品中金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的檢測(cè)能力。通過本次能力驗(yàn)證，極大提高了本實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力水平，同時(shí)在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)一些需要注意的事項(xiàng)。①樣品處理時(shí)要完全溶解、混勻，無菌操作。②Baird-Parker平板在使用前要確認(rèn)無水珠，如果有水珠可放置于25～30 ℃培養(yǎng)箱中干燥，直到平板表面水珠消失，否則會(huì)出現(xiàn)菌落成片生長而無法計(jì)數(shù)的情況。③在Baird-Parker平板培養(yǎng)至24 h后可進(jìn)行一次預(yù)計(jì)數(shù)，對(duì)發(fā)現(xiàn)的特征菌落用記號(hào)筆進(jìn)行描點(diǎn)標(biāo)記，避免在48 h后出現(xiàn)雜菌干擾結(jié)果判定[12]。④要嚴(yán)格控制培養(yǎng)基的溫度、濕度和通風(fēng)等條件，以確保菌落的正常生長，并防止外界細(xì)菌污染。⑤在選擇培養(yǎng)基和試劑盒等試劑時(shí)，應(yīng)注意其質(zhì)量和有效期，避免使用過期或受污染的試劑，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[13]。⑥在實(shí)驗(yàn)過程中要按照規(guī)范的操作程序和實(shí)驗(yàn)室管理要求進(jìn)行，做好記錄和報(bào)告工作，及時(shí)處理發(fā)現(xiàn)的問題和異常情況，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析和結(jié)論推斷，提高實(shí)驗(yàn)室的整體技術(shù)水平和科學(xué)研究能力[14]。