朱應(yīng)飛，聶 翔，熊麗霞，吳學(xué)平，占忠旭，匡佩琳

（江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西南昌 330000）

產(chǎn)志賀菌毒素的大腸桿菌（Shiga Toxin ProducingEscherichia coli，STEC）和腸致病性埃希氏菌（EnterogenicEscherichi coli，EPEC）是世界上最重要的食源性病原體之一。牛羊等動(dòng)物作為STEC 和EPEC 的宿主，可通過(guò)糞便污染肉食對(duì)人們的健康造成危害[1]。STEC 可引起溶血性尿毒癥綜合征，甚至可能導(dǎo)致死亡[2]。EPEC 可引起急性或持續(xù)性腹瀉，多發(fā)于兩歲以下的兒童。通常，EPEC 會(huì)引起急性水樣腹瀉，并伴有發(fā)燒、嘔吐和脫水，該病發(fā)病迅速，在攝入細(xì)菌后幾小時(shí)后出現(xiàn)癥狀[3]。本研究旨在用傳統(tǒng)平板分離法結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)江西省南昌市市售牛肉樣品中的STEC 和EPEC 進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱，上海智誠(chéng)；實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，伯樂(lè)；改良胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，新生霉素、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京陸橋；CHROMagar STEC 顯色培養(yǎng)基，科瑪嘉；改良Rainbow O157 顯色培養(yǎng)基，Biolog；引物和探針，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

從2018 年9 月—2019 年3 月，每月采集牛肉及制品數(shù)量為20 份，共采集7 個(gè)月合計(jì)抽取140 個(gè)牛肉及制品樣本。于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日清晨在實(shí)驗(yàn)室周邊超市或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買牛肉樣品，并將其置于無(wú)菌采樣袋中，詳細(xì)記錄樣品信息。采樣后應(yīng)置于2 ～5 ℃保存，在4 h 內(nèi)檢驗(yàn)。

1.3 樣品制備和預(yù)培養(yǎng)

無(wú)菌操作條件下， 取樣品（325±32.5）g 于BagFilter P2000 均質(zhì)袋中，并向均質(zhì)袋中加入（975±19.5）mL 的改良胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶4的樣品勻液，于（36±1）℃預(yù)培養(yǎng)4 h。

1.4 增菌

在生物安全柜中，向上述經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的樣品勻液中加入新生霉素溶液，使其終濃度為10 mg·L-1，之后于（42±1）℃培養(yǎng)15 ～24 h。同時(shí)以含有stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌為陽(yáng)性對(duì)照，以不含stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌為陰性對(duì)照，并做培養(yǎng)基空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照菌株可使用大腸埃希氏菌CICC10670，陰性對(duì)照菌株可使用大腸埃希氏菌ATCC25922。

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR 初步篩選

以16S rRNA 基因作為PCR 體系內(nèi)參照，檢測(cè)大腸埃希氏菌的志賀毒素編碼基因stx（stx1、stx2）和緊密素編碼基因eae。志賀毒素編碼基因stx（stx1、stx2）、緊密素編碼基因eae及內(nèi)參照16S rRNA 的擴(kuò)增引物和探針見(jiàn)引物和探針的核酸序列等同采用USDA-FSIS MLG 5C.03 中的規(guī)定[4]。

1.6 STEC 菌株的分離和確認(rèn)

1.6.1 分離

用10 μL 接種環(huán)取上述增菌液劃線于CHROMagar STEC顯色培養(yǎng)基（或改良Rainbow O157顯色培養(yǎng)基），（36±1）℃培養(yǎng)18 ～24 h。記錄分離培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，CHROMagar STEC 顯色培養(yǎng)基上STEC 為淡紫色，其他腸桿菌為藍(lán)色、無(wú)色或被抑制，改良Rainbow O157 顯色培養(yǎng)基STEC 有不同顏色的菌落，藍(lán)色、紫色、粉色或灰色。

1.6.2 生化確認(rèn)

將典型或可疑菌落接種于三糖鐵瓊脂斜面，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌，直接接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)18 ～24 h。大腸埃希氏菌在三糖鐵瓊脂斜面和底層均呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，H2S 實(shí)驗(yàn)陰性。

1.6.3 毒力基因確認(rèn)

以16S rRNA 基因作為PCR 體系內(nèi)參照，檢測(cè)大腸埃希氏菌的志賀毒素編碼基因stx和緊密素編碼基因eae。實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。分別以含有stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌的核酸提取物為陽(yáng)性對(duì)照，以不含stx1、stx2和eae基因的大腸埃希氏菌核酸提取物為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。引物16S rRNA（上下游）終濃度為0.16 μmol·L-1，引物stx（下上游）終濃度為1.25 μmol·L-1，引物eae（上下游）終濃度為1 μmol·L-1，探針16S rRNA 終濃度為0.1 μmol·L-1，探針stx1、探針stx2終濃度為0.25 μmol·L-1，探針eae終濃度為0.2 μmol·L-1。實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)參數(shù)為95 ℃/15 s，59 ℃/1 min，45 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌總體監(jiān)測(cè)情況

于2018 年9 月—2019 年3 月，每個(gè)月從超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽取20 份樣本，7 個(gè)月共抽取140 份牛肉及制品樣本，在qPCR 初篩時(shí)stx陽(yáng)性率為45.8%，eae的陽(yáng)性率為52.2%，2018 年9 月—2019 年3 月，每月的stx初篩陽(yáng)性率分別為65%、60%、80%、5%、25%、45%和40%；eae初篩陽(yáng)性率分別為70%、70%、65%、0%、40%、65%和55%。

2.2 攜帶stx 基因的產(chǎn)類志賀毒素大腸埃希氏菌和攜帶eae 基因的腸致病性大腸埃希氏菌檢出情況

檢出攜帶stx基因的產(chǎn)類志賀毒素大腸埃希氏菌樣本為4 份，樣本陽(yáng)性菌株檢出率為2.9%，檢出攜帶eae基因的腸致病性大腸埃希氏菌樣本為12 份，樣本陽(yáng)性菌株檢出率為8.6%。從9月開始監(jiān)測(cè)至3月，每個(gè)月共抽取樣本20 個(gè)，stx陽(yáng)性檢出率分別為0%、0%、10%、0%、5%、5%和0%；eae陽(yáng)性檢出率分別為0%、5%、10%、5%、15%、10%和15%。

2.3 陽(yáng)性菌落培養(yǎng)特性

將PCR 結(jié)果擴(kuò)增同時(shí)出現(xiàn)stx、eae基因陽(yáng)性增菌菌懸液劃線或涂布改良CHROMagar STEC 顯色培養(yǎng)基和改良Rainbow O157 顯色培養(yǎng)基平板上，于37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h，觀察形態(tài)。不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征見(jiàn)圖1。

圖1 顯色平板上陽(yáng)性菌落

用試劑盒分離得到的陽(yáng)性單菌總DNA 后，對(duì)毒力基因stx、eae進(jìn)行分析，PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。單獨(dú)攜帶stx的有4 株；單獨(dú)攜帶eae基因的有9 株。

圖2 分離單菌落PCR 結(jié)果

3 結(jié)論與討論

大腸埃希氏菌是一種隨著環(huán)境變化而多變的微生物，即使侵襲性感染也有可能進(jìn)化出危及生命的并發(fā)癥，產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌（STEC）和致腹瀉的大腸埃希氏菌（EPEC）菌株仍然是重要的病原體。STEC 的主要毒力因子是志賀毒素stx1和stx2（由stx1和stx2基因編碼），它們干擾蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致腸道細(xì)胞死亡[5]。eae基因是EPEC 引起A/E 損傷所必需的[6]。本次研究抽取的樣本是140 個(gè)牛肉樣品，在qPCR 初篩時(shí)stx陽(yáng)性率為45.8%，eae的陽(yáng)性率為52.2%。篩出STEC 陽(yáng)性樣本為4 份，樣本陽(yáng)性菌株檢出率為2.9%，低于TORO 等[7]的研究（10%），篩出EPEC 的陽(yáng)性樣本為12 份，樣本陽(yáng)性菌株檢出率為8.6%，高于LEE 等[8]的研究（4.1%）。牛肉樣品中SETC 和EPEC 的檢出率不容樂(lè)觀，后續(xù)還將對(duì)其毒力做進(jìn)一步研究，確定其致病性。