陶志云，朱春紅，徐文娟，章雙杰，宋衛(wèi)濤，劉宏祥，屠琦，王志成，李慧芳*

(1. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125；2. 蘇州海關(guān)綜合技術(shù)中心，江蘇 蘇州 225100)

RORs為維甲酸相關(guān)孤兒受體，屬于核受體超家族的一個亞家族，該亞家族由RORα(NR1F1、RORA或RZRα)[1-3]，RORβ(NR1F2、RORB或RZRβ)[4-6]，和RORγ(NR1F3、RORC或TOR)組成[7-11]，在晝夜節(jié)律、代謝、炎癥和癌癥中發(fā)揮重要作用[12]。研究表明，RORα表達(dá)在肝臟、腎臟、視網(wǎng)膜和肺中表現(xiàn)出微弱的晝夜節(jié)律振蕩，并且ROR α通過2個保守的RORα響應(yīng)元件直接激活BMAL1的轉(zhuǎn)錄，從而維持穩(wěn)健的晝夜節(jié)律[13]。RORβ在小鼠松果體和視網(wǎng)膜中顯示出節(jié)律性表達(dá)模式[14]。RORγ在肝臟、棕色脂肪組織和腎臟中表現(xiàn)出振蕩表達(dá)模式，但在骨骼肌和胸腺中不存在[15-16]。RORα或RORβ缺陷的小鼠表現(xiàn)出異常的晝夜行為[6，17-18]，而在RORγ-/-小鼠中未發(fā)現(xiàn)晝夜行為異常[19]。這些研究表明，ROR的節(jié)律表達(dá)在很大程度上取決于ROR亞型和組織類型。振蕩器的核心環(huán)由異二聚體激活劑BMAL1和CLOCK組成，它們激活PERs和CRYs的表達(dá)。PER和CRY異二聚體與BMAL1時鐘復(fù)合物相互作用并負(fù)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性[12，20-22]。但在家禽中尚未見RORs相關(guān)研究報道。

本課題組在前期對高蛋重和低蛋重兩組鴨的全基因組混池重測序中發(fā)現(xiàn)RORB基因為鴨產(chǎn)蛋量相關(guān)的受選擇候選基因之一，且該基因上存在多個差異SNP位點(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，提示該基因在產(chǎn)蛋性能的調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)該基因在產(chǎn)蛋中的作用，本研究采用Illumina方法對鴨RORB的基因序列進(jìn)行個體測序，以分析這些SNP的差異，并將這些差異SNP與產(chǎn)蛋性能進(jìn)行相關(guān)分析，同時檢測RORB及其相關(guān)基因在蛋重不同鴨組織中的mRNA表達(dá)水平差異，進(jìn)一步探討鴨RORB基因在產(chǎn)蛋性能中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

試驗鴨為金定鴨，共250只，按照蛋鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，90日齡時進(jìn)行體重稱量，剔除個體過大和過小的鴨只，將個體適中的鴨進(jìn)行上籠飼養(yǎng)，上籠后逐漸增加光照時間，在達(dá)到產(chǎn)蛋高峰期后維持16 h光照直到試驗期結(jié)束，在299、300、301和449、450、451日齡時分別稱量連續(xù)3 d蛋重，作為個體300和450日齡的平均蛋重，根據(jù)個體300日齡時蛋重情況分別選取高蛋重，低蛋重2種極端表型以及中蛋重組個體各30只，共90只進(jìn)行蛋重差異分析，并采集這90只鴨的血液，供后續(xù)提取DNA用。

1.2 個體選擇和樣品采集

分別在高蛋重、中蛋重和低蛋重組450日齡時各組分別隨機(jī)選擇8只鴨屠宰，采集卵巢髓質(zhì)部組織，-80 ℃冰箱用于RNA提取。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和文庫構(gòu)建

采用血液小量提取試劑盒提取各樣本DNA(TIANGEN，DP348)，以提取的各DNA為模板，采用多重PCR方法對樣本進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物分別為Z-35251072-F：5′-tcctagtccaagcagtatattcac-3′，Z-35251072-R：5′-cagtggaggcctacataataaaag-3′；Z-35256947-F：5′-tttacagcacctcttctatctacc-3′；Z-35256947-R：5′-tacatgtccagaatactttgcaag-3′；Z-35278196-F：5′-aatttaagagggagaaaaaccag-3′；Z-35278196-R：5′-ttgatatgacactacaacagttcc-3′。第一輪擴(kuò)增體系為：Primer Mix(50 nmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq酶(5 U/μL)0.1 μL，10× buffer 1 μL，基因組DNA(20 ng/μL)2 μL，Mg2+(100 mmol/L)1 μL，石蠟油10 μL，ddH2O 3.2 μL，共計20 μL；第一輪PCR反應(yīng)條件如下：①95 ℃ 15 min 預(yù)變性，1個循環(huán)；②94 ℃ 30 s，60 ℃ 10 min，4個循環(huán)；③94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)。第二輪PCR擴(kuò)增體系為：Barcode (2 μmol/L)3.6 μL，dNTP(2.5 mmol/L)0.8 μL，Taq酶(5 U/μL)0.1 μL，一輪產(chǎn)物樣本稀釋液10 μL，Mg2+(100 mmol/L)1 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 3.6 μL，石蠟油20 μL，總體系40 μL。第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：①95 ℃ 15 min，1個循環(huán)；②94 ℃ 30s，60 ℃ 4 min，5個循環(huán)；③94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，10個循環(huán)。對預(yù)變性二輪擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行混樣，對混樣后的文庫進(jìn)行純化并精確定量后稀釋至測序所需濃度(10 ng/μL)。

1.4 第二代測序

基于Illumina X-10測序平臺對RORB上3個遺傳變異進(jìn)行單個樣本的DNA高通量測序。具體方法為：①橋式PCR：使用NaOH將雙鏈DNA文庫變性為單鏈；將單鏈DNA模板雜交到Flow Cell 上；以Flow Cell 表面上的oligos為引物合成第一鏈；沖走單鏈DNA模板，以合成的第一鏈為模板進(jìn)行35循環(huán)的橋式PCR；將與P5接頭連接的DNA鏈從Flow Cell 上去除；阻斷3′-OH防止在后續(xù)測序過程中繼續(xù)延伸DNA鏈；雜交測序引物。② 測序反應(yīng)：將橋式PCR產(chǎn)物于Illumina X-10測序平臺上機(jī)測序，操作流程按照標(biāo)準(zhǔn)化工作流程進(jìn)行。根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計每個樣本各位點的基因變異情況。

1.5 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA

卵巢組織的總RNA提取按照TRNzol- A+總RNA提取試劑(DP421，TIANGEN公司)說明書進(jìn)行。提取后的RNA用分光光度計測其純度和濃度。參照cDNA第一鏈合成試劑盒(KR118，TIANGEN公司)說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)

根據(jù)NCBI上PER2、BMAL1、CLOCK和RORB基因組信息，Primer Premier 5.0軟件在外顯子區(qū)設(shè)計基因的PCR引物。以β-actin作為內(nèi)參基因，基因及引物信息見表1。

表1 試驗用基因及引物信息

采用SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑彩色版(SYBR Green)試劑(TIANGEN，F(xiàn)P215)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系：2×SuperReal Color Pre Mix 10 μL，正反向引物共0.8 μL，cDNA模版2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，反應(yīng)條件為：①95 ℃ 5 min預(yù)變性；②95 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)；③95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。qRT-PCR試驗結(jié)果采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，采用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析和相關(guān)回歸分析方法進(jìn)行統(tǒng)計分析，P< 0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組別鴨蛋重差異分析

由表2可見，低蛋重組、中蛋重組和高蛋重組三組間無論在300日齡還是450日齡蛋重差異均顯著(P<0.05)。

表2 不同組別鴨蛋重差異分析

2.2 RORB基因突變位點不同基因型鴨蛋重差異分析

由于RORB基因位于母鴨的Z號染色體，該染色體僅有1條，由表3可見，RORB基因Z-35251072 C>T和Z-35256947 T>C突變位點的堿基類型在300 d蛋重差異不顯著(P>0.05)，450 d蛋重差異顯著(P<0.05)，RORB基因Z-35278196 T>C的突變位點的不同堿基類型在300 d和450 d的蛋重差異均顯著(P<0.05)。

表3 RORB基因突變位點不同堿基類型鴨蛋重差異分析

2.3 鴨RORB各突變位點相互間及與產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性分析

由表4可見，鴨RORB基因Z-35251072 C>T，Z-35256947 T>C，Z-35278196 T>C 3個突變位點相互間呈顯著正相關(guān)，即若Z-35251072位點是野生型C，則Z-35251072 和Z-35256947位點也多為野生型T，反之亦然；Z-35278196 T>C和Z-35256947 T>C 2突變位點與300 d蛋重呈不顯著負(fù)相關(guān)(P>0.05)，與450d蛋重呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Z-35278196 T>C突變位點與300日齡蛋重和450日齡蛋重均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.4 鴨RORB及其相關(guān)基因表達(dá)量差異分析

由表5可見，RORB和PER2基因在低蛋重組的表達(dá)量顯著高于中蛋重和高蛋重組(P<0.05)，在高蛋重和中蛋重組間的差異不顯著(P>0.05)，CLOCK和BMAL1基因在高蛋重組的表達(dá)量顯著高于中蛋重和低蛋重組(P<0.05)，在中蛋重和低蛋重組間差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

生物節(jié)律是一種被廣泛認(rèn)知的生物體隨晝夜周期變化而呈現(xiàn)的生命活動周期性變化的現(xiàn)象。在家禽中生物節(jié)律對性腺發(fā)育、產(chǎn)蛋周期以及生長等具有調(diào)節(jié)作用[23]，而其本質(zhì)是受時鐘基因的節(jié)律性表達(dá)的影響。在雞中對產(chǎn)蛋量高和低的母雞的大白卵泡、小黃卵泡和大黃卵泡3個發(fā)育階段的卵泡轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)18個與產(chǎn)卵相關(guān)的候選基因，其中包括RORB[24]，提示RORB與禽產(chǎn)卵相關(guān)的發(fā)育相關(guān)，本研究首次發(fā)現(xiàn)影響鴨的300日齡和/或450日齡蛋重的鴨RORB基因Z-35251072上C→T，Z-35256947上T→C，Z-35278196上T→C 3個突變位點，且這3個遺傳突變相互間呈正相關(guān)，與蛋重呈顯著負(fù)相關(guān)。遺傳上，產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重呈負(fù)相關(guān)，且高達(dá)-0.4[25]，在茶花雞上的研究表明43周齡蛋重與43周齡產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.043[26]，由此推測鴨的RORB的遺傳突變與鴨的300日齡和450日齡產(chǎn)蛋量呈正相關(guān)，再次為RORB基因在禽產(chǎn)卵過程中發(fā)揮作用提供理論依據(jù)。

本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法對不同產(chǎn)蛋量鴨基因表達(dá)差異研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋鴨卵巢中晝夜節(jié)律信號通路相關(guān)基因尤其是生物鐘基因CLOCK，PER2的表達(dá)水平與產(chǎn)蛋量密切相關(guān)[27]，而且CLOCK和PER2在鴨的不同等級卵泡中均有表達(dá)。也有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋雞漏斗部(捕獲蛋黃的部位)和子宮部(形成蛋殼的部位)的生物鐘基因BMAL1、CLOCK、PER2和PER3在排卵過程中發(fā)揮了重要作用[28]。在本研究中，鴨RORB和PER2在蛋重低組表達(dá)量顯著增高，而CLOCK和BMAL1在蛋重高組表達(dá)量顯著增高，這一結(jié)果提示晝夜節(jié)律相關(guān)基因RORB、PER2、CLOCK、BMAL1在調(diào)節(jié)鴨的蛋重中可能發(fā)揮重要作用。研究表明，在分子水平上，時鐘系統(tǒng)由幾個互為聯(lián)系的負(fù)反饋和正前饋回路組成的整體網(wǎng)絡(luò)。生物鐘的基本分子循環(huán)系統(tǒng)在組織之間是相似的，正環(huán)主要由基本螺旋-環(huán)-螺旋/PAS型轉(zhuǎn)錄激活子BMAL1和CLOCK或其旁系同源物NPAS2組成，而2種隱色素(CRY)和3個周期蛋白(PER)參與循環(huán)通路的負(fù)性調(diào)控[12，19-21，29]。BMAL1時鐘異二聚體通過與靶基因啟動子調(diào)控區(qū)中的E-box增強(qiáng)子(CACGTG)相互作用，積極調(diào)節(jié)許多基因的晝夜節(jié)律表達(dá)，包括PER和CRY。當(dāng)PER和CRY蛋白積累到臨界水平時，其又通過直接與BMAL1-CLOCK復(fù)合物相互作用抑制BMAL1-CLOCK介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，包括其自身的轉(zhuǎn)錄，隨后導(dǎo)致PER和CRY蛋白水平降低，并導(dǎo)致新的激活和抑制循環(huán)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLOCK和BMAL1基因呈現(xiàn)一致性的表達(dá)變化，與PER2基因的表達(dá)變化相反，這一結(jié)果與上述的循環(huán)通路的調(diào)控理論是相符的，而RORB與PER2的基因表達(dá)呈一致性的變化，據(jù)此推測鴨RORB對晝夜節(jié)律時鐘網(wǎng)絡(luò)具有負(fù)調(diào)控作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了鴨晝夜節(jié)律相關(guān)基因，尤其是鴨RORB的相關(guān)研究，為鴨的產(chǎn)蛋性能調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過Illumina測序的方法檢測了金定鴨RORB基因上Z-35251072、 Z-35256947、Z-35278196這3個位點的SNP突變情況，并分析了其與蛋重的相關(guān)性，證實3個SNP的突變與蛋重顯著負(fù)相關(guān)；RORB及相關(guān)基因的表達(dá)在不同蛋重組中差異顯著；這些結(jié)果提示RORB基因在蛋重的調(diào)節(jié)中可能具有重要作用。