馬程遙, 宋珊珊, 王一清, 趙 權(quán), 3, 戴國梁, 許美娟, 居文政

(1. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 臨床藥理科,江蘇 南京 210029;2. 南京中醫(yī)藥大學博士后流動站,江蘇 南京 210023;3. 南京中醫(yī)藥大學常州附屬醫(yī)院 藥學部,江蘇 常州 213003)

抑郁癥是全球普遍的情感障礙疾病,屬中醫(yī)“郁癥”范疇,中醫(yī)師多從肝論治,而仝小林院士采用補腎陽之法,另辟蹊徑,從腎論治[1]。腎者,屬水,主藏志,抑郁癥的精力減退,認知遲鈍,失眠健忘等均符合腎虛癥狀。青娥丸為補腎助陽之良方,由杜仲、補骨脂、核桃仁和大蒜組成,本課題組前期研究證實,青娥丸可顯著改善慢性不可預見性溫和刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠的抑郁樣行為[2]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是系統(tǒng)生物學分支之一,其通過構(gòu)建“成分-靶點-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò),形象地反映中藥“多成分、多靶點、多途徑”的起效特點,直觀地闡明藥物的作用機制,對揭示中藥及其復方發(fā)揮療效的內(nèi)在機制有著重要貢獻[3]。本研究通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)識別入血成分,在此基礎(chǔ)上結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學預測干預靶點,通過分子對接和蛋白免疫印跡綜合驗證,研究青娥丸中具有抗抑郁效用的潛在化學成分及其作用靶點。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑鹽杜仲(貴州,20210302-01,貴州同德藥業(yè))、鹽補骨脂(云南,210401,馬鞍山井泉中藥)、核桃仁(山西,21010615,安徽協(xié)和成藥業(yè))、大蒜(山東,210613,南京侯家橋農(nóng)貿(mào)市場);京尼平苷酸(Z24A10X95926),補骨脂素(091019),異補骨脂素(091104),含量均≥ 98%,購自上海源葉生物;乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純);ERα、ERβ抗體(英國Abcam);GAPDH抗體(美國Proteintech)。

1.2 儀器UHPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng):Agilent 1290超高性能液相色譜儀(美國Agilent),Triple-TOF 5600質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB Sciex);Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(德國Heraeus);Drict-Q超純水機(法國Millipore);Centri Vap離心濃縮儀(Labconco公司);HB-202恒溫金屬浴(杭州博日);4600化學發(fā)光圖形分析系統(tǒng)(上海天能)。

1.3 動物SD雄性大鼠(SPF級,200 ± 20 g),由南京青龍山動物繁殖場提供,并嚴格按照南京中醫(yī)院大學附屬醫(yī)院倫理標準執(zhí)行(No 21DW-16-01)。

1.4 方法

1.4.1青娥丸入血成分分析

1.4.1.1 青娥丸提取液的制備 青娥丸組方為鹽杜仲480 g,鹽補骨脂240 g,核桃仁150 g,大蒜120 g。加8倍量水回流提取2次,每次2 h,將兩次提取液合并,紗布過濾,濃縮至1 mL藥液相當于生藥1 g,于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 青娥丸含藥血漿的制備 4只SD大鼠,經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后,隨機分為對照組和給藥組,每組2只。連續(xù)3 d,每12 h灌胃11.22 g·kg-1生藥量的青娥丸提取液(6倍量臨床等效劑量)。末次給藥前,禁食12 h,并于0.5、1、3 h時分別眼眶取血,合并給藥組的各時間點血樣,4 000 r·min-1離心10 min,取血漿-80 ℃儲存,備用。

1.4.1.3 血漿樣品的前處理 取血漿200 μL,加入800 μL甲醇,渦旋1 min,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,40 ℃離心濃縮。殘渣加入100 μL 50%甲醇,渦旋復溶,12 000 r·min-1離心10 min 取上清液,再次離心取上清,進行UPLC-Q-TOF-MS分析。

1.4.1.4 液相條件 色譜柱:Agilent SB C18(4.6×100 mm,1.8 μm);流動相:A: 0.1%甲酸水溶液,B:甲醇 ∶乙腈=1 ∶1(V/V),梯度洗脫,流速0.4 mL·min-1,柱溫:40℃。梯度洗脫程序:0～2.5 min, 15%～20% B; 2.5～7.0 min, 20%～25% B; 7.0～12.0 min, 25%～50% B; 12.0～19.0 min, 50%～90% B; 19.0～21.0 min, 90% B; 21.0～28.0 min, 90%～60%; 28.0～31.0 min, 60%～15% B; 31.0～35.0 min, 15% B。

1.4.1.5 質(zhì)譜條件 ESI源正、負離子掃描,離子源溫度550 ℃。負離子源電壓分別為-4 500 V,DP: 80 V, CUR: 20, CE: 10 eV;二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集,DP: 100V, CE: 25 eV, CES: 15。正離子源電壓分別為5 500 V,DP: 100 V. CUR: 20, CE: 10 eV;二級質(zhì)譜采集,DP: 100 V, CE: 30 eV, CES: 15。

1.4.2網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

1.4.2.1 藥物入血成分靶點預測 借助PharmMapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)平臺,結(jié)合PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 報道的成分相關(guān)基因,對鑒別出的入血成分進行靶點預測。應(yīng)用STRING (https://cn.string-db.org/) 數(shù)據(jù)庫規(guī)范預測的靶點和基因,獲得統(tǒng)一基因名。

1.4.2.2 抑郁癥相關(guān)靶點的獲取 在數(shù)據(jù)庫DisGeNET (degree >0.33, https://www.disgenet.org/home/) 和 GeneCards (degree >3, https://www.genecards.org/) 以關(guān)鍵詞“Major depressive disorder”和“Depressive Disorder”進行檢索,得到抑郁癥的潛在治療靶點。取疾病-靶點和入血成分干預靶點的交集,獲得青娥丸入血成分的抗抑郁效應(yīng)靶點。

1.4.2.3 青娥丸入血成分-抑郁癥靶點拓撲分析 將上述篩選到的青娥丸改善抑郁癥的靶點與成分相關(guān)聯(lián),應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建青娥丸入血成分-抗抑郁靶點網(wǎng)絡(luò),并用“Network Analyzer”對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析,獲取核心活性成分(degree >10)和重要起效靶點(degree ≥ 3)。

1.4.2.4 GO生物進程及KEGG通路分析 基于R 4.1.2中的ClusterProfiler包,以P<0.05、Q<0.2,對核心靶點進行GO生物進程和KEGG富集分析。

1.4.2.5 核心成分-靶點-通路分析 基于R中的Circlize包繪制和弦圖,分析KEGG通路-靶點-核心成分的對應(yīng)關(guān)系,篩選出多成分調(diào)控且涉及多個通路的核心靶點,以及多成分調(diào)控且僅針對某一通路的關(guān)鍵靶點。

1.4.2.6 分子對接驗證 選擇成分-靶點-通路分析分析中篩選出的核心靶點和關(guān)鍵靶點蛋白,運用Autodock vina軟件進行分子對接,預測成分與靶點蛋白的親和作用,并基于R中的pheatmap包繪制分子與蛋白的結(jié)合能熱圖。

1.4.2.7 蛋白免疫印跡驗證 取課題組前期青娥丸干預CUMS抑郁模型大鼠實驗的海馬樣本[2],于冰上RIPA研磨裂解,BCA法定量,加入蛋白上樣緩沖液(5×)金屬浴變性。使用12%的SDS聚丙烯凝膠進行電泳,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后,于4 ℃孵育一抗過夜:ERα、ERβ(1 ∶10 000),GAPDH(1 ∶5 000)。次日,TBST洗膜3次,室溫孵育二抗(1 ∶5 000)1 h,再經(jīng)TBST洗膜3次,加入現(xiàn)配的ECL顯影液,于凝膠成像儀掃描成像。

2 結(jié)果

2.1 青娥丸提取物入血成分分析在上述色譜、質(zhì)譜條件下,應(yīng)用UHPLC-Q-TOF-MS獲取相應(yīng)的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù),根據(jù)準確相對分子量推測化合物的分子式,通過對已有文獻報道的青娥丸所含藥味的成分[4-5],進行二級質(zhì)譜匹配,共指認入血的外源性峰15個,識別出青娥丸所含成分18個,包括京尼平苷酸、補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂素、異補骨脂素等,見Tab 1。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學預測結(jié)果

2.2.1青娥丸入血成分治療抑郁癥靶點篩選 通過PharmMapper平臺結(jié)合PubChem數(shù)據(jù)庫,對鑒別出的18個潛在入血成分進行靶點預測,去除重復靶點后,共得到青娥丸入血成分潛在靶標404個。通過GeneCards和DisGeNET數(shù)據(jù)庫,共檢索到254個潛在抗抑郁靶點。將入血成分的靶點與干預疾病的潛在靶點進行Venn分析,共得到50個可能與青娥丸入血成分防治抑郁癥的相關(guān)靶點。

2.2.2核心靶點和關(guān)鍵成分的拓撲分析 將上述篩選到的青娥丸改善抑郁癥的靶點對應(yīng)回成分,應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò),見Fig 1,并經(jīng)“Network Analyzer”功能進行拓撲分析,圓形代表靶點,八邊形代表入血成分。degree值越大,則形狀越大、顏色越偏深紅,代表與其相關(guān)聯(lián)的靶點/成分越多,越可能是潛在的重要活性成分或抗抑郁靶點。

Tab 1 Identification analysis on drug-containing plasma of Qing’e Pill

*為與標準品比對后,鑒別出的成分;E. u:杜仲(EcomomiaulmoidesOliv);P. c:補骨脂(PsoraleacorylifoliaLinn.)

由Fig 1可見,拓撲分析篩得EGFR、ESR2、ESR1、PDE4B、AR等共計26個重要靶點 (degree ≥ 3),用于進一步GO、KEGG富集分析;成分篩選可見,京尼平苷酸、異補骨脂素、大豆苷元等9個入血成分 (degree >10) 能影響更多的潛在抗抑郁靶點蛋白,在青娥丸發(fā)揮抗抑郁作用的過程中扮演重要角色。

2.2.3GO生物進程分析及KEGG通路富集分析 GO生物進程分析見Fig 2A,可得知交集基因主要涉及對異種刺激的反應(yīng)、對凋亡信號通路的負調(diào)控、對類固醇激素的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)和對凋亡信號通路的調(diào)控等生物過程;KEGG富集分析結(jié)果如Fig 2B所示,可知青娥丸主要通過PI3K-Akt、HIF-1、FoxO、雌激素和MAPK等信號通路,發(fā)揮抗抑郁效用。

2.2.4青娥丸入血成分-靶點-通路關(guān)系分析 經(jīng)Circlize繪制和弦圖Fig 3,可知靶點EGFR、AKT1均受多個關(guān)鍵成分調(diào)控,且參與PI3K-AKT、HIF-1、FoxO、MAPK和JAK-STAT等多個信號通路,推測為青娥丸發(fā)揮抗抑郁作用的核心靶點;而ESR1、ESR2受眾多成分調(diào)控,僅參與雌激素通路,推測為青娥丸干預抑郁癥的關(guān)鍵靶點。

2.2.5分子對接 將上述篩出的核心成分分別與核心/關(guān)鍵靶點進行分子對接,證實成分對靶點的調(diào)控能力,見Fig 4。結(jié)果顯示的結(jié)合能越小,則配體和受體結(jié)合力越強。

Fig 1 Constituent-target network

Fig 3 Circos diagram of core constituent-important target-pathway

Fig 4 Heatmap based on binding energy among key targets and core constituents

2.2.6蛋白免疫印跡結(jié)果 相較于正常組(Ctrl),經(jīng)CUMS造模的抑郁模型組(Model)表現(xiàn)出較低的ERα和ERβ蛋白表達,而經(jīng)不同劑量青娥丸干預后(Q-L:臨床等效劑量;Q-M:3倍臨床等效劑量;Q-H:9倍臨床等效劑量),ERα和ERβ蛋白表達量均呈現(xiàn)回調(diào)趨勢,見Fig 5。上述結(jié)果與文獻一致[2],證實青娥丸水提物對由ESR1和ESR2基因編碼的ERα和ERβ蛋白,確有調(diào)控作用。

Fig 5 Qing’e pill improved protein expression of ERα and ERβ in hippocampus of CUMS rats

3 討論

青娥丸為溫腎補陽之名方,契合仝小林院士治療抑郁癥的溫補腎陽之法[1],本課題組前期也構(gòu)建了腎陽虛型抑郁大鼠模型[6]。前期研究表明,青娥丸對CUMS抑郁模型大鼠確有改善抑郁行為之效,并可干預BDNF、TrkB等蛋白表達[2],但對于青娥丸抗抑郁的潛在藥效成分及作用靶點未作深入探討。

本研究應(yīng)用LC-Q-TOF/MS系統(tǒng),從灌胃青娥丸水提物大鼠的血漿中識別出入血成分18個,主要有環(huán)烯醚萜、木脂素、香豆素、黃酮等類別成分。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò),探討青娥丸抗抑郁活性的潛在藥效成分、靶點和通路。在18個入血成分中,京尼平苷酸、異補骨脂素、大豆苷元等9個成分在網(wǎng)絡(luò)中有重要作用。據(jù)報道,京尼平苷酸具有改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠空間學習能力和記憶缺陷,并能緩解神經(jīng)炎癥[7];大豆苷元對MPTP誘導的PD模型小鼠具有神經(jīng)保護作用[8];異補骨脂素可通過ERα受體發(fā)揮脊髓損傷的神經(jīng)保護作用[9]。據(jù)報道[10-11],大豆苷元和京尼平苷酸均可透過血腦屏障。

通過對26個重要靶點進行GO和KEGG富集分析,發(fā)現(xiàn)上述靶點主要涉及負向調(diào)控凋亡信號通路、對類固醇激素和脂多糖的反應(yīng)等生物過程,通過PI3K-AKT、MAPK、Estrogen、JAK-STAT等多條通路改善抑郁。其中PI3K-AKT通路最為顯著,該通路參與細胞凋亡和炎癥反應(yīng)等過程,激活PI3K-AKT通路可引起神經(jīng)元凋亡引發(fā)抑郁樣行為[12],而抑制PI3K-AKT通路可緩解神經(jīng)炎癥反應(yīng)[13];雌激素可阻斷小膠質(zhì)細胞應(yīng)對脂多糖的炎性激活,并抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)[14];JAK-STAT通路參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個功能,有臨床研究表明該通路可能參與了抑郁癥的生理病理過程[15],抑制JAK-STAT通路可改善氟化物引發(fā)的小鼠抑郁樣行為[16];MAPK抑制劑SB239063可緩解小膠質(zhì)細胞的激活和神經(jīng)炎癥[17];而IL-17a被認為是引發(fā)小鼠抑郁樣行為的重要因素[18]。

經(jīng)和弦圖結(jié)果提示,EGFR、AKT1、ESR1和ESR2等靶點在青娥丸抗抑郁作用中具有重要地位。將青娥丸原方水提物入血成分中的9個核心成分與4個靶點進行分子對接,結(jié)果顯示,9個核心成分中7個與靶點均能有較好親和力,結(jié)合蛋白免疫印跡結(jié)果:青娥丸水提物可上調(diào)CUMS模型大鼠ERα和ERβ蛋白(由ESR1和ESR2基因編碼)的表達,進一步證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)果的可靠性。

綜上,本實驗基于UPLC-Q-TOF-MS技術(shù),準確快速地揭示了青娥丸入血成分;應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法,對青娥丸抗抑郁的潛在藥效成分、作用靶點進行了研究;綜合分子對接技術(shù)和蛋白免疫印跡法驗證靶點蛋白,初步闡述了青娥丸抗抑郁活性的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制,為青娥丸抗抑郁癥的臨床前機制研究和臨床療效試驗奠定基礎(chǔ)。