曲智鋒,徐 遠(yuǎn),原 翔,婁朝暄

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1. 放療科、2.PICC門(mén)診、3. 腫瘤表觀(guān)遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、4. 藥劑科,河南 洛陽(yáng) 471003)

食管癌是目前臨床上非常常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,死亡率極高,在我國(guó),食管鱗狀細(xì)胞癌仍然是食管癌主要的組織學(xué)類(lèi)型[1]。臨床上對(duì)該病的治療手段主要是以放化療為主,不過(guò)其整體預(yù)后不佳,研究認(rèn)為口腔衛(wèi)生不良和牙周炎等與胃腸道腫瘤疾病有一定的聯(lián)系。研究曾指出牙齦卟啉單胞菌就是牙周疾病的關(guān)鍵致病菌之一[2]。所以需盡早明確有效的治療藥物。替硝唑是一類(lèi)硝基咪唑類(lèi)抗菌藥物,用于各種厭氧菌感染,也用于結(jié)腸直腸手術(shù)、婦產(chǎn)科手術(shù)及口腔手術(shù)等的術(shù)前預(yù)防用藥[3]。此外,IL-6/STAT3信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,其可參與炎癥性疾病和惡性腫瘤等病變的發(fā)生,認(rèn)為IL-6/STAT3介導(dǎo)的信號(hào)通路與食管癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,并影響食管癌的預(yù)后[4]。但是目前并未有研究針對(duì)替硝唑?qū)ρ例l卟啉單胞菌參與的食管鱗癌的影響進(jìn)行過(guò)分析,其具體機(jī)制也不明確,因此,本研究以食管癌模型小鼠為研究對(duì)象,分析替硝唑?qū)ζ涞挠绊懠皺C(jī)制,為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于與分組 選取50只C57BL/6雄性小鼠為研究對(duì)象,購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,將其隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、替硝唑低、中、高劑量組,每組各10只。

1.1.2儀器與試劑 替硝唑片(中國(guó)山西津華暉星制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20023791)、烏拉坦溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20120125)、PBS緩沖液(武漢普諾賽生命科技有限公司,批號(hào)WH0321E111)、石蠟(solarbio公司,批號(hào)YA0013)、BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、ELISA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào)E-BC-K318-M、DTA00D、BK50)、離心機(jī)、凝膠成像儀(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司,批號(hào)20163854、180524)、PCR儀、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,批號(hào)A51685、1658000)、組織勻漿機(jī)(深圳欣博盛生物科技有限公司,批號(hào)B297805)、兔抗鼠IL-6抗體、STAT3單克隆抗體、p-STAT3單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司,批號(hào)ab233706、10000862、ab267373)。

1.2 方法

1.2.1模型制備及給藥 除對(duì)照組外,其余小鼠采用20%烏拉坦溶液,按小鼠體質(zhì)量6 μL·g-1進(jìn)行給藥,于顯微鏡下分別對(duì)小鼠左右上頜第二磨牙進(jìn)行絲線(xiàn)結(jié)扎。取牙齦卟啉單胞菌以2 000 r·min-1離心10 min,2%羧甲基纖維素溶解牙齦卟啉單胞菌,濃度為2×1013L-1,取菌液50 μL涂抹于小鼠上頜磨牙區(qū),隔天涂抹,連續(xù)2周。對(duì)照組和模型組不做處理,成模4周后,采用灌胃方式給藥處理并持續(xù)8周,替硝唑低、中、高劑量組分別采用15、10 、25 mg·kg-1的替硝唑進(jìn)行處理。

1.2.2記錄小鼠體質(zhì)量 給藥結(jié)束后對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱(chēng)體質(zhì)量、記錄。

1.2.3HE染色觀(guān)察小鼠病理變化 先麻醉小鼠,平躺固定,開(kāi)腹后用生理鹽水充分沖洗,固定后酒精脫水,將組織塊放入溶于酒精和石蠟的透明劑中,放入培養(yǎng)箱中。石蠟完全浸入組織塊后,連續(xù)5 μm切片,進(jìn)行染色,然后觀(guān)察各組小鼠食管組織的病理學(xué)變化。

1.2.4ELISA檢測(cè)各組小鼠血清炎性細(xì)胞因子 采用小鼠眼球取血方法采集血液,離心后置于-80 ℃環(huán)境中待檢,采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá),嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5Western blot檢測(cè)IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 收集組織勻漿后提取總蛋白,RIPA緩沖液裂解,冰上孵育后12 000 r·min-1離心5 min,取上清測(cè)定總蛋白濃度后。進(jìn)行定量,然后灌膠,加足夠電泳液進(jìn)行上樣,再進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,將膜用TBS浸濕后搖動(dòng)封閉1 h,加IL-6、STAT3、p-STAT3抗體(1 ∶1 000)、4 ℃孵育過(guò)夜后加入二抗(1 ∶3 000) ,37 ℃放置30 min,TBST洗滌3遍后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè),然后浸入顯影液中顯色、最后凝膠成像,使用β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6PCR檢測(cè)IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表達(dá) 提取組織于無(wú)酶勻漿器中、加入TRIzol試劑提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)要求,將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再進(jìn)行擴(kuò)增,以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)相對(duì)表達(dá):ΔCt =目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct,引物序列見(jiàn)Tab 1。

2 結(jié)果

2.1 替硝唑可改善牙齦卟啉單胞菌參與的鼠食管鱗癌模型體質(zhì)量與對(duì)照組相比,模型組組小鼠體質(zhì)量較低,與模型組相比,替硝唑各劑量組小鼠體質(zhì)量較高,P<0.05,見(jiàn)Tab 2。

Tab 1 Primer sequences

Tab 2 Comparison of body mass of

2.2 替硝唑可改善牙齦卟啉單胞菌參與的鼠食管鱗癌模型食管病理變化對(duì)照組上皮完整,基底細(xì)胞大小均勻,排列整齊,未見(jiàn)明顯細(xì)胞增殖;模型組食管黏膜上皮增厚,基底細(xì)胞呈彌漫性增生;基底細(xì)胞表現(xiàn)為局灶性非典型增生,細(xì)胞層增多,排列紊亂,極性消失,黏膜表面角化層局灶性缺失;而替硝唑各劑量組均呈現(xiàn)出不同程度的改善。

2.3 替硝唑可改善牙齦卟啉單胞菌參與的鼠食管鱗癌模型血清炎癥因子與對(duì)照組相比,模型組組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平較高,與模型組相比,替硝唑各劑量組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平較低,P<0.05,見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Comparison of inflammatory factor levels among

2.4 替硝唑可改善牙齦卟啉單胞菌參與的鼠食管鱗癌模型組織IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)各組IL-6表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05,與對(duì)照組相比,模型組小鼠STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)較高,與模型組相比,替硝唑各劑量組小鼠血清STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)較低(P<0.05),見(jiàn)Tab 4、Fig 2。

Fig 2 Comparison of IL-6,STAT3 and p-STAT3

Tab 4 Comparison of IL-6,STAT3 and p-STAT3 proteins among

2.5 替硝唑可改善牙齦卟啉單胞菌參與的鼠食管鱗癌模型組織IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比,模型組小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表達(dá)較高,與模型組相比,替硝唑各劑量組小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3 mRNA表達(dá)較低(P<0.05),見(jiàn)Tab 5。

Tab 5 Comparison of IL-6,STAT3 and p-STAT3 mRNA in each group of

3 討論

食管鱗癌是以淋巴轉(zhuǎn)移為主要特征的疾病,流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)炎癥是腫瘤的重要特征之一[5]。目前許多研究均發(fā)現(xiàn),牙齦卟啉單胞菌可能是食管鱗癌的危險(xiǎn)因素,其在口腔、食管癌組織中均有檢出[6]。其次,替硝唑作為一類(lèi)硝基咪唑類(lèi)藥物,研究曾指出替硝唑的藥理機(jī)制是抑制致病菌的DNA合成,從而可以消除牙周組織中的細(xì)菌,抑制局部炎癥反應(yīng)[7]。因此,本研究主要分析替硝唑?qū)ρ例l卟啉單胞菌參與的食管鱗癌小鼠的影響及機(jī)制。

在本研究中,首先對(duì)小鼠的體質(zhì)量進(jìn)行了觀(guān)察,結(jié)果顯示,替硝唑各劑量組小鼠體質(zhì)量更高。這說(shuō)明替硝唑?qū)ρ例l卟啉單胞菌造成的食管鱗癌病變小鼠有一定的干預(yù)效果。其次,本研究還針對(duì)小鼠食管組織進(jìn)行了病理學(xué)觀(guān)察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,模型組小鼠食管黏膜上皮較厚,基底細(xì)胞出現(xiàn)彌漫性增生,基底細(xì)胞也出現(xiàn)了不典型增生,細(xì)胞排列十分雜亂,而替硝唑各劑量組均呈現(xiàn)出不同程度的改善。這表明,替硝唑可改善食管鱗癌小鼠的病理學(xué)變化。而牙齦卟啉單胞菌就屬于會(huì)在人體內(nèi)會(huì)黏附和入侵宿主細(xì)胞,促進(jìn)牙菌斑生物膜形成,并引起宿主免疫炎癥反應(yīng)的細(xì)菌[8]。因此,本研究對(duì)小鼠血清炎癥因子進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示替硝唑各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平有所改善,這說(shuō)明替硝唑可以改善牙齦卟啉單胞菌造成的食管鱗癌小鼠模型炎癥反應(yīng)。

IL-6/STAT3通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一般來(lái)說(shuō),IL-6的生物活性依賴(lài)于STAT3的激活,而STAT3通常以非激活的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[9]。曾有研究[10]認(rèn)為,STAT3抑制劑可以明顯抑制食管鱗癌來(lái)源的裸鼠皮下荷瘤生長(zhǎng)。因此,本研究對(duì)小鼠組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,模型組小鼠STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)較高,與模型組相比,替硝唑各劑量組小鼠血清STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)較低;而IL-6蛋白水平通常不表達(dá),在本研究中也證明了這一點(diǎn)。此外,與對(duì)照組相比,模型組小鼠IL-6、STAT3、p-STAT3基因表達(dá)較高,與模型組相比,替硝唑各劑量組小鼠血清IL-6、STAT3、p-STAT3基因表達(dá)較低。這說(shuō)明替硝唑在食管癌中有潛在的治療價(jià)值。食管鱗癌患者口腔唾液中牙齦卟啉單胞菌較高,而替硝唑是新型抗厭氧菌藥物的一種,本研究分析替硝唑或許可以通過(guò)IL-6/STAT3通路對(duì)牙齦卟啉單胞菌造成牙周炎而導(dǎo)致的食管損傷有一定的保護(hù)作用。

綜上所述,牙齦卟啉單胞菌造成牙周炎會(huì)促進(jìn)食管鱗癌病變和進(jìn)展,替硝唑可以改善牙齦卟啉單胞菌造成食管鱗癌模型的病理學(xué)變化以及炎癥反應(yīng),其機(jī)制與IL-6/STAT3信號(hào)通路有關(guān),但該過(guò)程涉及的通路較多,有待后續(xù)進(jìn)一步深入探究。