孔德鑫,張明亮,陳毓龍,李偉霞,,王曉艷,,吳婭麗,楊柳青,張 輝,陳小菲,李寒冰,吳宿慧,唐進(jìn)法,

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.第一附屬醫(yī)院/河南省中藥臨床應(yīng)用、評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化工程研究中心/河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450000)

藥物重定位,也稱為“藥物再利用或藥物再循環(huán)”,是通過發(fā)現(xiàn)已批準(zhǔn)上市藥物或潛在候選藥物中尋找新的適應(yīng)癥的策略。與傳統(tǒng)的藥物開發(fā)模式相比,已上市的藥物建立了完善的工藝流程、成熟的藥代動(dòng)力學(xué),明確的不良反應(yīng)、各期臨床數(shù)據(jù),從而大大減少了藥物的研發(fā)成本,并降低了藥物研發(fā)失敗的風(fēng)險(xiǎn),故對(duì)已上市藥物進(jìn)行重定位作為藥物開發(fā)的一種研發(fā)思路而備受關(guān)注[1]。如反應(yīng)停(Thalidomide)曾用于妊娠反應(yīng),后發(fā)現(xiàn)對(duì)孕婦具有嚴(yán)重的致畸性而被禁用,經(jīng)藥物重定位后,發(fā)現(xiàn)其對(duì)紅斑結(jié)節(jié)性麻風(fēng)等多種疾病具有良好的治療效果。隨著高通量測(cè)序技術(shù)成本的降低和藥物研發(fā)相關(guān)數(shù)據(jù)的不斷積累,通過生物信息學(xué)技術(shù)尋找藥物的新適應(yīng)證或新用途,進(jìn)而揭示潛在的治療作用機(jī)制,成為藥物重定位新的研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)有學(xué)者成功應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)二甲雙胍進(jìn)行重定位,發(fā)現(xiàn)其還可以通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,抑制MAPK信號(hào)通路,減輕炎癥反應(yīng)來(lái)發(fā)揮治療紅斑痤瘡的作用[2]。提示我們可以把這種方法應(yīng)用在更多正在臨床廣泛應(yīng)用或因嚴(yán)重不良反應(yīng)已經(jīng)撤市的藥物重定位研究當(dāng)中。

氧化苦參堿(oxymatrine,OMAT)具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿,是豆科植物苦參(SohoraflavescensAit.)和苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中的主要化學(xué)成分,已被臨床醫(yī)生成功應(yīng)用慢性乙肝和癌癥的治療,具有良好的療效[3],但其他方面的應(yīng)用較少,難以全面評(píng)價(jià)OMAT的藥理作用。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選OMAT可調(diào)控人或動(dòng)物的差異表達(dá)基因,通過Coexpedia數(shù)據(jù)庫(kù)和CMap數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OMAT進(jìn)行重定位,尋找OMAT潛在的臨床適應(yīng)癥,采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)重定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,并進(jìn)行作用機(jī)制探索,以期為今后OMAT的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器氧化苦參堿(A800927,Macklin公司);4%多聚甲醛(71040900,Biosharp生物科技公司);MOG35-55(MEVGWYRSPFRVVHLYRNGK,L2880,GenScript公司);百日咳毒素(#180,List Biological公司);弗氏不完全佐劑(#F5506,Sigma公司);結(jié)核分枝桿菌H37Ra(#231141,Difco公司);RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Mix試劑均購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司;引物(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司);生理鹽水(2112293201,石家莊四藥有限公司);QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀(applied-biosystems公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠12只,8～10周齡,體質(zhì)量18～20 g,購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)20190010,所有動(dòng)物的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理要求。

1.3 生物信息學(xué)研究

1.3.1差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)的篩選 基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),以“oxymatrine”為關(guān)鍵詞檢索其調(diào)控的相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)信息,應(yīng)用GEO在線分析工具GEO2R進(jìn)行分析,以P<0.05,∣Log2FC∣≥1.5[FC表示差異倍數(shù)(fold change)]為篩選條件,所篩選出的基因被視為OMAT可調(diào)控的DEGs。

1.3.2DEGs的共表達(dá)分析和MESH注釋 Coexpedia數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.coexpedia.org/)是一個(gè)基因共表達(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù),用于揭示基因共表達(dá)和醫(yī)學(xué)主題詞(Medical Subject Headings,MESH)之間的聯(lián)系。將OMAT調(diào)控的DEGs上傳至Coexpedia數(shù)據(jù)庫(kù),篩選相關(guān)的醫(yī)學(xué)主題詞。

1.3.3獲取與OMAT基因表達(dá)譜相似的化合物 CMap數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)由Broad Institute(布羅德研究所)開發(fā),匯總不同的小分子化合物擾動(dòng)不同類型細(xì)胞基因表達(dá)變化,從而聯(lián)立小分子藥物、基因表達(dá)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://clue.io/)。將OMAT干預(yù)后的DEGs上傳到CMap數(shù)據(jù)庫(kù),匹配與OMAT基因表達(dá)譜相似的化合物,匹配的化合物通過得分(+100,-100)反映匹配化合物與OMAT干預(yù)后基因表達(dá)譜的相似性,得分越高,說明該化合物的基因表達(dá)譜與OMAT干預(yù)后基因表達(dá)譜越相似。選取得分前十的化合物視為OMAT類似化合物,結(jié)合Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)和文獻(xiàn)檢索OMAT類似化合物的藥理作用,進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3.4OMAT重定位及代表性適應(yīng)癥靶點(diǎn)的收集 結(jié)合MESH注釋結(jié)果與CMap 匹配化合物的藥理作用,對(duì)OMAT進(jìn)行藥物重定位,選取其中最具代表性的適應(yīng)癥進(jìn)行后續(xù)研究,并基于GeneCards (https://www.genecards.org/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),檢索代表性適應(yīng)癥的靶點(diǎn)。進(jìn)而取其與OMAT調(diào)控DEGs的交集靶點(diǎn),獲得OMAT調(diào)控代表性適應(yīng)癥的潛在靶點(diǎn)。

1.3.5蛋白質(zhì)相互作用(protein-protem interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將整合后的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)分析,物種設(shè)定為“Homo Sapiens”并將結(jié)果通過 Cytoscape 3.9.0進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建,分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),篩選出核心靶點(diǎn)。

1.3.6GO和KEGG富集分析 為進(jìn)一步探究OMAT調(diào)控所選取的代表性適應(yīng)癥的潛在作用機(jī)制等,將“1.3.4”篩選的OMAT調(diào)控代表性適應(yīng)癥的潛在靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因功能分類(gene ontology,GO)和信號(hào)通路富集(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。GO分析包括細(xì)胞組成(cellular component,CC)、生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.4.1造模和給藥 實(shí)驗(yàn)自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)與多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis,MS)相似,是國(guó)際通用的MS模型,故選用EAE動(dòng)物模型進(jìn)行驗(yàn)證[4]。將12只小鼠分為2組:模型組(EAE組)、OMAT治療組(EAE+OMAT組),每組6只。取無(wú)菌MOG35-55用0.1 mol·L-1的PBS稀釋成2 g·L-1的溶液,與內(nèi)含2 g·L-1滅活結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑溶液按1 ∶1等體積混合,制成油包水乳液。50 mg·kg-1戊巴比妥溶液麻醉小鼠后,在其脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射0.2 mL抗原乳劑,并于免疫后d 0、d 2給每只小鼠腹腔注射200 ng百日咳毒素。EAE+OMAT組小鼠于免疫后d 10開始,每天1次灌胃20 mg·kg-1OMAT生理鹽水溶液;EAE組小鼠則同時(shí)給予等量生理鹽水溶液,均給藥至免疫后d 19。

1.4.2神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 自免疫當(dāng)日起,每日觀察并記錄小鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分[5]0分,無(wú)明顯癥狀;1分,尾部無(wú)力;2分,后肢無(wú)力;3分,后肢癱瘓;4分,前、后肢均癱瘓;5分,瀕死或死亡。若小鼠的神經(jīng)功能表現(xiàn)介于兩個(gè)評(píng)分之間,以±0.5分計(jì),評(píng)分≥1即視為發(fā)病,納入后續(xù)研究。

1.4.3組織病理檢查 實(shí)驗(yàn)小鼠于免疫后第19天,用生理鹽水進(jìn)行心臟灌流,取腦和脊髓,取出的脊髓組織液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存,腦組織固定于4%多聚甲醛24 h后,經(jīng)石蠟包埋、切片、脫水,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色和勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色以分別觀察腦組織炎癥浸潤(rùn)與髓鞘脫失程度,并進(jìn)行相關(guān)評(píng)分[6]。炎性浸潤(rùn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,無(wú)炎癥細(xì)胞;1分,少量分散的炎癥細(xì)胞;2分,血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),呈袖套樣;3分,大量血管袖套樣病變。髓鞘脫失評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,無(wú)髓鞘脫失;1分,罕見髓鞘脫失;2分,少量部位脫髓鞘;3分,大面積脫髓鞘。

1.4.4RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證OMAT調(diào)控MS的核心靶點(diǎn) 將脊髓組織按照總RNA提取試劑盒說明提取總RNA,合成cDNA。以cDNA做模板,按2×SYBR Green qPCR Mix試劑說明,加入引物進(jìn)行擴(kuò)增(引物序列見Tab 1)。采用△△CT法分析CT值,以2-ΔΔCT表示各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primers of PCR products of genes

2 結(jié)果

2.1 OMAT干預(yù)后的DEGs分析結(jié)果基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得編號(hào)為GSE85871的OMAT調(diào)控MCF7 細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集,采用GEO中的在線分析工具GEO2R進(jìn)行分析,篩選得到DEGs共619個(gè),其中明顯下調(diào)的DEGs有274個(gè);明顯上調(diào)的DEGs有345個(gè),據(jù)所篩選出的DEGs作火山圖,見Fig 1。

Fig 1 Volcano plot of DEGs

2.2 OMAT干預(yù)后DEGs的共表達(dá)結(jié)果通過Coexpedia查詢OMAT干預(yù)后的DEGs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和MESH注釋結(jié)果。MESH注釋得到243個(gè)條目,Score代表各基因之間共表達(dá)關(guān)系大小。篩選Score前10的疾病主題詞,見Tab 2,因OMAT臨床已經(jīng)用于多種癌癥和肝炎,故腫瘤和肝炎相關(guān)主題詞不納入后續(xù)研究。主要包括呼吸系統(tǒng)疾病(希佩爾-林道綜合癥、哮喘)、炎癥相關(guān)疾病(關(guān)節(jié)炎、腸炎)和自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、MS)。

Tab 2 Analysis of annotations in co-expression networks

2.3 CMap匹配結(jié)果和藥物重定位以GSE85871相同的細(xì)胞MCF7為對(duì)象,匹配得到2 398個(gè)與OMAT具有一定相似性的小分子化合物。選取得分前十的化合物視為OMAT類似化合物,見Tab 3,并結(jié)合Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)和文獻(xiàn)檢索OMAT類似化合物的藥理作用,發(fā)現(xiàn)OMAT類似化合物的藥理作用主要涉及心血管、神經(jīng)、免疫等多個(gè)系統(tǒng),包括MS、肝炎、關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、腫瘤等多種疾病。

綜合分析DEGs注釋得到的疾病主題詞和OMAT類似化合物所對(duì)應(yīng)的適應(yīng)癥,發(fā)現(xiàn)均聚焦到MS、哮喘、關(guān)節(jié)炎等疾病,推測(cè)OMAT可能具有這些疾病的潛在治療作用。而在OMAT類似化合物中,具有治療MS藥理作用的化合物出現(xiàn)頻次最高。因此,以MS為例進(jìn)行后續(xù)研究。

Tab 3 Top 10 molecule compounds with high similarity to OMAT gene expression profiles

Fig 2 Analysis of interaction between OMAT and MS

2.4 OMAT治療MS交集靶點(diǎn)篩選以“Multiple Sclerosis”,“Relapsing-remitting Multiple Sclerosis”,“Progressive Multiple Sclerosis”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM、DisgeNet數(shù)據(jù)庫(kù)中收集MS相關(guān)靶點(diǎn),Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到144 423個(gè)相關(guān)靶點(diǎn),選“Relevance score”前1 000的靶點(diǎn)進(jìn)行研究,而DisgeNet數(shù)據(jù)庫(kù)中“Gda score”越高與疾病相關(guān)性越強(qiáng),選擇Gda score>0.1的靶點(diǎn)進(jìn)行研究。共得到MS相關(guān)靶點(diǎn)1 267個(gè),與OMAT調(diào)控的DEGs取交集,得到54個(gè)潛在的OMAT調(diào)控MS的基因靶點(diǎn),見Fig 2A。

2.5 OMAT治療MS交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集的靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析,利用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見Fig 2 B。對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,選取Degree值≥13(中位值)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn),依次為FGF2、IL4、ICAM1、CD86、CCL4、LEP、IL2RA。這些靶點(diǎn)涉及炎癥反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面,提示,OMAT可能通過作用這些靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮治療MS的作用機(jī)制。

2.6 OMAT治療MS交集靶點(diǎn)富集分析結(jié)果GO分析結(jié)果表明,BP主要涉及ERK1和ERK2的調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡等;CC主要涉及質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)等;MF主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性等,結(jié)果見Fig 3。KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果表明,交集靶點(diǎn)主要富集到JAK-STAT、鈣離子、Ras等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路,結(jié)果見Fig 4。推測(cè)OMAT治療MS的作用可能與以上功能過程和信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)。

Fig 3 Results of gene function GO enrichment analysis

Fig 4 Results of gene function KEGG enrichment analysis

2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.7.1OMAT對(duì)EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 EAE組小鼠于d 9相繼開始發(fā)病,d 11起出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀,在d 19達(dá)到峰值。OMAT+EAE組小鼠于d 10相繼開始發(fā)病,d 14起出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀。相比EAE組小鼠,EAE+OMAT組小鼠平均神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.01),見Fig 5。

2.7.2OMAT對(duì)EAE小鼠病理組織的影響 與EAE組小鼠比較,EAE+OMAT組小鼠腦組織炎癥浸潤(rùn)程度明顯減輕(P<0.01);髓鞘脫失評(píng)分結(jié)果表明,EAE+OMAT組小鼠比EAE組小鼠腦中髓鞘脫失程度明顯減輕(P<0.01),見Fig 6。

2.7.3OMAT對(duì)EAE小鼠脊髓中mRNA表達(dá)的影響 與EAE組小鼠相比,EAE+OMAT組小鼠脊髓的Fgfr2、Rras2、Raf1、Camk2a、Calm1的mRNA表達(dá)水平明顯降低(所有P<0.05),Fgf2的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),見Fig 7。

Fig 6 HE (A) and LFB staining (B) in mouse brain

3 討論

與傳統(tǒng)的藥物研發(fā)策略相比,基于已上市藥物的重定位不僅可以減少研發(fā)成本、節(jié)省研究周期,并能夠擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍,因此通過重定位擴(kuò)大藥物的應(yīng)用范圍備受關(guān)注[1]。OMAT作為臨床上廣泛應(yīng)用于肝炎和癌癥的天然生物堿,具有價(jià)格適宜、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)[3]。本研究利用藥物重定位策略,發(fā)現(xiàn) OMAT 具有潛在治療MS、關(guān)節(jié)炎等疾病的藥理作用,并以MS為例進(jìn)行后續(xù)研究。

Fig 7 The mRNA levels of target genes in spinal cord tissues of mice in each

在分析CMap數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到的與OMAT基因表達(dá)譜相似的小分子化合物中,糖皮質(zhì)激素類化合物(hydrocortisone)可以通過抗炎和免疫抑制的作用治療MS等自身免疫性炎癥性疾病;作用于中樞作用的化合物(LY-341495、acetylcholine、U-74389F、JWH-015)可以通過調(diào)控中樞神經(jīng)的信號(hào)傳遞,從而改善MS引起的中樞神經(jīng)損傷[7-9]?？寡最惢衔?mefenamic-acid、quercetagetin)通過調(diào)節(jié)免疫,抑制關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng),并對(duì)EAE小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[10]?？寡ㄐ纬深惢衔?rivaroxaban)通過抑制XA因子,抑制血栓形成,對(duì)于心血管疾病具有預(yù)防作用[11]。根據(jù)上述這些與OMAT基因表達(dá)譜相似的小分子的藥理作用及適應(yīng)癥,推測(cè)OMAT除了用于肝炎和癌癥的治療外,還有望對(duì)MS和關(guān)節(jié)炎起到一定治療的作用。本研究發(fā)現(xiàn)相似性得分前10的小分子化合物中有8種小分子均具有調(diào)控MS的作用。因此,選擇MS代表性的適應(yīng)癥進(jìn)行后續(xù)研究。MS是一種以免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病,具有易復(fù)發(fā)和致殘率高的特點(diǎn)[12]。本研究采用國(guó)際公認(rèn)的MS動(dòng)物模型 (EAE)來(lái)驗(yàn)證OMAT是否對(duì)MS具有治療作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OMAT明顯減輕了EAE小鼠發(fā)病程度,且中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失程度明顯減輕,證實(shí)了基于藥物重定位策略尋找OMAT的新適應(yīng)癥具有一定的可行性。

研究表明,ICAM1可以參與T淋巴細(xì)胞與血腦屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合,介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入中樞神經(jīng),從而加重MS的免疫浸潤(rùn)[13]。IL4可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)中免疫細(xì)胞的分化,促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)因子的分泌,參與免疫調(diào)節(jié)的過程,從而改善MS患者的發(fā)病情況[14]。而Fgf2是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的重要一員,在脫髓鞘和再髓鞘化過程中具有重要作用。一方面,Fgf2可以促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖和分化,促進(jìn)髓鞘的形成過程,且敲除Fgf2的EAE小鼠脊髓的神經(jīng)纖維變性和軸突丟失程度明顯增加,再髓鞘化軸突的數(shù)量明顯減少。但另一方面,Fgf2可以通過與受體Fgfr2相互作用,激活Wnt信號(hào)通路來(lái)干擾髓鞘形成,但阻斷Wnt信號(hào)通路后則完全消除了Fgf2對(duì)髓鞘形成的抑制作用[15]。提示我們Fgf2可能對(duì)髓鞘再生過程中具有雙向調(diào)節(jié)作用。而在PPI分析中也同樣篩選出了Fgf2、IL4、ICAM1等核心靶點(diǎn)。且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了OMAT 確可明顯下調(diào)Fgfr2的表達(dá),并明顯上調(diào)Fgf2表達(dá)。對(duì)于OMAT 對(duì)ICAM1與IL4的調(diào)節(jié)作用,焦霞等[16]研究發(fā)現(xiàn),OMAT可通過下調(diào)ICAM1的表達(dá),上調(diào)IL4的表達(dá),從而減輕哮喘小鼠的發(fā)病程度總結(jié)以上研究可知,OMAT可能通過調(diào)控Fgf2、IL4、ICAM1、Fgfr2等靶點(diǎn)發(fā)揮治療MS的作用。

KEGG通路富集結(jié)果顯示,OMAT治療MS的核心通路主要涉及Ras信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路等。Ras信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、炎癥反應(yīng)及凋亡等生理過程,是自身免疫病中炎癥反應(yīng)的重要通路,Ras蛋白在Ras通路起信號(hào)開關(guān)作用,當(dāng)Ras蛋白激活后,將Raf1蛋白募集到細(xì)胞上使其磷酸化,進(jìn)而調(diào)控下游ERK通路,刺激免疫細(xì)胞釋放多種炎性因子,從而參與MS的自身免疫反應(yīng)[17]。鈣離子信號(hào)通路在神經(jīng)元細(xì)胞間神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、細(xì)胞凋亡等過程起到重要作用,當(dāng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在受到刺激后,釋放過量的興奮性氨基酸,造成興奮性氨基酸在髓鞘中過度堆積,從而激活鈣離子信號(hào)通路中的CALM1和CAMK2a靶點(diǎn),促使Ca2+大量?jī)?nèi)流,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度超載,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致中樞神經(jīng)的損傷[18]。本研究證實(shí),OMAT確可明顯下調(diào)Ras信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)Rras2、Raf1和鈣離子信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)Camk2a、Calm1的表達(dá),提示OMAT可能通過調(diào)控Ras和鈣離子信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮治療MS的作用。

綜上所述,本研究通過生物信息學(xué)探討了一種對(duì)OMAT的藥理作用進(jìn)行重定位的方法,結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析OMAT可能為治療MS的潛在藥物,并分析OMAT可能的作用靶點(diǎn)及通路,該研究將有助于充實(shí)OMAT治療MS的相關(guān)研究,為OMAT的臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。