王登峰 張 露 梁 萍 秦志清 王 磊 江和基 黃志堅(jiān) 林建斌* 殷光文*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué),福建省動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;3.福建省淡水水產(chǎn)研究所,福州 350002)

大黃魚(Larimichthyscrocea)是我國重要經(jīng)濟(jì)魚種,2021年,我國大黃魚的產(chǎn)量超過25萬t,以網(wǎng)箱養(yǎng)殖為主,主要集中在福建、浙江、廣東和江蘇等沿海地區(qū),其中福建是核心養(yǎng)殖區(qū),產(chǎn)量占80%以上[1-2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷壯大,養(yǎng)殖密度、養(yǎng)殖用水和飼料質(zhì)量等各種問題不斷涌現(xiàn),導(dǎo)致大黃魚養(yǎng)殖中變形假單胞菌病、弧菌病、細(xì)菌性腸炎病、盾形纖毛蟲病、刺激隱核蟲病等細(xì)菌性和寄生蟲疾病頻發(fā),其中細(xì)菌性疾病是養(yǎng)殖過程中的主要病害[1]。腸道是細(xì)菌侵入的主要途徑,腸道健康有益于機(jī)體整體健康[3]。腸道菌群是腸道健康的基礎(chǔ),其厭氧發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)可調(diào)節(jié)腸道和宿主健康[4-5]。

腸道菌群合成的SCFAs包括乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)、丁酸(butyric acid,BA)、異丁酸(isobutyric acid,IBA)、戊酸(valeric acid,VA)、異戊酸(isovaleric acid,IVA)、己酸(caproic acid,CA)和異己酸(isocaproic acid,ICA),可作為細(xì)菌自身和宿主腸上皮細(xì)胞的能量來源,促進(jìn)細(xì)胞生長、降低腸內(nèi)環(huán)境pH和減少有害菌生長,也可調(diào)節(jié)宿主腸道免疫力和降低腸道炎癥反應(yīng)[6]。腸道菌群合成的SCFAs中乙酸、丙酸和丁酸含量較高,占80%以上[7-8]。有關(guān)哺乳動(dòng)物腸道菌群與健康的研究表明,腸道菌群產(chǎn)生的丁酸可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞和先天性淋巴細(xì)胞(ILC)產(chǎn)生白細(xì)胞介素-22(IL-22)以維持腸道穩(wěn)態(tài)[9]。但有關(guān)魚類腸道菌群與SCFAs關(guān)系的研究較少,目前僅有報(bào)道顯示斑馬魚腸道菌群可以產(chǎn)生SCFAs,并發(fā)現(xiàn)丁酸可減少中性粒細(xì)胞和M1型促炎巨噬細(xì)胞向傷口的募集而產(chǎn)生抗炎作用,且在魚類中存在保守性丁酸分子受體使這種抗炎作用具有普遍性,但丙酸在斑馬魚上具有促炎作用,與其在哺乳動(dòng)物中的抗炎作用不一致[10]。

近年來,我國研究人員對(duì)大黃魚消化道菌群[3,11-12]、菌群與健康的關(guān)系[4]以及不同養(yǎng)殖模式消化道菌群的差異[12-13]等方面進(jìn)行了細(xì)致研究,并研究了不同飼料原料與添加劑[14-16]、飼喂模式[17]等對(duì)大黃魚腸道菌群的影響,但大黃魚腸道菌群是否合成SCFAs以及不同SCFAs的合成與腸道菌群的相關(guān)性尚未見報(bào)道。鑒于此,本試驗(yàn)使用添加0.5%的不同海藻酶解物(復(fù)合海藻酶解物與海帶酶解物)的培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)大黃魚的腸道菌群,通過檢測(cè)培養(yǎng)物中不同SCFAs的含量和相應(yīng)菌群組成,研究不同海藻酶解物對(duì)大黃魚腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響以及腸道菌群與不同SCFAs合成的相關(guān)性,為大黃魚腸道菌群與健康的相關(guān)性研究以及開發(fā)海藻酶解物作為大黃魚飼料添加劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

厭氧培養(yǎng)基為GAM培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司),每升GAM培養(yǎng)基含有胨10 g、大豆胨3 g、酵母浸粉5 g、牛肉粉2.2 g、消化血清粉13.5 g、牛肝浸粉1.2 g、葡萄糖3 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.5 g、可溶性淀粉5 g、L-半胱氨酸鹽0.3 g、硫乙醇酸鈉0.3 g,按照說明書配制后調(diào)節(jié)pH至6.8。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大黃魚腸道菌群的采集與處理

2022年5月30日采集福建省寧德海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖、投喂冰鮮雜魚糜,近3個(gè)月內(nèi)無使用抗生素的1歲齡健康存活狀態(tài)大黃魚(體重150～200 g、體長20～24 cm)4尾。無菌環(huán)境下,采用75%酒精擦拭活體大黃魚體表,解剖,提取消化道,收集每尾魚的小腸和直腸內(nèi)容物,混勻,使用經(jīng)滅菌的GAM培養(yǎng)基按1 g∶9 mL的比例配制成腸道菌液YC1、YC2、YC3、YC4,冷藏備用。

1.2.2 腸道菌群的體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)試驗(yàn)分為3組;BC組,GAM培養(yǎng)基,作為對(duì)照組;TA組,GAM培養(yǎng)基中添加0.5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))復(fù)合海藻酶解物;TD組,GAM培養(yǎng)基中添加0.5%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))海帶酶解物。每組準(zhǔn)備玻璃大試管4支,分裝培養(yǎng)基9 mL/支,放入硬蠟3～5 g/支,同時(shí)做污染控制組3支(GAM培養(yǎng)基),115 ℃高壓20 min滅菌。冷卻至室溫后,添加過濾除菌的脫氧氯化血紅素和維生素K,最終濃度分別為12.5和2.5 mg/L,隨后加入1 mL(10%比例添加)已配制好的腸道菌液YC1、YC2、YC3、YC4至各組的4個(gè)大試管中,蠟封,上下顛倒充分混勻。污染控制組使用滅菌的GAM培養(yǎng)基做平行操作。各組在25 ℃、100 r/min下培養(yǎng)24 h,在污染控制組清亮無渾濁前提下對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行采樣,將每個(gè)試管顛倒混勻后從中取3 mL,-80 ℃保存。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定與分析

SCFAs的定性定量分析、腸道菌群培養(yǎng)物的16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序與以及SCFAs與腸道菌群的關(guān)聯(lián)分析均委托武漢邁維代謝有限公司進(jìn)行。16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序使用NovaSeq PE250方案,經(jīng)過Reads拼接過濾,操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類,進(jìn)行物種注釋及豐度分析、α多樣性分析和β多樣性分析等。SCFAs樣品制備過程如下:1)樣本解凍后,渦旋1 min混勻,12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min;2)取樣本上清50 μL加入到對(duì)應(yīng)的1.5 mL離心管中,加入100 μL 0.5%磷酸溶液,渦旋3 min;3)加入150 μL含內(nèi)標(biāo)的MTBE溶劑,渦旋3 min,冰浴下超聲5 min,之后在12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min;4)離心完后吸取上層清液90 μL到有玻璃內(nèi)襯管的進(jìn)樣瓶中,-20 ℃冰箱保存,待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS/MS)分析。色譜分析條件如下:色譜柱為Agilent DB-FFAP(30 m×0.25 mm,0.25 μm);設(shè)置進(jìn)樣口溫度200 ℃,檢測(cè)器溫度230 ℃,進(jìn)樣量為2 μL;升溫程序?yàn)? min內(nèi)升溫至90 ℃,隨后以25 ℃/min升至100 ℃,再以20 ℃/min升至150 ℃,150 ℃保持0.6 min,然后以25 ℃/min升至200 ℃,200 ℃保持 0.5 min,運(yùn)行3 min;設(shè)定分流比為1∶1;注流量為1.2 mL/min。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS 23軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCFAs合成量

由圖1可知,大黃魚腸道菌群在體外不同培養(yǎng)條件下均可以合成SCFAs。其中,使用GAM培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)(BC組)乙酸的合成量達(dá)到5.660 mmol/L,乙酸、丙酸和丁酸的比例約為94∶5∶1;使用添加0.5%復(fù)合海藻酶解物的GAM培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)(TA組)乙酸、丙酸和丁酸的比例變?yōu)?2∶4∶4,丁酸的合成量可達(dá)0.266 mmol/L,極顯著高于BC組的0.041 mmol/L和TD組(使用添加0.5%海帶酶解物的GAM培養(yǎng)基培養(yǎng))的0.075 mmol/L(P<0.01),且戊酸的合成量3.5倍于BC組(0.000 1 mmol/L),同時(shí)丙酸的合成量由BC組的0.291 mmol/L降至0.234 mmol/L,且合成SCFAs的總量增加,但不同個(gè)體腸道菌群合成丙酸能力差異較大;與BC組相比,GAM培養(yǎng)基中加入0.5%海帶酶解物僅極顯著增加了戊酸的合成量(P<0.01)。

數(shù)據(jù)柱顯示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”,P<0.01標(biāo)注為“**”。

2.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 分組差異性分析

大黃魚腸道菌群體外不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的丁酸和戊酸有極顯著差異,腸道菌群的改變可能是造成這種差異的主要原因,因此使用16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步研究。腸道菌群體外培養(yǎng)物經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序后,首先基于Unweighted Unifrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA),PCoA圖中樣本距離越接近,表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似,因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣本傾向于聚集在一起,群落結(jié)構(gòu)差異很大的樣本則會(huì)分開。PCoA圖(圖2)顯示,TA組的樣本基本聚集在相對(duì)獨(dú)立的群落,與TD組和BC組樣本距離較遠(yuǎn);TD組和BC組樣本群落間有距離,但距離較近。

基于Unweighted Unifrac距離的PCoA,方差分析:P=0.004。圖中的每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)樣本,同一個(gè)組的樣本使用同一種顏色表示,顏色區(qū)域代表置信區(qū)間。

使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法Anosim分析檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異,并基于Bray-Curtis距離值的秩次進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明,BC組與TD組的組內(nèi)差異大于組間差異(R=-0.146),TA組與BC組(R=0.240)和TD組(R=0.208)的組間差異顯著,但顯示統(tǒng)計(jì)分析的可信度不具有顯著性(P>0.05),見圖3。

2.2.2 樣本差異性分析

使用α多樣性指數(shù)進(jìn)行組間樣本的差異性分析,并使用可以直觀反映組內(nèi)物種多樣性中位數(shù)值、離散程度、最大值、最小值、異常值的箱形圖展示。Observed_species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)均顯示3個(gè)組存在差異,除Simpson指數(shù)的中位數(shù)值中BC組>TD組外,其他各指數(shù)的中位數(shù)值均表現(xiàn)TA組>TD組>BC組,見圖4。

2.2.3 菌群特征和變化

對(duì)大黃魚腸道菌群同步進(jìn)行BC組、TD組和TA組3種條件的體外培養(yǎng),基于OTUs繪制韋恩圖(圖5)。對(duì)OTUs數(shù)量的統(tǒng)計(jì)、比較顯示,BC組OTUs有653個(gè),TD組有626個(gè),TA組有945個(gè);相較于BC組,TD組和TA組分別獨(dú)有192和371個(gè)OTUs;相較于TD組,TA組獨(dú)有347個(gè)OTUs。

對(duì)同一大黃魚腸道菌群在體外不同條件下培養(yǎng)后的α多樣性變化進(jìn)行分析,結(jié)果(圖6)顯示,試驗(yàn)魚1(Fish 1)腸道菌群的Observed_species指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和PD_whole _tree指數(shù)明顯不同于其他3條試驗(yàn)魚(Fish 2、Fish 3和Fish 4),其他試驗(yàn)魚的上述指數(shù)均表現(xiàn)為TA組大于BC組和TD組。

大黃魚腸道菌群經(jīng)GAM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)(BC組)后,優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteriota),三者相對(duì)豐度之和占總測(cè)序豐度的98%以上;GAM培養(yǎng)基中添加0.5%海帶酶解物(TD組)后,優(yōu)勢(shì)菌門轉(zhuǎn)換為厚壁菌門、變形菌門,兩者相對(duì)豐度之和占總測(cè)序豐度的90%以上;GAM培養(yǎng)基中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物(TA組)后,優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門(Bacteroidota),三者相對(duì)豐度之和占總測(cè)序豐度的95%以上。其中,TA組中擬桿菌門和分類未定細(xì)菌門(unidentified_Bacteria)的相對(duì)豐度增加明顯,但添加不同海藻酶解物后大黃魚腸道菌群優(yōu)勢(shì)菌門轉(zhuǎn)換也存在個(gè)體差異,見圖7。對(duì)草魚的研究顯示,草魚腸道菌群可分為2個(gè)功能組:功能組1(G1)由變形菌門組成,該功能組細(xì)菌編碼更多的毒力因子(VF)基因和抗生素抗性基因(ARG);功能組2(G2)由梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門組成,該功能組細(xì)菌富集了編碼降解阿拉伯木聚糖、果膠、黏蛋白、菊粉和纖維素的酶基因,可促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生,G2/G1比值可以作為有效反映草魚微生物群結(jié)構(gòu)和功能特征的生物標(biāo)志物[18]。據(jù)此,本試驗(yàn)對(duì)大黃魚腸道菌群的G2/G1比值進(jìn)行分析,結(jié)果顯示TA組的G2/G1比值(中位數(shù):4.44)顯著高于BC組(中位數(shù):0.99)和TD組(中位數(shù):0.92)組(P<0.05),BC組和TD組之間無顯著差異(P>0.05),見圖7。

Bray-Curtis Anosim分析:R介于-1和1之間。R>0,說明組間差異顯著;R<0,說明組內(nèi)差異大于組間差異;P值表示統(tǒng)計(jì)分析的可信度,P<0.05表示統(tǒng)計(jì)具有顯著性。BC組vs TD組,R=-0.146,P=0.741;BC組vs TA組,R=0.240,P=0.242;TD組vs TA組,R=0.208,P=0.128。

a:Observed_species指數(shù)組間差異箱形圖;b:Shannon指數(shù)組間差異箱形圖;c:Simpson指數(shù)組間差異箱形圖;d:Chao1指數(shù)組間差異箱形圖;e:ACE指數(shù)組間差異箱形圖;f:PD_whole_tree指數(shù)組間差異箱形圖。

圖5 大黃魚腸道菌群體外不同條件下培養(yǎng)后基于OTUs的韋恩圖

據(jù)所有樣本菌群的定量信息,從組間和樣本間2個(gè)層面對(duì)排名前35的菌屬進(jìn)行聚類,繪制熱圖(圖8),發(fā)現(xiàn)在屬水平上TA組物種相對(duì)豐度與BC組、TD組差異較大,TA組中普雷沃氏菌科未確定屬(unidentified_Prevotellaceae)、毛螺菌科未確定屬(unidentified_Lachnospiraceae)和魏斯氏菌屬(Weissella)的相對(duì)豐度明顯增加,乳球菌屬(Lactococcus)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、乙酰桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)和弧菌屬(Vibrio)等的相對(duì)豐度降低的較為明顯,但同一組內(nèi)不同樣本間也有較大差異。

圖6 同一大黃魚腸道菌群體外不同條件下培養(yǎng)后α多樣性變化

2.2.4 生物標(biāo)志物分析

為了確定組間具有顯著性差異的物種,從不同層級(jí)的物種豐度出發(fā),利用Metastats方法對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,篩選具有顯著性差異的物種。在門水平上,BC組與TA組間具有顯著性差異的菌群有擬桿菌門(P<0.01)、分類未定細(xì)菌門(P<0.01)、脫鐵桿菌門(Deferribacteres)(P<0.05)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)(P<0.05)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)(P<0.05);TD組與TA組間具有顯著性差異的菌群有擬桿菌門、分類未定細(xì)菌門和其他細(xì)菌(other)(P<0.05)。通過群落結(jié)構(gòu)差異統(tǒng)計(jì)分析對(duì)不同分組的大黃魚腸道菌群進(jìn)行深入研究,針對(duì)性的找出分組間相對(duì)豐度變化差異顯著的物種,明確顯著性差異物種在不同分組間的富集情況。使用LEfSe工具在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物(biomarker),結(jié)果顯示TD組與BC組間無具有顯著性差異的菌群,但TD組和BC組與TA組在LDA得分(LDA score)>4時(shí)有99個(gè)具有顯著性差異的菌群,在LDA score>6時(shí)有14個(gè)具有顯著性差異的菌群,包括梭菌目未確定屬(unidentifliedClostridia)、Muribaculaceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、顫螺旋菌科(Oscillospiraceae)、腸道拉瓦異普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、毛螺菌科未確定屬、擬桿菌屬(Bacteroides)、拉瓦異普雷沃氏菌屬(Alloprevotela)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和分類未定細(xì)菌門等。

其他表示圖中給出的這10個(gè)菌門之外的其他所有門的相對(duì)豐度之和。G1:功能組1,為變形菌門相對(duì)豐度;G2:功能組2,為梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度之和?！?”表示與BC組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3 SCFAs合成與腸道菌群的相關(guān)性

2.3.1 丁酸與腸道菌群的相關(guān)性

丁酸是大黃魚腸道菌群體外培養(yǎng)后不同分組間的主要差異代謝物,其合成量較大,且TA組與BC組和TD組存在極顯著差異(P<0.01,圖1)。使用Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估TA組與BC組及TA組與TD組中丁酸與差異微生物的相關(guān)性,結(jié)果顯示,與丁酸呈正相關(guān)的共有菌群為擬桿菌門的產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)、單形擬桿菌(Bacteroidesuniformis)、普通擬桿菌(Bacteroidesvulgatus)、腸鼠桿菌(Muribaculumintestinale)、金氏類擬桿菌(Parabacteroidesgoldsteinii)和相對(duì)豐度較低的厚壁菌門的關(guān)節(jié)假絲酵母種SFB rat Yit亞種(CandidatusArthromitussp SFB rat Yit)以及變形菌門的別氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbereziniae),見圖9。

2.3.2 戊酸與腸道菌群的相關(guān)性

戊酸也是大黃魚腸道菌群體外培養(yǎng)后不同分組間的主要差異代謝物,TA組和TD組的戊酸合成量極顯著高于BC組(P<0.01,圖1),但戊酸合成量的較低,在0.000 1～0.000 3 mmol/L。使用Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估BC組與TD組、BC組與TA組中戊酸與差異微生物的相關(guān)性,結(jié)果顯示,與戊酸呈正相關(guān)的菌群有放線菌門(Actinobacteria)的假長雙歧桿菌(Bifidobacteriumpseudolongum),擬桿菌門的產(chǎn)酸擬桿菌、賽多利擬桿菌(Bacteroidessartorii)、多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、單形擬桿菌、金氏類擬桿菌,脫鐵桿菌門的黏液螺旋菌屬69亞種(Mucispirillumsp 69),厚壁菌門克里斯滕森菌科未確定屬(unidentified Christensenellaceae)的YE57菌(bacterium YE57)、毛螺菌科610菌(Lachnospiraceae bacterium 610)、毛螺菌科未確定屬的鼠腸道宏基因組(mouse gut metagenome),梭菌目的Clostridiales bacterium enrichment culture clone 06_1235251_76,變形菌門的伯克霍爾德氏菌目YL45菌(Burkholderiales bacterium YL45),分類未定細(xì)菌門的姬鼠螺桿菌(Helicobacterapodemus)和疣微菌門的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila),見圖9(BC組vs TA組)。

BC組與TD組腸道菌群的差異較小,其中沒有與戊酸呈正相關(guān)的菌群,與戊酸呈負(fù)相關(guān)的菌群有厚壁菌門的克里斯滕森菌屬(Christensenella),變形菌門的叢毛單胞菌屬(Comamonas)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas),見圖10。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示大黃魚腸道菌群可以產(chǎn)生SCFAs,擬桿菌門和分類未定細(xì)菌門相對(duì)豐度增加可促進(jìn)丁酸的合成,其中擬桿菌門擬桿菌屬的細(xì)菌是合成丁酸的主要細(xì)菌。大黃魚腸道菌群在體外厭氧條件下培養(yǎng)可以產(chǎn)生以乙酸為主的SCFAs,乙酸、丙酸和丁酸的比例約為94∶5∶1,GAM培養(yǎng)基中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物后該比例變?yōu)?2∶4∶4,丁酸合成量增加至約0.27 mmol/L,且合成SCFAs的總量增加。2020年,Cholan等[10]發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚腸道中的菌群在體外可以合成SCFAs,丁酸合成量約為0.7 mmol/L,乙酸、丙酸和丁酸的比例約為90∶5∶5。菌群的組成及培養(yǎng)基的含量可能影響SCFAs的合成。研究顯示,哺乳動(dòng)物腸道菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主,厭氧條件下產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸的比例為60∶20∶20[5];成年斑馬魚腸道中最豐富的細(xì)菌門是擬桿菌門和梭桿菌門[10]。本研究中大黃魚腸道菌群經(jīng)體外厭氧培養(yǎng)后的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門。據(jù)報(bào)道,厭氧條件下使用腦心浸液(BHI)培養(yǎng)時(shí)斑馬魚腸道菌群合成的SCFAs總量較使用吉福(Gifu)厭氧培養(yǎng)基(HIMEDIA)培養(yǎng)時(shí)明顯增多[10]。本研究結(jié)果顯示,GAM培養(yǎng)基中添加0.5%海帶酶解物后,大黃魚腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌門轉(zhuǎn)換為厚壁菌門、變形菌門,兩者相對(duì)豐度之和占總測(cè)序豐度的90%以上,梭桿菌門的相對(duì)豐度減少;GAM培養(yǎng)基中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物后,大黃魚腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門轉(zhuǎn)換為厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門,三者相對(duì)豐度之和占總測(cè)序豐度的95%以上,且其α多樣性也增加。Li等[18]對(duì)草魚腸道菌群功能的研究顯示,由梭桿菌門、厚壁菌門和擬桿菌門組成的(G2)可促進(jìn)SCFAs的產(chǎn)生,較高的G2/G1比值表明腸道菌群較為健康。本研究中,GAM培養(yǎng)基中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物的TA組G2/G1比值顯著增加,且SCFAs合成量也增加;GAM培養(yǎng)基中添加0.5%海帶酶解物的TD組的G2/G1比值和SCFAs合成量均無顯著變化,該表征與Li等[18]的研究相符。魚類腸道菌群包括21個(gè)細(xì)菌門,變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,這3個(gè)細(xì)菌門序列占所有序列的70%以上[19],梭桿菌門易在淡水魚中檢測(cè)到[20]。大黃魚腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、螺旋體門(Spirochaetae)和擬桿菌門,同時(shí)發(fā)現(xiàn)少量放線菌門、浮霉菌門(Planctomycetacia)和藍(lán)細(xì)菌門等細(xì)菌[3,21],不同采集地、飼喂方式和生長階段樣本的優(yōu)勢(shì)菌門不同[3]。在野生魚類上的研究顯示,宿主棲息地是其腸道菌群的主要決定因素,魚種類(宿主)的差異對(duì)腸道菌群的影響不大[20],同時(shí)飼養(yǎng)模式[13]、飼養(yǎng)水域[11]、飼料組成[14-16]、投喂方式[17]和生長的不同階段[11,22]也明顯影響大黃魚腸道菌群的組成。

本研究顯示,GAM培養(yǎng)基中添加0.5%復(fù)合海藻酶解物顯著增加了大黃魚腸道菌群的丁酸合成量,該培養(yǎng)條件下大黃魚腸道菌群中擬桿菌門和分類未定細(xì)菌門相對(duì)豐度的增加較為明顯,其中,產(chǎn)酸擬桿菌、單形擬桿菌、普通擬桿菌、腸鼠桿菌、金氏類擬桿菌可能是使丁酸合成量增加的主要細(xì)菌。哺乳動(dòng)物中,單形擬桿菌[23]、產(chǎn)酸擬桿菌[24]、普通擬桿菌[25]和金氏類擬桿菌[26]是主要的腸道共生菌,可以降解多聚糖,飲食中添加可溶性纖維可提高其相對(duì)豐度,有助于產(chǎn)生乙酸、琥珀酸以及少量的異戊酸、丙酸和甲酸,并促進(jìn)丁酸的合成,具有增強(qiáng)腸道完整性以及降低炎癥等作用[27]。腸鼠桿菌可以代謝糖龍舌蘭素(agavins,AG)等高度支鏈化的果聚糖合成丁酸[28],其可能是利用復(fù)合海藻酶解物合成丁酸的主要細(xì)菌。本試驗(yàn)中制備復(fù)合海藻酶解物的復(fù)合海藻由29%的條斑紫菜、24%的石莼和47%海帶組成。海帶主要是由α-L-甘露糖醛酸(M)與β-D-古羅糖醛酸(G)2種單體為基礎(chǔ)形成的分子質(zhì)量在20～350 kDa的多聚甘露糖(PolyM)、多聚古羅糖(PolyG)、多聚甘露糖/古羅糖混合糖(PolyM/G)水溶性線性多糖褐藻酸,約占干重的45%,以及少量的海帶多糖(laminarin)和褐藻糖膠(fucoidan,也叫巖藻聚糖);紫菜中主要為紫菜聚糖等具有支鏈的硫酸化程度較高的多糖和海藻蛋白,分別約占干重的15%和30%;石莼的主要含量為支鏈化和硫酸化程度較高的水溶性膠凝多糖,約占干重的15%[29]。GAM培養(yǎng)基中添加0.5%海帶酶解物未顯著增加大黃魚腸道菌群的丁酸合成量,表明具有支鏈的硫酸化多聚糖可能是促進(jìn)擬桿菌屬細(xì)菌發(fā)育使丁酸合成量增加的主要原因。

丁酸在魚類中具有減少中性粒細(xì)胞和M1型促炎巨噬細(xì)胞向傷口的募集的抗炎作用,丙酸則具有促炎作用[10],增加丁酸、減少丙酸合成量有益于大黃魚腸道健康。大黃魚是一種肉食性魚類,為我國特有的經(jīng)濟(jì)魚種,高密度的網(wǎng)箱養(yǎng)殖是其主要生產(chǎn)方式,目前其飼料主要為小雜魚及富含蛋白質(zhì)的飼料,由于不耐高血糖其飼料中缺乏碳水化合物和纖維等合成SCFAs的底物[30],飼料中添加富含高聚合度的硫酸化多糖的復(fù)合海藻酶解物可能會(huì)促進(jìn)腸道中SCFAs的合成和腸道菌群α多樣性,增強(qiáng)腸道健康,減少高密度養(yǎng)殖條件下疾病的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果證實(shí)大黃魚腸道菌群可以合成SCFAs,擬桿菌屬細(xì)菌的相對(duì)豐度與丁酸的合成量呈正相關(guān);在體外厭氧培養(yǎng)基中添加復(fù)合海藻(石莼、紫菜和海帶組成)酶解物可以顯著提高大黃魚腸道中厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門相對(duì)豐度之和與變形菌門相對(duì)豐度的比值,并增加腸道菌群α多樣性和丁酸合成量。