焦佳音，李嘉瑜，樊淑淼，王磊，鄭蕓霏，李明婉，李瑜，李連珍，洪利亞，4*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046；4.北京大學(xué) 藥學(xué)院，北京 100191）

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科黃精屬多年生草本植物，口味甘甜，營養(yǎng)豐富，含有多糖、黃酮類、氨基酸和礦物質(zhì)等成分[1-3]，具有抗氧化、抗衰老、降血糖及改善記憶力等功效[4-6]。黃精作為藥食同源的食材，市場上已開發(fā)出黃精茶[7]、黃精果酒[8]、黃精酸奶[9]、黃精餅干[10]等多種產(chǎn)品，市場占有率較高且深受消費者喜愛，黃精深加工及綜合利用已成為研究熱點。

泡菜是我國傳統(tǒng)發(fā)酵制品，富含多種纖維素、氨基酸和微量元素，能促進(jìn)腸道蠕動、提高人體免疫力[11]。泡菜發(fā)酵是一個多菌種發(fā)酵過程，不同發(fā)酵方式菌群結(jié)構(gòu)存在差別[12]。母水發(fā)酵是四川泡菜的特色工藝，在泡菜中加入母水可增強泡菜中微生物群落的穩(wěn)定性并保持其原有風(fēng)味[13]。接種發(fā)酵同樣常用于泡菜制作，采用人工接種特定發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，具有縮短泡菜發(fā)酵周期、減少雜菌污染和降低亞硝酸鹽含量等優(yōu)勢[14]。目前已有將中藥材或者藥食同源材料制作泡菜的研究，如山藥[15]、黃芪[16]、桔梗[17]等，但關(guān)于黃精泡菜還鮮有報道，本研究采用母水發(fā)酵和接種發(fā)酵腌制黃精泡菜，通過感官評分、pH 值、總酸含量及亞硝酸鹽含量測定，并利用高通量測序技術(shù)分析兩種發(fā)酵方式中微生物多樣性的差異，以期為黃精泡菜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精：登封市土鑫種植專業(yè)合作社，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)洪利亞博士鑒定為百合科黃精屬植物黃精；白酒：瀘州老窖股份有限公司；鹽：中鹽河南鹽業(yè)物流配送有限公司；泡菜發(fā)酵菌：廣東順德尚川生物科技有限公司；四川泡菜母水：江油蜀味山珍貿(mào)易有限公司；姜、花椒、小米辣、大蒜、冰糖：市售。

氫氧化鈉：上海麥克林生化有限公司；硫酸鋅、正辛醇、硝酸鉀、酚酞指示劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇：上海泰坦科技有限公司；亞鐵氰化鉀、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、無水對氨基苯磺酸：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙酸鋅：汕頭市西隴化工廠；TGuide S96 磁珠法土壤/糞便基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；DNA 聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 精確擴(kuò)增試劑盒：美國Axygen 公司；DNA 文庫制備試劑盒：美國Illumina公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

250A 生化培養(yǎng)箱：寧波普朗特儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：鄭州生元儀器有限公司；KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；MR1029 破壁料理機：廣東新寶電器股份有限公司；721紫外可見分光光度計：上海康華生化儀器制造有限公司；PHS-3E 精密pH 計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Synergy HTX 酶標(biāo)儀：基因有限公司；OSE-MC8瞬時離心機：天根生化科技（北京）有限公司；Veriti96梯度基因擴(kuò)增儀：美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；H1650-w醫(yī)用離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；BE-1100 四維旋轉(zhuǎn)混勻儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

原料準(zhǔn)備、初加工→瀝干水分→器具滅菌→調(diào)鹽濃度→接種→裝壇→白酒密封→25 ℃恒溫發(fā)酵→成品。

1.3.2 操作要點

選取無發(fā)霉腐爛、水分充足、根莖幼嫩的一年生黃精為原料，去除表皮和雜質(zhì)，洗凈后切至1 cm×1 cm×1 cm 小塊，置于7%鹽水中充分浸泡去除麻舌感，清洗去除鹽味后瀝水備用。按黃精∶涼開水=1 ∶2 的質(zhì)量比裝入泡菜壇，再添加3.0%鹽和4.0%冰糖攪拌均勻，按黃精質(zhì)量0.1%添加菌粉或7.0%添加母水發(fā)酵液，并依次加入適量姜、大蒜、小米辣、花椒和白酒，密封后25 ℃恒溫發(fā)酵7 d。發(fā)酵至第1、3、5、7 天時進(jìn)行采樣以測定相關(guān)指標(biāo)，母水發(fā)酵樣品標(biāo)記為M1、M3、M5、M7，接種發(fā)酵樣品標(biāo)記為J1、J3、J5、J7。

1.3.3 評價與測定

1.3.3.1 感官評價

由食品專業(yè)人員20 名（男10 名，女10 名）組成感官評價小組對黃精泡菜進(jìn)行感官評價，分別從色澤、香味、風(fēng)味、質(zhì)地進(jìn)行評分，滿分100 分，感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria

1.3.3.2 理化指標(biāo)測定

總酸含量參照GB 12456—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》中酸堿指示劑滴定法進(jìn)行測定；pH 值參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品pH 值的測定》中pH 計法進(jìn)行測定；亞硝酸鹽含量參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行測定，以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所得線性回歸方程為y=0.030 3x+0.002 1（R2=0.999 2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中亞硝酸鹽含量。

1.3.3.3 總DNA 提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

總DNA 提取按照TGuide S96 磁珠法土壤/糞便DNA 提取試劑盒的說明書方法進(jìn)行測定，使用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，引物引用：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。擴(kuò)增體系（10 μL）：基因組DNA 5～50 ng，Vn F（10 μmol/L）0.3 μL，Vn R（10 μmol/L）0.3 μL，KOD FX Neo Buffer 5 μL，dNTP（2 mmol/L）2 μL，KOD FX Neo 0.2 μL，ddH2O 補充至10 μL；擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃5 min，95 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃40 s，72 ℃7 min，4 ℃保持25～30 次循環(huán)。

1.3.3.4 測序數(shù)據(jù)處理與分析

微生物多樣性是基于Illumina Novaseq 測序平臺，利用雙末端測序的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序。原始數(shù)據(jù)采用Trimmomatic v0.33 軟件進(jìn)行過濾，Cutadapt 1.9.1 軟件進(jìn)行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads。Usearch v10 軟件通過overlap對每個樣品的Clean Reads 進(jìn)行拼接，然后根據(jù)不同區(qū)域的長度范圍對拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長度過濾。隨后使用UCHIME v4.2 軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用Usearch 軟件對Reads 在97.0%的相似度水平下進(jìn)行聚類、獲得分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）；利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R 語言工具繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖；使用QIIME2 軟件，對樣品Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行評估；使用QIIME 軟件進(jìn)行Beta 多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵方式對黃精泡菜pH 值的影響

pH 值作為指標(biāo)參數(shù)有效表現(xiàn)出發(fā)酵環(huán)境和泡菜的成熟狀態(tài)[18]。發(fā)酵方式對黃精泡菜pH 值的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵方式對黃精泡菜pH 值的影響Fig.1 Effects of fermentation methods on pH value of P.sibiricum pickles

由圖1 可知，發(fā)酵時間為1～3 d 時，兩種發(fā)酵方式下黃精泡菜pH 值均呈現(xiàn)快速下降的趨勢，第3 天pH值達(dá)到3.0，處于穩(wěn)定狀態(tài)，表明兩種發(fā)酵方式黃精泡菜在第3 天開始成熟。

2.2 發(fā)酵方式對黃精泡菜總酸含量的影響

發(fā)酵方式對黃精泡菜總酸含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵方式對黃精泡菜總酸含量的影響Fig.2 Effects of fermentation methods on total acid content of P.sibiricum pickles

由圖2 可知，黃精泡菜發(fā)酵過程中接種發(fā)酵總酸含量始終低于母水發(fā)酵，兩種發(fā)酵方式黃精泡菜初期總酸含量均較低，可能是發(fā)酵初期微生物處于適應(yīng)期；發(fā)酵時間為1～3 d 時，兩種發(fā)酵方式黃精泡菜總酸含量增長較快，接種發(fā)酵第3 天總酸含量為7.3 g/kg，母水發(fā)酵總酸含量為11.9 g/kg；接種發(fā)酵3～7 d 時，總酸含量增長速度降低，第7 天總酸含量為10.8 g/kg；母水發(fā)酵3～7 d 時，總酸含量呈先上升后下降的趨勢，推測由于母水發(fā)酵在發(fā)酵后期有機酸和H+進(jìn)一步積累，乳酸代謝途徑因乳酸的積累產(chǎn)生反饋抑制作用[19]。研究表明總酸含量在6.0～8.0 g/kg 時的口感較佳[20]，母水發(fā)酵1～3 d 達(dá)到最佳酸度范圍，而接種發(fā)酵3～5 d 才到達(dá)最佳酸度范圍。

2.3 發(fā)酵方式對黃精泡菜亞硝酸鹽含量的影響

發(fā)酵方式對黃精泡菜亞硝酸鹽含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵方式對黃精泡菜亞硝酸鹽含量的影響Fig.3 Effects of fermentation methods on nitrite in P.sibiricum pickles

泡菜發(fā)酵過程中硝酸鹽在硝酸還原酶作用下還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽達(dá)到一定量會致使食用人群細(xì)胞發(fā)生癌變[21-22]，GB 2762—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》規(guī)定中要求泡菜亞硝酸鹽含量不得高于20 mg/kg。由圖3 可知，兩種發(fā)酵方式黃精泡菜亞硝酸鹽含量不超過1.7 mg/kg，遠(yuǎn)低于20 mg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)限量，接種發(fā)酵亞硝酸鹽含量最高僅為0.5 mg/kg，滿足黃精泡菜食用安全。

2.4 發(fā)酵方式對黃精泡菜感官評分的影響

發(fā)酵方式對黃精泡菜感官評分的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵方式對黃精泡菜感官評價的影響Fig.4 Effects of fermentation methods on sensory quality of P.sibiricum pickles

由圖4 可知，兩種發(fā)酵方式黃精泡菜感官評分隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。兩種發(fā)酵方式下黃精泡菜第1 天的成熟度偏低，導(dǎo)致香味和風(fēng)味較弱；母水發(fā)酵第3 天時，感官評分最高，接種發(fā)酵第5 天時，感官評分最高，此時兩種發(fā)酵黃精泡菜氣味純正，質(zhì)地脆嫩，形態(tài)完整，汁液清亮，整體口感最好；發(fā)酵第7 天兩種黃精泡菜質(zhì)地變軟、口感偏酸且脆度降低。綜上所述，兩種發(fā)酵方式黃精泡菜口感良好，適用于工業(yè)化黃精泡菜生產(chǎn)。

2.5 高通量測序結(jié)果及分析

2.5.1 微生物Alpha 多樣性

不同發(fā)酵方式和發(fā)酵時間下黃精泡菜中微生物Alpha 多樣性見表2。

表2 Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 2 Alpha diversity indexes

由表2 可知，利用高通量測序?qū)煞N發(fā)酵方式黃精泡菜進(jìn)行分析，共得到587 147 條序列。按照97.0%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行分類操作單元聚類，得到OTUs 的代表系列，選出與OTUs 代表序列相似性在97.0%以上的序列，共劃分得到162 個OTUs 分類。兩種發(fā)酵方式黃精泡菜的測序覆蓋率均接近1，表明本次測序結(jié)果能代表樣品中微生物的真實情況；ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)相近，說明微生物群落豐富度相近。從Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)來看，母水發(fā)酵組數(shù)值均大于接種發(fā)酵組，說明母水發(fā)酵組樣品微生物多樣性較高；接種發(fā)酵第3 天Shannon 指數(shù)最大，第7 天最低；母水發(fā)酵Shannon 指數(shù)第1 天最高，第3 天最低，說明兩種發(fā)酵方式微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，發(fā)生持續(xù)性變化。

2.5.2 微生物群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化分析

2.5.2.1 門水平生物群落結(jié)構(gòu)分析

不同發(fā)酵方式和發(fā)酵時間下黃精泡菜中微生物在門水平上分布見圖5。

圖5 門水平物種分布Fig.5 Microbial distribution at the phylum level

由圖5 可知，不同發(fā)酵方式和發(fā)酵時間下黃精泡菜微生物群落共包含10 個門，其中厚壁菌門（Firmicutes，80.8%～98.6%）為絕對優(yōu)勢菌門，其次優(yōu)勢菌是變形菌門（Proteobacteria，0.8%～17.1%），Liang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)泡菜中優(yōu)勢菌門也是厚壁菌門和變形菌門，與本試驗結(jié)果一致。在接種發(fā)酵過程中，厚壁菌門相對豐度整體上呈上升趨勢，是接種發(fā)酵中的優(yōu)勢門，第1 天相對豐度為86.4%，第7 天占比上升為91.1%；變形菌門相對豐度呈先升高后降低的趨勢，第3 天相對豐度最高，為17.1%，第7 天降低到7.9%，推測由于發(fā)酵初期乳酸積累量少，隨著發(fā)酵的進(jìn)行乳酸積累，pH 值降低增加抑制變形菌門等雜菌的生長。在母水發(fā)酵中，厚壁菌門始終占比98.0%左右，主導(dǎo)整個發(fā)酵時期，而變形菌門等雜菌占比為1.0～2.0%。

2.5.2.2 屬水平生物群落結(jié)構(gòu)分析

不同發(fā)酵方式和發(fā)酵時間下黃精泡菜中微生物在屬水平上分布見圖6。對黃精泡菜中微生物相對豐度較高的前10 個優(yōu)勢屬進(jìn)行分析。

圖6 屬水平物種分布Fig.6 Microbial distribution at the genus level

由圖6 可知，在接種發(fā)酵中，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）是優(yōu)勢屬，隨發(fā)酵的進(jìn)行整體上呈上升趨勢，第1 天占比84.6%，第7 天上升至89.2%；拉恩氏菌屬（Rahnella1）、腸桿菌屬（Enterobacter）、沙雷氏菌（Serratia）等的占比逐漸下降，最終占比維持在1.0%～2.0%。接種發(fā)酵植物乳桿菌屬占比較多，其他屬占比不到20.0%，這可能與接種發(fā)酵使用的菌粉有關(guān)。在母水發(fā)酵中，隨著發(fā)酵進(jìn)行植物乳桿菌屬占比減少，從第1 天占比50.1%下降至第7 天15.6%；遲緩乳桿菌屬（Lentilactobacillus）第1 天占比為26.6%，第5 天上升至54.6%，此后波動較?。蝗樗釛U菌屬（Lactobacillus）隨著發(fā)酵進(jìn)行占比上升，第7 天為15.1%，而嗜戊糖乳桿菌屬（Secundilactobacillus）占比略微降低，從第1 天10.5%下降至7.3%。母水發(fā)酵中植物乳桿菌屬、遲緩乳桿菌屬、乳酸桿菌屬、嗜戊糖乳桿菌屬等均屬于厚壁菌門中的乳桿菌屬，表明乳桿菌在泡菜發(fā)酵過程中起到主要作用[24]。相比較于接種發(fā)酵，母水發(fā)酵過程中微生物屬的種類占比變化較大，這是由于母水本身微生物組成比較復(fù)雜，隨發(fā)酵進(jìn)行變化較大。

2.5.3 微生物群落差異性分析

不同發(fā)酵方式和發(fā)酵時間下黃精泡菜中微生物群落主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果見圖7。

圖7 PCA 分析圖Fig.7 Principal component analysis plot

由圖7 可知，第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為98.6%和0.6%。兩種發(fā)酵方式黃精泡菜微生物群落距離較遠(yuǎn)，說明兩種黃精泡菜微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。接種發(fā)酵4 個樣品離得比較近，說明隨發(fā)酵的進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)變化較小，而母水發(fā)酵4 個樣品分散度較高，說明隨發(fā)酵的進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)變化較大。

3 結(jié)論

本文探究黃精泡菜發(fā)酵過程中pH 值、總酸含量及亞硝酸鹽含量的變化，并利用高通量測序技術(shù)分析發(fā)酵方式不同導(dǎo)致的微生物多樣性差異。兩種黃精泡菜第3 天pH 值穩(wěn)定在3.0，母水發(fā)酵總酸含量為11.9 g/kg，接種發(fā)酵總酸含量為7.3 g/kg，母水發(fā)酵第3 天和接種發(fā)酵第5 天成熟度最好，黃精泡菜酸脆爽口、形狀完整、汁液清亮。母水發(fā)酵亞硝酸鹽含量小于1.7 mg/kg，接種發(fā)酵亞硝酸鹽含量小于0.5 mg/kg，均遠(yuǎn)低于20 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)限量。在微生物群落結(jié)構(gòu)上，門水平上兩種發(fā)酵方式厚壁菌門構(gòu)成主要類群，其次是變形菌門；屬水平上，接種發(fā)酵優(yōu)勢屬是植物乳桿菌屬，而母水發(fā)酵是植物乳桿菌屬、遲緩乳桿菌屬、乳酸桿菌屬和嗜戊糖乳桿菌。Alpha 多樣性指數(shù)表明兩種發(fā)酵方式微生物群落豐富度相近，母水發(fā)酵微生物多樣性高于接種發(fā)酵；PCA 分析表明，兩種發(fā)酵方式黃精泡菜微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，與母水發(fā)酵相比接種發(fā)酵群落結(jié)構(gòu)變化較小。本研究豐富市場上泡菜種類的同時，為黃精藥食同源產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。