孫 星 劉 越 趙得堡 盛 晶 劉揚(yáng)帆 劉麗娜 屈中玉 萬(wàn)里新

乳腺癌因其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),且趨于年輕化的特點(diǎn)嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。臨床上常采用手術(shù)切除、內(nèi)分泌治療以及放化療等手段治療乳腺癌,內(nèi)分泌治療是雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者綜合治療的重要部分[1]。他莫西芬是一種抗雌激素受體類(lèi)藥物,因具有低毒、經(jīng)濟(jì)以及效應(yīng)作用持久等特點(diǎn)而成為雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療的一線(xiàn)藥物,但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)耐藥性是導(dǎo)致治療效果不理想的重要原因之一,因此解決他莫西芬耐藥性是治療雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌患者的關(guān)鍵所在[2]。辣椒素是從辣椒中提取的生物活性成分,研究發(fā)現(xiàn),辣椒素具有抗腫瘤活性,可降低膀胱癌、食管鱗癌以及肝癌等多種惡性腫瘤的增殖和浸潤(rùn)能力[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度在25 nt范圍內(nèi)的小分子非編碼RNA,miR-152-3p在乳腺癌組織中低表達(dá),且與乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路異常激活在乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]?；谝陨涎芯?本研究探討辣椒素是否能通過(guò)miR-152-3p調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫西芬的耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 MCF-7細(xì)胞和他莫西芬耐藥LCC9細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑和儀器 辣椒素(純度≥98%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;mimic NC、mimic、inhibitor NC和inhibitor由海上吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;PCR引物購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗人β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、T細(xì)胞因子4(T-cell factor,TCF4)以及GAPDH 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermofisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的MCF-7細(xì)胞和LCC9細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天更換一次培養(yǎng)基,細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)不同濃度辣椒素對(duì)LCC9細(xì)胞存活率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LCC9細(xì)胞,制成密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔200 μL,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,加入不同濃度辣椒素(0、50、100、200、400 μmol/L),每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK8液,重新孵育2 h,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-152-3p和Wnt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,PBS清洗2次,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,加入Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度,將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板,采用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行熒光定量PCR,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),引物序列見(jiàn)表1。2-△△CT法計(jì)算miR-152-3p和Wnt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LCC9細(xì)胞,制成密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔200 μL,待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、inhibitor NC組、inhibitor組和inhibitor+辣椒素組,除對(duì)照組外,其余組分別轉(zhuǎn)染inhibitor NC、inhibitor,inhibitor+辣椒素組細(xì)胞轉(zhuǎn)染inhibitor 12 h后,加入200 μmol/L辣椒素處理24 h。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率 PBS清洗各組細(xì)胞2次,胰蛋白酶消化,加入PBS重懸后離心,加入500 μL結(jié)合緩沖液,并分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL,避光充分震蕩混勻,反應(yīng)20 min后置于流式細(xì)胞儀上測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-152-3p和Wnt1的靶向關(guān)系 根據(jù)Targetscan軟件預(yù)測(cè)miR-152-3p與Wnt1 3'UTR區(qū)存在互補(bǔ)核苷酸序列,構(gòu)建野生型(Wt)和突變型(Mut)Wnt1 3' UTR熒光酶載體,根據(jù)脂質(zhì)體2000說(shuō)明書(shū)將Wt Wnt1和Mut Wnt1分別與miR-152-3p mimic和mimic NC共轉(zhuǎn)染入LCC9細(xì)胞,48 h后測(cè)定熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.7 蛋白印跡法檢測(cè)β-catenin和TCF4蛋白相對(duì)表達(dá)量 離心收集LCC9細(xì)胞,裂解液裂解,離心收集上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,120 V電泳2 h,0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h,室溫封閉1.5 h,β-catenin、TCF4以及GAPDH抗體(1∶1000)4 ℃冰箱過(guò)夜,二抗(1∶5000)室溫孵育2 h,ECL顯色,Image J分析灰度值,目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度辣椒素對(duì)細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率隨辣椒素濃度的升高而降低,且具有濃度依賴(lài)性(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 不同濃度辣椒素對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.2 LCC9細(xì)胞中miR-152-3p和Wnt1表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

LCC9細(xì)胞中miR-152-3p表達(dá)水平較MCF-7細(xì)胞降低,而Wnt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較MCF-7細(xì)胞升高(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 miR-152-3p和Wnt1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

miR-152-3p相對(duì)表達(dá)水平組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和inhibitor NC組比較,inhibitor組miR-152-3p相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組miR-152-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)。對(duì)照組和inhibitor NC組miR-152-3p相對(duì)表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組miR-152-3p相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 CCK8法檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞存活率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。對(duì)照組、inhibitor NC組和inhibitor組細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞存活率比較

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞凋亡率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和inhibitor NC組比較,inhibitor組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。對(duì)照組和inhibitor NC組細(xì)胞凋亡率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6,圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)結(jié)果

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:miR-152-3p mimic+Wt-Wnt1組熒光素酶相對(duì)活性降低(P<0.05)。見(jiàn)表7,圖2。

圖2 Wnt1和miR-152-3p結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)

表7 雙熒光素酶相對(duì)表達(dá)活性

2.7 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

β-catenin和TCF4蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組和inhibitor NC組比較,inhibitor組β-catenin和TCF4蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組β-catenin和TCF4蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。對(duì)照組和inhibitor NC組β-catenin和TCF4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表8、圖3。

圖3 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中各蛋白表達(dá)情況

表8 各組β-catenin和TCF4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

臨床上將乳腺癌分為四型,即Luminal A、Luminal B、HER過(guò)表達(dá)型以及三陰性乳腺癌,其中雌激素受體陽(yáng)性即Luminal型乳腺癌占到75%左右[6]。他莫西芬是一種人工合成的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于雌激素的非甾體類(lèi)抗雌激素藥,通過(guò)與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體,從而阻斷雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的目的[7],而他莫西芬耐藥成為乳腺癌治療失敗的主要原因之一。因此本研究以他莫西芬耐藥細(xì)胞LCC9為研究對(duì)象,探討辣椒素對(duì)耐藥性的影響及其具體機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn),辣椒素可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯,從而阻礙乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn),辣椒素下調(diào)MMP2和MMP9表達(dá),抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究種不同濃度辣椒素處理LCC9細(xì)胞,結(jié)果顯示:隨著辣椒素濃度的升高,細(xì)胞存活率逐漸降低。由此可見(jiàn),辣椒素可抑制他莫西芬耐藥細(xì)胞LCC9的增殖活性。研究表明,乳腺癌組織和細(xì)胞中miR-152-3p表達(dá)顯著高于正常組織和細(xì)胞,上調(diào)miR-152-3p可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物紫杉醇的敏感性,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[10]。Ge等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-152-3p通過(guò)負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。本研究通過(guò)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞和LCC9細(xì)胞中miR-152-3p的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),他莫西芬耐藥細(xì)胞株LCC9中miR-152-3p表達(dá)水平較MCF-7細(xì)胞顯著降低。為進(jìn)一步探討辣椒素抑制LCC9細(xì)胞增殖是否是通過(guò)調(diào)節(jié)miR-152-3p表達(dá)實(shí)現(xiàn)的,本研究通過(guò)將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入LCC9細(xì)胞,同時(shí)用辣椒素處理細(xì)胞,結(jié)果顯示:與inhibitor NC組比較,inhibitor組miR-152-3p表達(dá)水平降低,與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組miR-152-3p表達(dá)水平升高,說(shuō)明成功敲降LCC9細(xì)胞中miR-152-3p表達(dá),辣椒素可上調(diào)miR-152-3p表達(dá)水平。CCK8和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:與inhibitor NC組比較,inhibitor組細(xì)胞凋亡率降低,與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組細(xì)胞存活率降低,細(xì)胞凋亡率升高,說(shuō)明辣椒素通過(guò)上調(diào)miR-152-3p表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡,降低癌細(xì)胞增殖活性。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用,該信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變,導(dǎo)致該通路異常激活可能誘導(dǎo)癌癥發(fā)生。β-catenin是Wnt信號(hào)通路中關(guān)鍵的信號(hào)樞紐,一般情況下處于低水平狀態(tài),一旦Wnt信號(hào)通路被激活,β-catenin降解減少,在細(xì)胞質(zhì)中大量聚集并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF4結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,從而誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá),參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信號(hào)通路在乳腺癌中被異常激活,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制細(xì)胞凋亡[13]。Sun等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-152-3p上調(diào)可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抗癌作用。本研究雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果表明miR-152-3p可直接靶向作用于Wnt1。蛋白印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與inhibitor NC組比較,inhibitor組β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)升高,與inhibitor組比較,inhibitor+辣椒素組β-catenin和TCF4蛋白表達(dá)降低,結(jié)果說(shuō)明:辣椒素通過(guò)上調(diào)miR-152-3p可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

綜上所述,辣椒素可降低乳腺癌他莫西芬耐藥細(xì)胞LCC9的增殖活性,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,其可能是通過(guò)上調(diào)miR-152-3p表達(dá),從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用,為臨床治療乳腺癌提供理論依據(jù)。