液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性食品中去氫表雄酮?dú)埩袅?/h1>
2023-11-09 02:49:04王舒婷李嘉程用斌吳曉紅張婷凌莉
化學(xué)分析計(jì)量 2023年10期
王舒婷，李嘉，程用斌，吳曉紅，張婷，凌莉
（陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測中心，西安 710003）
去氫表雄酮(DHEA)，又名脫氫表雄酮、普拉睪酮、普拉雄酮，CAS號為w53-43-0，分子結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。DHEA 是一種神經(jīng)甾體類化合物，由人體腎上腺皮質(zhì)所分泌，是人體合成的多種性激素的前體物質(zhì)，具有雄性激素作用，可提高體內(nèi)睪酮水平[1]。DHEA 具有抗衰老、抗抑郁、增強(qiáng)免疫功能和改善性功能等作用，臨床上常用于糖尿病、肥胖癥、免疫系統(tǒng)混亂、老年癡呆癥、動(dòng)脈硬化癥以及癌癥的治療[2-5]。DHEA 還具有蛋白同化作用，能促進(jìn)脂肪分解代謝、改善肌肉品質(zhì)，同時(shí)對動(dòng)物機(jī)體的蛋白代謝和神經(jīng)系統(tǒng)也有較好的調(diào)節(jié)作用[6-9]。但作為內(nèi)源性的食源性興奮劑，DHEA 是世界反興奮劑機(jī)構(gòu)(WADA)禁止運(yùn)動(dòng)員使用的一種蛋白同化制劑，被列入“世界反興奮劑條例國際標(biāo)準(zhǔn)”禁用清單[10]。2021年，“中華人民共和國第十四屆運(yùn)動(dòng)會”將食源性興奮劑的檢測作為運(yùn)動(dòng)員保供食品質(zhì)量安全的重點(diǎn)工作，對準(zhǔn)確、快速檢測動(dòng)物源性食品中DHEA殘留量提出了新的要求。
圖1 去氫表雄酮分子結(jié)構(gòu)式
目前，國內(nèi)外對于DHEA的研究報(bào)道頗多[11-27]，檢測方法主要有化學(xué)發(fā)光免疫分析法[13-14]、熒光光度法[15]、高效液相色譜法[16-17]、氣相色譜-質(zhì)譜法[18-19]以及液相色譜-質(zhì)譜法[20-24]。以上方法檢測基質(zhì)多為血清、尿液、頭發(fā)、鼠腦組織、土壤、飼料以及藥物等[25-27]，而對動(dòng)物源性食品中DHEA 殘留量檢測的報(bào)道較少[28]，GB/T 21981—2008 中規(guī)定了豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶、牛肉、雞肉和蝦等動(dòng)物源食品中DHEA等多種激素殘留量的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定方法[28]，該法樣品處理繁瑣，檢測周期長。筆者對動(dòng)物源性食品豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉的樣品處理方法進(jìn)行研究，采用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測定動(dòng)物源性食品中DHEA殘留量，為快速、高效、準(zhǔn)確測定運(yùn)動(dòng)員專供動(dòng)物源性食品中DHEA 殘留量提供方法和技術(shù)參考。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 主要儀器與試劑
超高效液相色譜儀：UltiMate 3000型，美國賽默飛世爾科技公司。
高分辨質(zhì)譜儀：Q Exactive Focus 型，美國賽默飛世爾科技公司。
固相萃取裝置：HVF-1000型，陜西奧聯(lián)科技發(fā)展有限公司。
電子天平：BP221S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。
全自動(dòng)氮吹濃縮儀：AutoEVA-20Plus 型，?？萍瘓F(tuán)股份有限公司。
冷凍離心機(jī)：3-18KS型，德國西格瑪公司。
多管旋渦混勻儀：iswix MV 型，艾斯瑪特儀器貿(mào)易有限公司。
組織研磨機(jī)：德國艾卡公司。
超純水儀：DU 12FV型，澤拉布儀器科技(上海)有限公司。
固相萃取小柱：Oasis Prime HLB 型，3 mL/150 mg，美國沃特世公司。
尼龍微孔濾膜：孔徑為0.22 μm，天津領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。
去氫表雄酮標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，溶劑為甲醇，天津阿爾塔科技有限公司。
去氫表雄酮-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98%，美國Iso Sciences公司。
甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷：質(zhì)譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
甲酸：質(zhì)譜純，美國霍尼韋爾公司。
無水硫酸鈉、氯化鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
C18(十八烷基硅烷)：粒徑為40～60 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司。
動(dòng)物源性食品樣品：豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉，均為市售。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.2 溶液配制
DHEA-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 mg/mL，準(zhǔn)確稱取適量去氫表雄酮-D5(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解、定容，于-18 ℃以下避光冷凍保存，有效期為12個(gè)月。
同位素內(nèi)標(biāo)使用液：1 μg/mL，準(zhǔn)確移取DHEAD5標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線。
DHEA 標(biāo)準(zhǔn)中間液：1 μg/mL，準(zhǔn)確移取DHEA標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線。
1.3 樣品處理
取動(dòng)物源性食品樣品約500 g，剔除筋膜和脂肪，用組織研磨機(jī)絞碎，裝入潔凈容器中并密封，于-18 ℃以下冷凍保存。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的樣品(5.00±0.01) g 于50 mL 具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)使用液100 μL (上機(jī)濃度為100 ng/mL)，加入20 mL 乙腈，渦旋振蕩提取10 min，于4 ℃下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，吸取上清液10 mL，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的50 mL 具塞離心管中，依次加入4 g 無水硫酸鈉、1 g 氯化鈉和200 mg C18，渦旋1 min，加入15 mL 乙腈飽和正己烷溶液，渦旋1 min，于4 ℃下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，取乙腈層，過Oasis Prime HLB 柱凈化，收集凈化液，于40 ℃氮?dú)庵写抵两?，?zhǔn)確加入0.5 mL乙腈-水(體積比為1∶1)溶液，渦旋振蕩1 min，超聲溶解1 min，過0.22 μm 尼龍微孔濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。
空白基質(zhì)制備：稱取陰性組織樣品(5.00±0.01) g于50 mL具塞離心管，除不添加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余操作同樣品處理步驟。
1.4 儀器工作條件
1.4.1 色譜條件
色譜柱：Hypersil GOLD-C18毛細(xì)管柱(50 mm×2.4 mm，1.9 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；流動(dòng)相：0.1% (體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液(A)和甲醇(B)，流量為0.4 mL/min；淋洗方式：梯度洗脫，0～1 min時(shí)保持5% B，1～2 min 時(shí)5%～20% B，2～6 min 時(shí)20%～65% B，6～8 min 時(shí)65%～85% B，8～8.5 min時(shí)85%～100% B；8.5～11 min 時(shí)100% B，11～11.1 min 時(shí)100%～5% B，11.1～15 min 時(shí)5% B；進(jìn)樣體積：5.0 μL；柱溫：40 ℃；定性方法：采用保留時(shí)間和相對離子豐度比雙重定性；定量方法：內(nèi)標(biāo)法。
1.4.2 質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描(PRM)；監(jiān)測方式：平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)；電離電壓：3.5 kV；鞘氣流量：50 L/min；吹掃氣流量：10 L/min；離子源溫度：300 ℃。離子對優(yōu)化參數(shù)見表1。
表1 DHEA和DHEA-D5的質(zhì)譜、色譜參數(shù)
2 結(jié)果與討論
2.1 液相色譜條件優(yōu)化
2.1.1 色譜柱
分別比較了Sllim-pack GIST-HP C18柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm，日本島津公司)、Accucore RPMS 柱(100 mm ×2.1 mm，2.6 μm，美國賽默飛世爾科技公司)、Hypersil GOLD-C18柱(50 mm×2.4 mm，1.9 μm，美國賽默飛世爾科技公司)、XBridge C18柱(100 mm ×2.1 mm，3.5 μm，美國沃特世公司) 4種色譜柱對目標(biāo)物的分離效果。由于樣品基質(zhì)中存在一種質(zhì)荷比與目標(biāo)物接近的強(qiáng)干擾物質(zhì)，因此選擇PRM模式掃描并動(dòng)態(tài)排除，將干擾物鎖定不觸發(fā)二級碎裂，以此屏蔽干擾。結(jié)果表明：四種色譜柱對目標(biāo)物均響應(yīng)良好。綜合考慮，選用Hypersil GOLDC18色譜柱為分離柱，圖2為DHEA和DHEA-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。
圖2 DHEA和DHEA-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
2.1.2 流動(dòng)相
以Hypersil GOLD-C18柱為分析柱，考察不同流動(dòng)相對目標(biāo)物和干擾物質(zhì)的分離效果。以純水為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，分別對比了在A相中加入酸或緩沖鹽的效果。結(jié)果表明，A相為0.1%甲酸溶液時(shí)，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、分離度、色譜峰形、靈敏度等均優(yōu)于純水和添加揮發(fā)性緩沖鹽乙酸銨，因此，選擇A 相為0.1%甲酸溶液，B 相為甲醇作為流動(dòng)相。
2.1.3 柱溫
柱溫對梯度洗脫和單組分目標(biāo)物的分析影響不大，參考文獻(xiàn)[22]和文獻(xiàn)[28]選擇柱溫為40 ℃，DHEA的色譜保留時(shí)間、峰形、靈敏度等均較理想。
2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化
所用高分辨LC-MS/MS 儀將四極桿的母離子選擇性與高分辨率的精確質(zhì)量數(shù)(HR/AM)OrbitrapTM 檢測技術(shù)相結(jié)合，可得到小數(shù)點(diǎn)后4 位的精確質(zhì)量數(shù)，因此，對化合物的定性和定量更加準(zhǔn)確可靠。
由于同位素內(nèi)標(biāo)自然豐度較低，樣品中不會存在，且內(nèi)標(biāo)物與待測物有相同的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，兩者色譜出峰時(shí)間相近，但由于相對分子質(zhì)量不同，能與樣品中待測組分完全分離，可有效消除基質(zhì)干擾，降低離子化效應(yīng)的影響，因此采用DHEA-D5同位素內(nèi)標(biāo)。定量加入同位素內(nèi)標(biāo)極大程度地降低了目標(biāo)物在提取、凈化、進(jìn)樣時(shí)的隨機(jī)誤差、偶然誤差所導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏離，有效提高了準(zhǔn)確度和精密度。
DHEA 既可以用電噴霧離子源(ESI)電離，也可以用大氣壓化學(xué)電離源(APCI)分析，試驗(yàn)采用ESI正離子模式作為其離子化方式，取1.0 μg/mL 的DHEA和DHEA-D5混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用微量蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣，進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，確定準(zhǔn)分子離子。結(jié)果顯示，DHEA和DHEA-D5在正離子模式下可獲得準(zhǔn)分子離子峰。將母離子作為準(zhǔn)分子離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇豐度最高的兩個(gè)特征碎片離子作為定性離子和定量離子，并優(yōu)化相應(yīng)離子對的碰撞能量和透鏡電壓，優(yōu)化結(jié)果見表1。選用[M+H]+作為母離子，m/z289.216 是DHEA 的加氫峰，m/z271.205 和m/z253.195 是[M+H]+的系列脫水峰，選擇豐度較高的m/z271.205作為DHEA定量子離子，m/z253.195作為定性子離子。對于DHEA-D5，[M+H]+為母離子，m/z294.247 是DHEA-D5的加氫峰，m/z276.237和m/z258.227是[M+H]+的系列脫水峰，選擇豐度較高的m/z276.237 作為定量離子，m/z258.227 作為定性離子。圖3 為DHEA 和DHEA-D5的[M+H]+二級質(zhì)譜圖。
圖3 DHEA和DHEA-D5二級碎片質(zhì)譜圖
動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜、干擾大，我國對動(dòng)物源性食品中DHEA 控制限量低(不大于5 μg/kg)，且在分析過程中存在一種質(zhì)荷比與DHEA 很接近的強(qiáng)干擾物質(zhì)，查閱文獻(xiàn)得知此干擾物質(zhì)可能是聚丙二醇(PPG)[29]，其質(zhì)荷比為289.141182，PPG 可用來制備增塑劑，樣品處理過程用的離心管、移液器槍頭、注射器、滴管、微孔濾膜等耗材均為塑料制品，在有機(jī)溶劑作用下，PPG同DHEA一起被提取出來，因此造成干擾。選擇PRM模式掃描、動(dòng)態(tài)排除將干擾物鎖定不觸發(fā)二級碎裂，從而屏蔽掉此干擾物質(zhì)，避免影響測量準(zhǔn)確度及出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
2.3 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化
2.3.1 提取溶劑選擇
分別比較了二氯甲烷和乙腈的提取效果。當(dāng)添加水平為4.0 μg/kg 時(shí)，乙腈提取DHEA 回收率為87.7%～104.6%，二氯甲烷提取DHEA 回收率為62.2%～76.5%；當(dāng)添加水平為8.0 μg/kg 時(shí)，乙腈提取DHEA 回收率為95.8%～105.3%，二氯甲烷提取DHEA回收率為68.2%～82.4%。結(jié)果表明，采用乙腈提取效果顯著優(yōu)于二氯甲烷，因此采用乙腈作為提取溶劑。
2.3.2 凈化方式
與GB/T 21981—2008相比，本實(shí)驗(yàn)樣品凈化方法在時(shí)間、耗材使用上均顯示出相對優(yōu)勢。GB/T 21981—2008 方法的樣品凈化使用ENVI-Carb 固相萃取柱和氨基柱，需要提前對柱子進(jìn)行活化、洗脫；本實(shí)驗(yàn)樣品處理方法采用Oasis Prime HLB柱，該柱無需活化、淋洗、洗脫，可直接上樣收集過柱液，樣品處理速度提升了約30%，大幅節(jié)省了樣品處理時(shí)間，滿足快速、批量檢測體育賽事中運(yùn)動(dòng)員專供動(dòng)物源性食品中DHEA殘留量的要求。
2.4 線性方程與檢出限
在空白基質(zhì)中添加適量DHEA 標(biāo)準(zhǔn)中間液和同位素內(nèi)標(biāo)使用液，配制成DHEA的質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、250 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中同位素內(nèi)標(biāo)DHEA-D5的質(zhì)量濃度均為100 ng/mL。按照1.4 儀器工作條件，將上述系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測定3 次，以目標(biāo)組分色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得線性方程為y=0.004 09x-0.004 94，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，質(zhì)量濃度線性范圍為2～250 ng/mL。
將適量DHEA 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白基質(zhì)中，經(jīng)微孔濾膜過濾后上機(jī)測定，依據(jù)特征離子色譜峰的信噪比等于3對應(yīng)的樣品中DHEA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為方法檢出限，信噪比等于10對應(yīng)的樣品中DHEA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為方法定量限，得DHEA的檢出限和定量限分別為2.0、4.0 μg/kg。
2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)
根據(jù)《十四運(yùn)會和殘?zhí)貖W會食源性興奮劑檢測工作方案》中食源性興奮劑控制限量要求，DHEA的限量為5.0 μg/kg，按照定量限、2 倍定量限和2 倍控制限量濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測定5次，考察DHEA的回收率和測量精密度，測定結(jié)果見表2。
表2 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果
由表2 可知，不同基質(zhì)中的DHEA 在4.0～10.0 μg/kg添加水平時(shí)的平均回收率為85.4%～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～6.8%。表明該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。圖4為牛肉空白樣品基質(zhì)及加標(biāo)樣品的色譜圖。
3 結(jié)語
利用液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性食品中DHEA 殘留量，采用乙腈提取、Oasis Prime HLB柱凈化樣品，優(yōu)化了液相色譜和質(zhì)譜條件，采用PRM掃描模式可以將基質(zhì)中的干擾物質(zhì)去除，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，方法回收率高、精密度良好。該方法樣品處理簡單，分析靈敏度高，定性精準(zhǔn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中興奮劑DHEA殘留量的檢測。
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王舒婷，李嘉，程用斌，吳曉紅，張婷，凌莉
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圖1 去氫表雄酮分子結(jié)構(gòu)式
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超純水儀：DU 12FV型，澤拉布儀器科技(上海)有限公司。
固相萃取小柱：Oasis Prime HLB 型，3 mL/150 mg，美國沃特世公司。
尼龍微孔濾膜：孔徑為0.22 μm，天津領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。
去氫表雄酮標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，溶劑為甲醇，天津阿爾塔科技有限公司。
去氫表雄酮-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98%，美國Iso Sciences公司。
甲醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷：質(zhì)譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。
甲酸：質(zhì)譜純，美國霍尼韋爾公司。
無水硫酸鈉、氯化鈉：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
C18(十八烷基硅烷)：粒徑為40～60 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司。
動(dòng)物源性食品樣品：豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和鴨肉，均為市售。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.2 溶液配制
DHEA-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 mg/mL，準(zhǔn)確稱取適量去氫表雄酮-D5(精確至0.01 mg)，用甲醇溶解、定容，于-18 ℃以下避光冷凍保存，有效期為12個(gè)月。
同位素內(nèi)標(biāo)使用液：1 μg/mL，準(zhǔn)確移取DHEAD5標(biāo)準(zhǔn)儲備液10 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線。
DHEA 標(biāo)準(zhǔn)中間液：1 μg/mL，準(zhǔn)確移取DHEA標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線。
1.3 樣品處理
取動(dòng)物源性食品樣品約500 g，剔除筋膜和脂肪，用組織研磨機(jī)絞碎，裝入潔凈容器中并密封，于-18 ℃以下冷凍保存。準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的樣品(5.00±0.01) g 于50 mL 具塞離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)使用液100 μL (上機(jī)濃度為100 ng/mL)，加入20 mL 乙腈，渦旋振蕩提取10 min，于4 ℃下以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，吸取上清液10 mL，轉(zhuǎn)移至另一潔凈的50 mL 具塞離心管中，依次加入4 g 無水硫酸鈉、1 g 氯化鈉和200 mg C18，渦旋1 min，加入15 mL 乙腈飽和正己烷溶液，渦旋1 min，于4 ℃下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，取乙腈層，過Oasis Prime HLB 柱凈化，收集凈化液，于40 ℃氮?dú)庵写抵两?，?zhǔn)確加入0.5 mL乙腈-水(體積比為1∶1)溶液，渦旋振蕩1 min，超聲溶解1 min，過0.22 μm 尼龍微孔濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。
空白基質(zhì)制備：稱取陰性組織樣品(5.00±0.01) g于50 mL具塞離心管，除不添加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余操作同樣品處理步驟。
1.4 儀器工作條件
1.4.1 色譜條件
色譜柱：Hypersil GOLD-C18毛細(xì)管柱(50 mm×2.4 mm，1.9 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；流動(dòng)相：0.1% (體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液(A)和甲醇(B)，流量為0.4 mL/min；淋洗方式：梯度洗脫，0～1 min時(shí)保持5% B，1～2 min 時(shí)5%～20% B，2～6 min 時(shí)20%～65% B，6～8 min 時(shí)65%～85% B，8～8.5 min時(shí)85%～100% B；8.5～11 min 時(shí)100% B，11～11.1 min 時(shí)100%～5% B，11.1～15 min 時(shí)5% B；進(jìn)樣體積：5.0 μL；柱溫：40 ℃；定性方法：采用保留時(shí)間和相對離子豐度比雙重定性；定量方法：內(nèi)標(biāo)法。
1.4.2 質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描(PRM)；監(jiān)測方式：平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)；電離電壓：3.5 kV；鞘氣流量：50 L/min；吹掃氣流量：10 L/min；離子源溫度：300 ℃。離子對優(yōu)化參數(shù)見表1。
表1 DHEA和DHEA-D5的質(zhì)譜、色譜參數(shù)
2 結(jié)果與討論
2.1 液相色譜條件優(yōu)化
2.1.1 色譜柱
分別比較了Sllim-pack GIST-HP C18柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm，日本島津公司)、Accucore RPMS 柱(100 mm ×2.1 mm，2.6 μm，美國賽默飛世爾科技公司)、Hypersil GOLD-C18柱(50 mm×2.4 mm，1.9 μm，美國賽默飛世爾科技公司)、XBridge C18柱(100 mm ×2.1 mm，3.5 μm，美國沃特世公司) 4種色譜柱對目標(biāo)物的分離效果。由于樣品基質(zhì)中存在一種質(zhì)荷比與目標(biāo)物接近的強(qiáng)干擾物質(zhì)，因此選擇PRM模式掃描并動(dòng)態(tài)排除，將干擾物鎖定不觸發(fā)二級碎裂，以此屏蔽干擾。結(jié)果表明：四種色譜柱對目標(biāo)物均響應(yīng)良好。綜合考慮，選用Hypersil GOLDC18色譜柱為分離柱，圖2為DHEA和DHEA-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。
圖2 DHEA和DHEA-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
2.1.2 流動(dòng)相
以Hypersil GOLD-C18柱為分析柱，考察不同流動(dòng)相對目標(biāo)物和干擾物質(zhì)的分離效果。以純水為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，分別對比了在A相中加入酸或緩沖鹽的效果。結(jié)果表明，A相為0.1%甲酸溶液時(shí)，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、分離度、色譜峰形、靈敏度等均優(yōu)于純水和添加揮發(fā)性緩沖鹽乙酸銨，因此，選擇A 相為0.1%甲酸溶液，B 相為甲醇作為流動(dòng)相。
2.1.3 柱溫
柱溫對梯度洗脫和單組分目標(biāo)物的分析影響不大，參考文獻(xiàn)[22]和文獻(xiàn)[28]選擇柱溫為40 ℃，DHEA的色譜保留時(shí)間、峰形、靈敏度等均較理想。
2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化
所用高分辨LC-MS/MS 儀將四極桿的母離子選擇性與高分辨率的精確質(zhì)量數(shù)(HR/AM)OrbitrapTM 檢測技術(shù)相結(jié)合，可得到小數(shù)點(diǎn)后4 位的精確質(zhì)量數(shù)，因此，對化合物的定性和定量更加準(zhǔn)確可靠。
由于同位素內(nèi)標(biāo)自然豐度較低，樣品中不會存在，且內(nèi)標(biāo)物與待測物有相同的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，兩者色譜出峰時(shí)間相近，但由于相對分子質(zhì)量不同，能與樣品中待測組分完全分離，可有效消除基質(zhì)干擾，降低離子化效應(yīng)的影響，因此采用DHEA-D5同位素內(nèi)標(biāo)。定量加入同位素內(nèi)標(biāo)極大程度地降低了目標(biāo)物在提取、凈化、進(jìn)樣時(shí)的隨機(jī)誤差、偶然誤差所導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏離，有效提高了準(zhǔn)確度和精密度。
DHEA 既可以用電噴霧離子源(ESI)電離，也可以用大氣壓化學(xué)電離源(APCI)分析，試驗(yàn)采用ESI正離子模式作為其離子化方式，取1.0 μg/mL 的DHEA和DHEA-D5混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用微量蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣，進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，確定準(zhǔn)分子離子。結(jié)果顯示，DHEA和DHEA-D5在正離子模式下可獲得準(zhǔn)分子離子峰。將母離子作為準(zhǔn)分子離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇豐度最高的兩個(gè)特征碎片離子作為定性離子和定量離子，并優(yōu)化相應(yīng)離子對的碰撞能量和透鏡電壓，優(yōu)化結(jié)果見表1。選用[M+H]+作為母離子，m/z289.216 是DHEA 的加氫峰，m/z271.205 和m/z253.195 是[M+H]+的系列脫水峰，選擇豐度較高的m/z271.205作為DHEA定量子離子，m/z253.195作為定性子離子。對于DHEA-D5，[M+H]+為母離子，m/z294.247 是DHEA-D5的加氫峰，m/z276.237和m/z258.227是[M+H]+的系列脫水峰，選擇豐度較高的m/z276.237 作為定量離子，m/z258.227 作為定性離子。圖3 為DHEA 和DHEA-D5的[M+H]+二級質(zhì)譜圖。
圖3 DHEA和DHEA-D5二級碎片質(zhì)譜圖
動(dòng)物源性食品基質(zhì)復(fù)雜、干擾大，我國對動(dòng)物源性食品中DHEA 控制限量低(不大于5 μg/kg)，且在分析過程中存在一種質(zhì)荷比與DHEA 很接近的強(qiáng)干擾物質(zhì)，查閱文獻(xiàn)得知此干擾物質(zhì)可能是聚丙二醇(PPG)[29]，其質(zhì)荷比為289.141182，PPG 可用來制備增塑劑，樣品處理過程用的離心管、移液器槍頭、注射器、滴管、微孔濾膜等耗材均為塑料制品，在有機(jī)溶劑作用下，PPG同DHEA一起被提取出來，因此造成干擾。選擇PRM模式掃描、動(dòng)態(tài)排除將干擾物鎖定不觸發(fā)二級碎裂，從而屏蔽掉此干擾物質(zhì)，避免影響測量準(zhǔn)確度及出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
2.3 樣品處理?xiàng)l件優(yōu)化
2.3.1 提取溶劑選擇
分別比較了二氯甲烷和乙腈的提取效果。當(dāng)添加水平為4.0 μg/kg 時(shí)，乙腈提取DHEA 回收率為87.7%～104.6%，二氯甲烷提取DHEA 回收率為62.2%～76.5%；當(dāng)添加水平為8.0 μg/kg 時(shí)，乙腈提取DHEA 回收率為95.8%～105.3%，二氯甲烷提取DHEA回收率為68.2%～82.4%。結(jié)果表明，采用乙腈提取效果顯著優(yōu)于二氯甲烷，因此采用乙腈作為提取溶劑。
2.3.2 凈化方式
與GB/T 21981—2008相比，本實(shí)驗(yàn)樣品凈化方法在時(shí)間、耗材使用上均顯示出相對優(yōu)勢。GB/T 21981—2008 方法的樣品凈化使用ENVI-Carb 固相萃取柱和氨基柱，需要提前對柱子進(jìn)行活化、洗脫；本實(shí)驗(yàn)樣品處理方法采用Oasis Prime HLB柱，該柱無需活化、淋洗、洗脫，可直接上樣收集過柱液，樣品處理速度提升了約30%，大幅節(jié)省了樣品處理時(shí)間，滿足快速、批量檢測體育賽事中運(yùn)動(dòng)員專供動(dòng)物源性食品中DHEA殘留量的要求。
2.4 線性方程與檢出限
在空白基質(zhì)中添加適量DHEA 標(biāo)準(zhǔn)中間液和同位素內(nèi)標(biāo)使用液，配制成DHEA的質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、250 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中同位素內(nèi)標(biāo)DHEA-D5的質(zhì)量濃度均為100 ng/mL。按照1.4 儀器工作條件，將上述系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液重復(fù)測定3 次，以目標(biāo)組分色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得線性方程為y=0.004 09x-0.004 94，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，質(zhì)量濃度線性范圍為2～250 ng/mL。
將適量DHEA 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液加入空白基質(zhì)中，經(jīng)微孔濾膜過濾后上機(jī)測定，依據(jù)特征離子色譜峰的信噪比等于3對應(yīng)的樣品中DHEA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為方法檢出限，信噪比等于10對應(yīng)的樣品中DHEA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為方法定量限，得DHEA的檢出限和定量限分別為2.0、4.0 μg/kg。
2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)
根據(jù)《十四運(yùn)會和殘?zhí)貖W會食源性興奮劑檢測工作方案》中食源性興奮劑控制限量要求，DHEA的限量為5.0 μg/kg，按照定量限、2 倍定量限和2 倍控制限量濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測定5次，考察DHEA的回收率和測量精密度，測定結(jié)果見表2。
表2 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果
由表2 可知，不同基質(zhì)中的DHEA 在4.0～10.0 μg/kg添加水平時(shí)的平均回收率為85.4%～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～6.8%。表明該方法精密度、準(zhǔn)確度良好。圖4為牛肉空白樣品基質(zhì)及加標(biāo)樣品的色譜圖。
3 結(jié)語
利用液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定動(dòng)物源性食品中DHEA 殘留量，采用乙腈提取、Oasis Prime HLB柱凈化樣品，優(yōu)化了液相色譜和質(zhì)譜條件，采用PRM掃描模式可以將基質(zhì)中的干擾物質(zhì)去除，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，方法回收率高、精密度良好。該方法樣品處理簡單，分析靈敏度高，定性精準(zhǔn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物源性食品中興奮劑DHEA殘留量的檢測。
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