張紅梅，王曉丹，崔玉玲

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250014）

雙唑泰主要成分有抗厭氧菌和抗滴蟲的高效殺菌劑甲硝唑、廣譜抗真菌藥克霉唑、廣譜外用殺菌消毒藥乙酸氯己定，主要用于治療細(xì)菌性、霉菌性、滴蟲性及混合感染性陰道炎等，藥物各組分既保持各單味藥抑殺細(xì)菌、真菌、滴蟲的作用，又有協(xié)同治療作用，對(duì)婦科生殖道感染有良好的治療效果，偶見皮疹、陰道燒灼感、瘙癢或其它黏膜刺激癥狀等不良反應(yīng)[1-2]。其凝膠劑屬生物黏附制劑，為水溶性凝膠，在陰道內(nèi)滯留性好，藥物作用時(shí)間長(zhǎng)，能充分促進(jìn)藥物吸收，提高生物利用度，且給藥方便，無(wú)刺激，無(wú)異物感[3-5]。目前《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版二部中收錄的雙唑泰劑型只有雙唑泰栓劑[6]，處方中無(wú)抑菌劑，而雙唑泰凝膠劑是通過國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)并批準(zhǔn)的雙唑泰的一種新劑型，其說(shuō)明書明確表明輔料中含有抑菌劑羥苯乙酯。

羥苯酯類是一種常用的廣譜型抑菌劑，抑菌劑也叫作防腐劑，是指抑制微生物生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)，主要作用在于抑制微生物的繁殖增長(zhǎng)，防止因微生物污染而影響藥品質(zhì)量。羥苯乙酯的化學(xué)名為4-對(duì)羥基苯甲酸乙酯，俗稱尼泊金乙酯，具有抑菌效果好、毒性低、作用迅速、無(wú)臭無(wú)味等優(yōu)點(diǎn)[7-8]，不僅廣泛用于食品及化妝品的抑菌[9-14]，在藥物液體制劑及半固體制劑中也得到廣泛應(yīng)用[15-17]。凝膠劑中常含大量的水，在使用過程中易受微生物污染，導(dǎo)致安全性問題，故需加入一定量的抑菌劑，以保證其在儲(chǔ)存和使用過程中的安全性。

抑菌劑本身是一種化學(xué)物質(zhì)，不同抑菌劑的抑菌機(jī)理不同，但普遍具有一定的毒性，使用過程中對(duì)人體都有一定的毒副作用。世界衛(wèi)生組織(WTO)規(guī)定判斷食品添加劑安全性的常用指標(biāo)為日允許攝入量(ADI)，即每天攝入均不會(huì)造成急性與慢性中毒的量和最大使用量，即GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中所規(guī)定的添加劑最大使用量[18]。歐洲藥品管理局(EMA)和人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)建議在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)建立抑菌劑的定性和限量檢查[8]，《中國(guó)藥典》2020 年版要求成品制劑中的抑菌劑有效濃度應(yīng)低于對(duì)人體有害的濃度；EMA 建議以文獻(xiàn)和/或?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)說(shuō)明抑菌劑及用量的安全性，除非抑菌劑是常見的并且通常以相同濃度和相同給藥途徑使用[8]。所以為確保藥物制劑使用時(shí)的安全性，必須合理控制抑菌劑的種類及用量，保證藥品制劑中使用的抑菌劑都應(yīng)該為其最低有效量[19]。

作為一種復(fù)方抗菌藥物，雙唑泰凝膠需要控制輔料中抑菌劑羥苯乙酯的用量，以保證用藥的安全性和有效性。目前尚未見對(duì)雙唑泰凝膠中抑菌劑羥苯乙酯進(jìn)行控制的相關(guān)報(bào)道。筆者在參考文獻(xiàn)[20]～[23]的基礎(chǔ)上建立了高相液相色譜法測(cè)定雙唑泰凝膠中抑菌劑羥苯乙酯的含量分析方法，并進(jìn)行相關(guān)方法學(xué)驗(yàn)證，為雙唑泰凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)與提高提供一定參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC-20AT 型，配二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司。

電子天平：MS105DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器：KQ-600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。

微量高速離心機(jī)：CF16RN型，日本日立工機(jī)有限公司。

超純水機(jī)：Milli-Q2882 型，美國(guó)密理博公司。

甲醇、乙腈、庚烷磺酸鈉：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

三乙胺：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

羥苯乙酯對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100.0%，批號(hào)為100847-202105，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

雙唑泰凝膠樣品：規(guī)格為5 g，批號(hào)為22601031，22601201，22601273，山東明仁福瑞達(dá)制藥股份有限公司。

其它試劑均為分析純。

1.2 溶液配制

稀釋溶劑：甲醇-水-三乙胺，體積比為70∶30∶0.3，含庚烷磺酸鈉10 mmol/L，用磷酸調(diào)pH值至4.0。

羥苯乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液：512.8 μg/mL，精密稱取羥苯乙酯對(duì)照品0.025 64 g，置于50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋定容至標(biāo)線，搖勻。

羥苯乙酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取羥苯乙酯對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0 mL，置于50 mL容量瓶中，用上述稀釋溶劑稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，得到質(zhì)量濃度為51.28 μg/mL羥苯乙酯標(biāo)注中間溶液。分別精密吸取羥苯乙酯標(biāo)注中間溶液1.0、5.0 mL，置于2 只100 mL 容量瓶中；再另分別精密吸取1.0、2.0 mL，置于2 只10 mL 容量瓶中。以上4 份溶液均用上述稀釋溶劑稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成羥苯乙酯的質(zhì)量濃度分別為0.512 8、2.564、5.128、10.256、51.28 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用0.45 μm 的濾膜過濾，取續(xù)濾液測(cè)定。

雙唑泰凝膠樣品溶液：精密稱取雙唑泰凝膠樣品約0.5 g，置于100 mL 容量瓶中，加入上述稀釋溶劑約70 mL，振搖，使分散均勻，再恒溫超聲30 min，然后以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液，用0.45 μm 的濾膜過濾，取續(xù)濾液測(cè)定。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C8柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：甲醇-水-三乙胺(體積比為70∶30∶0.3)，含庚烷磺酸鈉10 mmol/L，用磷酸調(diào)pH 至4.0，流量為1.0 mL/min；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：256 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

參考《中國(guó)藥典》2020 版四部羥苯乙酯含量測(cè)定的色譜條件[24]及文獻(xiàn)[20-23]，色譜柱采用C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。分別選擇流動(dòng)相為甲醇-1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液、甲醇-1%三乙胺、乙腈-1%乙酸溶液、乙腈-1%三乙胺，通過調(diào)節(jié)有機(jī)相與無(wú)機(jī)相的比例，有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)在30%～80%內(nèi)改變，流動(dòng)相的pH 在2.5～4.0 內(nèi)改變，分離效果均不理想。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相比例過高則羥苯乙酯色譜峰與乙酸氯己定色譜峰不能分離；有機(jī)相比例過低則克霉唑色譜峰保留時(shí)間過長(zhǎng)，色譜峰展寬嚴(yán)重。參考《中國(guó)藥典》2020 版二部雙唑泰栓測(cè)定的色譜條件：色譜柱采用Agilent Zorbax SB C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水-三乙胺(體積比為70∶30∶0.3)(含庚烷磺酸鈉10 mmol/L，用磷酸調(diào)pH值至4.0)；羥苯乙酯色譜峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，拖尾因子小于1.2，且樣品中所有產(chǎn)生色譜響應(yīng)的成分均在10 min內(nèi)出峰，故直接采用雙唑泰栓測(cè)定的色譜條件。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

通過高效液相色譜在線紫外掃描，紫外光譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，羥苯乙酯在201、256 nm處有較強(qiáng)吸收，201 nm處的吸收易受溶劑影響，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm。

圖1 羥苯乙酯紫外光譜圖

2.1.3 提取溶劑

參考《中國(guó)藥典》二部雙唑泰栓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用甲醇-水(體積比為70∶30，下同)溶液提取雙唑泰凝膠樣品，超聲后溶液呈白色乳濁液，過濾后進(jìn)行液相色譜分析，羥苯乙酯的提取回收率為99.1%，而以流動(dòng)相甲醇-水-三乙胺(體積比為70∶30∶0.3)溶液為提取溶劑時(shí)的提取回收率為100.9%，二者無(wú)明顯差異，表明以甲醇-水溶液為提取溶劑，雙唑泰凝膠中羥苯乙酯基本提取完全，但色譜圖中未出現(xiàn)乙酸氯己定的色譜峰。改變甲醇比例，分別采用100%甲醇、80%甲醇溶液、60%甲醇溶液、40%甲醇溶液、20%甲醇溶液進(jìn)行超聲提取，經(jīng)液相色譜分析，結(jié)果均與70%甲醇溶液的提取情況一致，且經(jīng)20%、40%與100%甲醇提取的樣品溶液含有更多的雜質(zhì)。而采用流動(dòng)相作提取溶劑，超聲后溶液幾乎澄清，液相色譜圖出現(xiàn)4 個(gè)完全分離的色譜峰，故選擇色譜流動(dòng)相作為提取溶劑。

2.1.4 超聲時(shí)間

取雙唑泰凝膠樣品5份，按1.2方法制備樣品溶液，于室溫下超聲處理，超聲頻率為40 kHz，分別選擇超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min，然后按1.3色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，超聲30 min 后，羥苯乙酯含量測(cè)定值比較穩(wěn)定，故選擇超聲時(shí)間為30 min。

2.1.5 離心轉(zhuǎn)速與離心時(shí)間

取雙唑泰凝膠樣品適量，按1.2方法制備樣品溶液，于室溫下超聲處理，超聲頻率為40 kHz，超聲時(shí)間為30 min，分別設(shè)置離心轉(zhuǎn)速為3 000、5 000、10 000 r/min，離心時(shí)間為10、20、30、40 min，按1.3色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，樣品溶液經(jīng)不同轉(zhuǎn)速、不同離心時(shí)間處理后，羥苯乙酯含量測(cè)定值無(wú)明顯差異。當(dāng)轉(zhuǎn)速為10 000 r/min、離心時(shí)間為10 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min、離心時(shí)間為20 min，轉(zhuǎn)速為3 000 r/min、離心時(shí)間為30 min 時(shí)，樣品上清液均較易過濾，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件自行選擇，該試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)速為10 000 r/min、離心時(shí)間為10 min。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在1.3 色譜條件下，分別測(cè)定空白溶液、羥苯乙酯對(duì)照品溶液、雙唑泰凝膠樣品溶液，色譜圖如圖2所示。理論板數(shù)按羥苯乙酯峰計(jì)算不低于5 000，羥苯乙酯色譜峰與相鄰峰分離度均大于1.5，拖尾因子小于1.2，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果均符合相關(guān)要求。

圖2 高效液相色譜圖

2.3 線性方程與檢出限

取羥苯乙酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以溶液質(zhì)量濃度(x，mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用線性回歸法計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

對(duì)最低質(zhì)量濃度的羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋并檢測(cè)，以3倍的信噪比作為方法檢出限。

羥苯乙酯的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限列于表1。由表1 可知，羥苯乙酯的質(zhì)量濃度在0.512 8～51.28 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法檢出限為0.08 μg/mL。

表1 羥苯乙酯的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 精密度試驗(yàn)

按1.2 方法制備6 份雙唑泰凝膠樣品溶液，按1.3色譜條件測(cè)定，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算羥苯乙酯的含量，再按照樣品取樣量和稀釋倍數(shù)反推計(jì)算，得出樣品中羥苯乙酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果列于表2。由表2可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%，表明該方法具有良好的精密度。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制雙唑泰凝膠樣品溶液，在配制完成后第0、2、4、6、8、12、24 h分別進(jìn)樣，按1.3色譜條件測(cè)定，計(jì)算羥苯乙酯含量。結(jié)果顯示，放置不同時(shí)間后樣品中羥苯乙酯含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%，表明雙唑泰凝膠樣品溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取雙唑泰凝膠樣品9 份，各約0.25 g，分別置于100 mL容量瓶中，按照羥苯乙酯標(biāo)示含量的80%、100%、120%三個(gè)濃度水平，分別向9份樣品中加入質(zhì)量濃度為51.28 μg/mL的羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0、5.0、7.0 mL，每個(gè)濃度水平樣品按1.2 方法平行制備3 份，分別進(jìn)樣測(cè)定，取色譜峰面積平均值，計(jì)算羥苯乙酯含量及加標(biāo)回收率，結(jié)果列于表3。由表3 可知，不同濃度水平的樣品加標(biāo)回收率為99.80%～102.20%，平均回收率為100.9%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了高效液相色譜法測(cè)定雙唑泰凝膠中羥苯乙酯含量的質(zhì)量分析方法，該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便、靈敏度較高、專屬性與重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為控制雙唑泰凝膠中羥苯乙酯限度的檢測(cè)方法，為雙唑泰凝膠制劑的標(biāo)準(zhǔn)提高、改進(jìn)提供參考依據(jù)，為雙唑泰凝膠使用的安全性提供進(jìn)一步的保證。

目前，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)對(duì)抑菌劑的使用上限已有明確的要求，但國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)篩選最低有效濃度有明確的方案，只有抑菌效力測(cè)定方法[25]；《中國(guó)藥典》2020 年版四部中對(duì)注射劑和糖漿劑中的抑菌劑種類與限度進(jìn)行了明確規(guī)定，而對(duì)其它制劑如凝膠劑、乳膏劑等只規(guī)定根據(jù)需要可加入抑菌劑，但抑菌效力應(yīng)符合抑菌效力檢查法的規(guī)定[24]，而對(duì)于雙唑泰凝膠這種復(fù)合抗菌凝膠劑，理化測(cè)定法只能測(cè)出抑菌劑的加入量，至于是否需要添加抑菌劑、添加抑菌劑的量、生產(chǎn)企業(yè)是否過量添加都需要進(jìn)一步結(jié)合抑菌效力試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[24,26-27]。

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)雙唑泰凝膠采用可壓縮的塑料瓶進(jìn)行包裝，通過擠壓方式擠出內(nèi)容物，但很難將內(nèi)容物全部擠出，多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每支大約能擠出3.5 g左右，僅占總量的70%，這樣勢(shì)必降低藥物實(shí)際有效性，影響療效。作為一種常用婦科外用非處方藥，為保證雙唑泰凝膠使用的安全性，建議相關(guān)藥品標(biāo)準(zhǔn)增加抑菌劑的檢查；為保證其有效性，建議生產(chǎn)企業(yè)結(jié)合實(shí)際使用情況合理加大內(nèi)容物的裝量，或者進(jìn)一步改換包裝如采用推進(jìn)式包裝等。