郝麗娟，苗會娟，韓佳芮，徐歡歡，王茉莉，徐艷梅

（1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評價重點實驗室，石家莊 050227；2.河北科技大學(xué)，石家莊 050091）

鹽酸拉貝洛爾用于治療高血壓和心絞痛等疾病，具有α1受體和β受體雙重拮抗作用，因不能突破胎盤屏障，不進(jìn)入母胎循環(huán)，臨床上多用于治療妊娠高血壓[1-4]。為了保障公眾尤其是婦嬰重點人群的用藥安全，對于鹽酸拉貝洛爾中微量和痕量雜質(zhì)的測定非常必要。

我國藥典、美國藥典和日本藥典均未設(shè)置鹽酸拉貝洛爾有關(guān)物質(zhì)檢查項[5-7]；英國藥典2020版采用薄層色譜(TLC)法測定有關(guān)物質(zhì)[8]，分離度和準(zhǔn)確度均不佳；周怡等[9]和鄭金琪等[10]采用高效液相色譜(HPLC)法測定鹽酸拉貝洛爾藥物中有關(guān)物質(zhì)，只對單一雜質(zhì)和雜質(zhì)總量進(jìn)行了檢測；郝麗娟等[11]采用HPLC 法同時測定鹽酸拉貝洛爾片中三種雜質(zhì)，但靈敏度較低，且以上方法均不能實現(xiàn)痕量雜質(zhì)的檢測。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法可以實現(xiàn)微量和痕量物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測，而且對各雜質(zhì)之間的色譜分離度無嚴(yán)格要求，但目前未見HPLCMS/MS 法應(yīng)用于鹽酸拉貝洛爾雜質(zhì)測定的報道。歐洲藥典指出鹽酸拉貝洛爾在合成和存儲過程中可能產(chǎn)生的微量或痕量雜質(zhì)主要有7 種，其中雜質(zhì)A是最易產(chǎn)生的降解雜質(zhì)，是酸性條件下鹽酸拉貝洛爾分子中的酰胺鍵水解為羧酸而產(chǎn)生，雜質(zhì)B 是酰胺鍵水解后再酯化產(chǎn)生，雜質(zhì)F是工藝雜質(zhì)，三者均需要得到有效控制。筆者參照文獻(xiàn)[12-16]建立了靈敏度高、專屬性好的HPLC-MS/MS 法，實現(xiàn)了對鹽酸拉貝洛爾中2-羥基-5-[1-羥基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸(以下簡稱“雜質(zhì)A”)、2-羥基-5-[1-羥基-2-[(1-甲基-3-苯丙基)氨基]乙基]苯甲酸甲酯(以下簡稱“雜質(zhì)B”)和2-羥基-5-(2-(4-苯基丁-2-氨基)乙酰)苯甲酰胺(以下簡稱“雜質(zhì)F”)三種雜質(zhì)的同時測定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Sciex QTRAP6500型，美國AB公司。

電子天平：XS105型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

鹽酸拉貝洛爾對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%，批號為1744-096 A1，美國TLC公司。

雜質(zhì)A 對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.1%，批號為2228-052 A3，美國TLC公司。

雜質(zhì)B 對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%，批號為2148-016 A3，美國TLC公司。

雜質(zhì)F (拉貝洛爾酮)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，批號為008-190403，某藥廠。

鹽酸拉貝洛爾樣品：某藥廠原料藥。

甲醇：色譜純，德國默克公司。

乙酸：色譜純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A相為0.1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的乙酸溶液，B相為乙腈-0.1%的乙酸溶液(體積比為1∶1)，流量為1.5 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，0～5 min時，流動相A體積分?jǐn)?shù)為100%，5～40 min 時，由100%逐漸減小到0，40～45 min 時，由0 逐漸增加到100%；檢測波長：230 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：大氣壓化學(xué)電離源，正離子模式；監(jiān)測模式：MRM，鹽酸拉貝洛爾及3 種雜質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表1；離子源溫度：350 ℃；脫溶劑氣流量：35 mL/min；氣簾氣壓力：0.103 MPa；噴霧電壓：5 500 V；噴霧氣壓力：0.241 MPa；干燥氣壓力：0.241 MPa。

表1 鹽酸拉貝洛爾及3種雜質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品處理

精密稱取鹽酸拉貝洛爾樣品100 mg，置于10 mL容量瓶中，加入流動相A適量，振搖，溶解后用流動相A稀釋至標(biāo)線，即得樣品溶液。

1.4 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B對照品和雜質(zhì)F 各約10 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，加入流動相A溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密量取上述3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，置于同一只100 mL容量瓶中，加入流動相A 稀釋至標(biāo)線，搖勻；再精密量取1 mL，置于25 mL容量瓶中，加入流動相A稀釋至標(biāo)線，搖勻，即得雜質(zhì)A、B、F質(zhì)量濃度均約為400 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.025、0.05、0.125、0.25、0.50、1.25、2.50、5.25 mL分別置于10 mL 容量瓶中，用流動相A 作溶劑稀釋至標(biāo)線，搖勻，得雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)F 的質(zhì)量濃度均分別為1、2、5、10、20、50、100、210 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

加標(biāo)樣品溶液：精密稱取鹽酸拉貝洛爾樣品100 mg，置于10 mL 容量瓶中，加入流動相A 適量，振搖，溶解后精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，用流動相A稀釋至標(biāo)線，搖勻。

1.5 實驗步驟

分別取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、空白溶液和樣品溶液，注入液相色譜-質(zhì)譜儀中測定，記錄色譜圖。分別以各雜質(zhì)質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各雜質(zhì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜方法

TLC 法測定有關(guān)物質(zhì)時，易受干擾，準(zhǔn)確度差。HPLC 法專屬性和準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于TLC 法，但無法實現(xiàn)痕量物質(zhì)的檢測。HPLC-MS/MS 法多應(yīng)用于檢測微量和痕量物質(zhì)，而且只要主成分和各雜質(zhì)可以實現(xiàn)有效分離即可實現(xiàn)各雜質(zhì)的準(zhǔn)確檢測，對各雜質(zhì)之間的分離度無嚴(yán)格要求，因此HPLC-MS/MS法可滿足同時測定3種痕量雜質(zhì)的要求。

2.1.2 色譜柱

鹽酸拉貝洛爾與雜質(zhì)A 和雜質(zhì)F 的極性相近，要求色譜柱分離效能較高，可以將鹽酸拉貝洛爾與各雜質(zhì)有效分離，同時為了防止色譜柱過載而導(dǎo)致待測物流失，還要求色譜柱具有較大的載樣量。分別考察了AgelaVenusil MP C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技(中國)有限公司]、Agilent Eclipse XDB-C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，安 捷 倫 科 技( 中 國) 有 限 公 司] 和ACE EXCEL3 C18-AR 柱(150 mm×4.6 mm，3 μm，英國ACE 公司) 3 種不同型號的色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種色譜柱均能實現(xiàn)主成分與雜質(zhì)的有效分離，其中AgelaVenusil MP C18柱分離色譜峰出現(xiàn)拖尾，Agilent Eclipse XDB-C18柱分離的色譜峰形和分離效果最好，可以滿足測定要求，故選擇Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱。

2.1.3 流動相

質(zhì)譜法中常加入少量的酸類來提高離子化效率，改善分離效果。流動相中加入酸類可以使樣品中含有活潑氫的易解離組分分離效果更好，改善色譜峰拖尾，優(yōu)化色譜峰型，常用的酸為甲酸或乙酸。分別采用甲酸、乙酸配制流動相，均可以得到較好的分離效果，采用甲酸時容易產(chǎn)生峰展寬，故選擇乙酸配制流動相。

以0.1%乙酸溶液為流動相A，分別考察乙腈-0.1%乙酸溶液、甲醇-0.1%乙酸溶液為流動相B時目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相B 時待測物更易洗脫，且乙腈的洗脫效應(yīng)強于甲醇，因此選擇流動相B 為乙腈-0.1%乙酸溶液。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 離子源

在選擇離子源時，分別對3 種雜質(zhì)在電噴霧離子源(ESI)和大氣壓化學(xué)電離離子源(APCI)的響應(yīng)進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，3種雜質(zhì)在APCI源上優(yōu)化后均具有較強的響應(yīng)，且響應(yīng)強度均約為ESI源的2倍，故以APCI源作為離子源。

2.2.2 進(jìn)樣閥切換

根據(jù)3 種雜質(zhì)的特性，對其進(jìn)行分離優(yōu)化。鹽酸拉貝洛爾極性較大，最快出峰(相對保留時間約19 min)，故將20 min 前調(diào)整進(jìn)樣閥切入廢液，以防止高濃度的主成分進(jìn)入質(zhì)譜儀對儀器的污染。

2.3 專屬性

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液和樣品溶液，注入液相色譜-質(zhì)譜儀，記錄色譜圖，所得總離子流(TIC)色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白溶液及加標(biāo)樣品溶液TIC圖

2.4 線性方程與檢出限

分別精密量取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2儀器工作條件測定，分別以3 種雜質(zhì)的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，計算線性方程及相關(guān)系數(shù)。

精密量取各組分質(zhì)量濃度均為1 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以流動相A 為溶劑逐級稀釋，按1.2儀器工作條件測定，以3 倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，以10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限。

3種雜質(zhì)的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限結(jié)果見表2。由表2可知，3種化合物的質(zhì)量濃度分別在1.016 0～203.20、1.032 0～206.40、1.037 0～207.40 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；3種化合物的檢出限均為0.03 ng/mL，定量限均為0.10 ng/mL。

表2 質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 溶液穩(wěn)定性

取3種雜質(zhì)的質(zhì)量濃度均為20 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液，于室溫下分別放置0、1、2、3、4、5、10 h，精密量取不同放置時間的上述溶液，按1.2儀器工作條件測定，結(jié)果見表3。由表3可知，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F 色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.7%、1.2%和3.5%，加標(biāo)樣品溶液中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B 和雜質(zhì)F 色譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%、4.1%和3.1%，表明混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與加標(biāo)樣品溶液均在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液不同放置時間時的色譜峰面積

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗

精密稱取鹽酸拉貝洛爾原料約100 mg，平行稱取9 份，置于10 mL 容量瓶中，加入2 mL 流動相A，振搖使溶解，再分別精密加入3 種雜質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.5、0.6 mL 各3 份，用流動相A 定容至標(biāo)線，搖勻。按1.2儀器工作條件測定，計算加標(biāo)回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。由表4 可知，雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)F 的平均回收率分別為95.3%、92.4%、91.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.44%、1.46%、1.11%，表明該法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可準(zhǔn)確地測定鹽酸拉貝洛爾中的雜質(zhì)含量。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了同時測定鹽酸拉貝洛爾中的雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)F的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法準(zhǔn)確度高，靈敏度好，對分離效果的要求較低，簡便快速，相對于HPLC法檢測限更低，可用于同時測定鹽酸拉貝洛爾中的3 種雜質(zhì)，為更好地控制鹽酸拉貝洛爾的質(zhì)量提供了一種新方法。