周威英,陳 劍,吳偉平, 葉曉云,胡艷艷

(浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院 1.檢驗科;2.婦瘤科,浙江 金華 321000;3.麗水市人民醫(yī)院 檢驗科,浙江 麗水 323000;4.浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 金華 321000)

宮頸癌(cervical cancer, CC)不僅是女性生殖器腫瘤最常見的腫瘤之一,也是女性惡性腫瘤最常見的腫瘤[1-2],中國宮頸癌占全球?qū)m頸癌發(fā)生率的12%,占全球?qū)m頸癌死亡率的11%[1]。高危型人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是宮頸癌發(fā)病的最主要原因之一,但從HPV感染發(fā)展到宮頸癌通常為5～10年,高危HPV感染致病宮頸癌的風(fēng)險也不同[2]。宮頸癌早篩可以有效降低CC的發(fā)病率和致死率。

血清鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)是目前廣泛使用的宮頸癌生物標(biāo)志物,但其靈敏度不足,在早期腫瘤的檢出率相對較低[3]。外泌體是一個納米囊泡,由于攜帶蛋白質(zhì)和核酸(mRNA, miRNA, lncRNA, DNA),作為生物標(biāo)志物和治療的潛在作用已引起了廣泛關(guān)注[4]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs, lncRNAs)參與人類多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展,其中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1位于13q32.1染色體上,轉(zhuǎn)錄成2 986 nt的轉(zhuǎn)錄本,在人類腫瘤的多個樞紐中發(fā)揮癌癥相關(guān)lncRNA的作用,如口腔癌、乳腺癌、宮頸癌、腎母細(xì)胞瘤[5-6]。本研究通過檢測宮頸癌患者血清外泌體中SOX21-AS1 的表達(dá)水平,并與健康人員比較,分析其在宮頸癌中的診斷價值,以期為尋找早期診斷宮頸癌的生物標(biāo)志物提供思路。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院2020年3月—2022年3月就診的130例宮頸癌患者為觀察組,收集50例同期健康體檢的健康女性為對照組。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡>18歲,無精神病病史;②病理學(xué)檢查為宮頸癌;③就診前1月無免疫、抗炎、抗感染、放化療等治療史;④知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):①妊娠期、哺乳期女性,②有其他原發(fā)性惡性腫瘤,③有免疫、血液、神經(jīng)等系統(tǒng)的嚴(yán)重性疾病,④有凝血功能障礙。觀察組年齡30～65歲,平均(47.62±6.87)歲;宮頸鱗癌98例(高分化鱗癌30例、中分化鱗癌41例、低分化鱗癌27例),宮頸腺癌26例,腺鱗癌6例;初次確診70例(鱗癌53例、腺癌16例、腺鱗癌1例),術(shù)后患者38例(鱗癌37例、腺癌1例),復(fù)發(fā)患者22例(鱗癌8例、腺癌9例、腺鱗癌5例)。對照組年齡28～65歲,平均(46.53±6.41)歲。所有的患者資料齊全,且手術(shù)之前沒有接受過新輔助化療或者相關(guān)放療。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 外泌體的分離及鑒定 采集宮頸癌患者和健康對照組的空腹外周血2 mL,不添加抗凝劑,自然條件下凝結(jié)1 h,取上清。經(jīng)過低溫(4 ℃)差速離心法提取外泌體,300 g離心10 min,取上清,低速離心除去細(xì)胞成分;2 000 g、3 000 r/min離心10 min,取上清,除去死細(xì)胞;10 000 g、5 000 r/min離心90 min,取上清,除去細(xì)胞碎片;100 000 g、5 000 r/min離心120 min,收集沉淀。外泌體重懸于PBS中,分裝外泌體懸液,-80 ℃保存,使用時經(jīng)4 ℃ 解凍,100 000 g、5 000 r/min離心70 min收集沉淀外泌體提取RNA或鑒定。透射電鏡觀察外泌體形態(tài),納米粒徑儀測量納米粒徑。

1.3 RNA提取及分析 沉淀的外泌體經(jīng)RNA快速提取試劑盒提取,血清中RNA提取經(jīng)ZCIBIO試劑盒提取總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,lncRNA SOX21-AS1使用SYBR Green Master(Rox)試劑盒擴(kuò)增。所有樣本都被重復(fù)分析3次,GAPDH作為內(nèi)參,使用2- △△Ct對所有樣本進(jìn)行歸一化處理分析。序列如下:

SOX21-AS1 forward:5’-CCTAACCCTTCACAACCAAAGA-3’

SOX21-AS1 reverse:5’-CTCAACCAGATTCAGGCAAGA-3’

GAPDH forward:5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’

GAPDH reverse:5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定 透射電鏡下觀察分離到的外泌體形態(tài)為一側(cè)內(nèi)凹的半球型雙層囊膜結(jié)構(gòu),如封三圖2A所示。納米粒徑儀測量可知,外泌體粒徑為52～196 nm、平均(120.43±26.36)nm,見封三圖2B。

2.2 血清外泌體lncRNA SOX21-AS1在宮頸癌患者中的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測顯示,宮頸癌患者血清和血清外泌體中的SOX21-AS1水平高于健康對照組,見圖1A、B。相對定量分析結(jié)果表示,宮頸癌患者血清中SOX21-AS1 的水平是健康對照組的3.16倍,外泌體中SOX21-AS1 的水平是健康對照組血清外泌體的3.83倍,見圖1C、D、E。初診、術(shù)后、復(fù)發(fā)患者與對照組的血清和血清總外泌體 SOX21-AS1水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);但初診、術(shù)后、復(fù)發(fā)患者間的血清和血清總外泌體 SOX21-AS1水平,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

圖1 lncRNA SOX21-AS1在宮頸癌患者和健康人群中的表達(dá)水平

注:橫坐標(biāo)中A為初診患者的血清RNA水平,B為初診患者血清外泌體RNA水平,C為手術(shù)患者的血清RNA水平,D為手術(shù)患者血清外泌體RNA水平,E為復(fù)發(fā)患者的血清RNA水平,F為復(fù)發(fā)患者血清外泌體RNA水平,G和H分別為健康對照組的血清和血清外泌體RNA水平。

2.3 LncRNA SOX21-AS1作為宮頸癌生物標(biāo)志物 在預(yù)測lncRNA SOX21-AS1對宮頸癌診斷的敏感性分析中發(fā)現(xiàn),宮頸癌患者血清lncRNA SOX21-AS1 的AUC 為0.9267(95% CI 0.8886～0.9648,P<0.0001)、血清外泌體 lncRNA SOX21-AS1 的AUC 為0.9543(95% CI 0.9257～0.9829,P<0.0001),見圖3。根據(jù)目前常用的CUT-OFF值確認(rèn)的方法,以陰性對照組的2倍為陽性判斷值,本次采用的CUT-OFF值為4.864,宮頸癌患者血清lncRNA SOX21-AS1的診斷敏感性為96.00%(95% CI: 86.54%～99.29%),特異性為80.77%(95% CI: 73.15%～86.62%);宮頸癌血清外泌體 lncRNA SOX21-AS1 的診斷敏感性為100%(95% CI: 92.87%～100%),特異性為73.08%(95% CI: 64.87%～79.96%)。宮頸癌患者血清外泌體中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的表達(dá)水平與宮頸癌的發(fā)病率具有更高的敏感性。

圖3 血清(A)血清外泌體(B)中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的表達(dá)水平與宮頸癌發(fā)病的敏感性分析

3 討論

宮頸癌篩查有助于早發(fā)現(xiàn)、早治療,改善宮頸癌的預(yù)后,但目前對于宮頸癌的診斷、預(yù)后均缺乏高靈敏度和特異性的無創(chuàng)血清指標(biāo)[7-8]。LncRNAs是一種分子量大于200 nt的非編碼RNA,根據(jù)基因組中l(wèi)ncRNA的位點,可分為5種類型:正義型lncRNA,反義型lncRNA,雙向型lncRNA,內(nèi)含子lncRNA,基因間型lncRNA[9-10]。長鏈非編碼RNAs參與人類多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展,其中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1在許多類型的人類腫瘤中發(fā)生失調(diào),可以通過調(diào)節(jié)血管生成、免疫和轉(zhuǎn)移等方式參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11-12]。如:LncRNA SOX21-AS1可海綿化MIR-7/VDAC1,促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展,提示可作為腫瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[13];在阿爾茨海默病中,下調(diào)SOX21-AS1通過上調(diào)FZD3/5和激活Wnt信號通路來減輕神經(jīng)元氧化應(yīng)激,抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[6]。

本研究結(jié)果顯示,宮頸癌患者外周血中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的水平顯著高于健康對照組,但是外周血中的RNA極易被降解,從而導(dǎo)致診斷的靈敏性下降。同時,宮頸癌患者血清外泌體中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的表達(dá)水平顯著高于健康對照組血清外泌體,并在區(qū)分宮頸癌患者和健康對照時表現(xiàn)出更高的診斷AUC,而且在血清外泌體中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的敏感性為100%。分析原因可能是外泌體是直徑范圍為30～100 nm左右的球形囊泡載體,密度1.10～1.18 g/mL,是細(xì)胞與細(xì)胞之間交流的關(guān)鍵,在腫瘤中的研究具有多樣性[14-15]。外泌體可以在體液循環(huán)中保護(hù)其內(nèi)裝載的蛋白質(zhì)、RNA、DNA不被降解,可以穩(wěn)定地高濃度存在于體液中,囊泡中攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA為腫瘤的無創(chuàng)診斷提供了基礎(chǔ),從而保持較高的敏感度和特異性,可以顯著降低臨床診斷出現(xiàn)假陽性的可能[16-17]。同時,外泌體能夠穩(wěn)定存在于循環(huán)系統(tǒng)中,保護(hù)RNA和蛋白不被降解,因此更加大了其診斷價值。

LncRNA SOX21-AS1在不同的腫瘤類型中,分別表達(dá)為腫瘤抑制因子或啟動因子[18]。有報道認(rèn)為,SOX21-AS1 在肺癌中的表達(dá)與總生存率相關(guān),SOX21-AS1的高表達(dá)是肺癌患者預(yù)后差的獨立標(biāo)志物[19]。本研究中,我們分析不同階段的宮頸癌患者血清和血清外泌體中l(wèi)ncRNA SOX21-AS1的表達(dá)水平,評價了SOX21-AS1 水平在宮頸癌患者診斷中的臨床價值,結(jié)果顯示:外泌體SOX21-AS1水平具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性,血清外泌體SOX21-AS1在宮頸癌篩查與診斷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。今后,我們將進(jìn)一步分析SOX21-AS1在治療過程中的變化情況,分析是否可作為評價和監(jiān)測宮頸癌患者療效與復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。

綜上所述, 血清外泌體中的SOX21-AS1 水平與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān),可以作為宮頸癌臨床診斷的生物標(biāo)志物。