史鵬飛， 李 旺， 樊文娜 ， 楊怡欣， 石亞奇

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003）

休眠是植物必須經(jīng)歷的生長階段， 不能完成正常休眠過程，會影響植物下一階段的生長發(fā)育。植物的休眠分為抑制性休眠、 內(nèi)生性休眠和生態(tài)休眠3 種類型（Do..rffling，1998）。 紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是長日照植物，由秋季光照減少和氣溫下降引起的生理休眠， 即內(nèi)生性休眠。 正常生長條件下自發(fā)性的休眠， 由本身內(nèi)部的休眠機(jī)制所控制，是苜蓿的一種生長特性，影響其生長性狀（Elgharably 等，2021；Djaman 等，2021）。

光周期是影響休眠的一種重要的環(huán)境因子，植物葉片中的光受體能夠接受光周期變化。 目前研究證實(shí)至少四類光受體，紅光、遠(yuǎn)紅光受體，藍(lán)光受體和紫外光受體 （王靜等，2007；Samach 等，2000；許智宏，1994）。 光敏色素A（phyA）和光敏色素B（phyB）是兩種最主要的光敏色素（遠(yuǎn)紅光和紅光受體），參與了植物光形態(tài)建成、生長發(fā)育調(diào)控等多個(gè)過程（Horvath，2009；Chen，2008）。 有研究證明日照長度的變化可以引起phyA 的表達(dá)量發(fā)生變化， 進(jìn)而調(diào)控植物的開花和休眠（Horvath，2009），phyB 通過改變植物內(nèi)源激素的含量參與對苜蓿秋眠的調(diào)控（王成章等，2006）。關(guān)于遠(yuǎn)紅光受體方面的研究也證明， 遠(yuǎn)紅光受體伴侶蛋白（FHY1）在協(xié)同phyA 表達(dá)趨向一致（陳芳等，2014）。 藍(lán)光受體隱花色素（CRY2B ）主要調(diào)節(jié)子葉生長和調(diào)控植物的開花時(shí)間（李平，2009；Jarillo等，2001）。本試驗(yàn)研究光敏色素A、B 基因沉默對不同秋眠型紫花苜蓿光受體基因phyA、phyB、CRY2B、FHY1 基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)馴鹿（秋眠1 級，秋眠型）野生型種子、phyA RNAi T1、T2 的種子（即馴鹿品種紫花苜蓿光敏色素A 基因沉默一代與二代種子），WL-903 （秋眠9 級， 非秋眠型）phyA RNAi T1（即WL-903 品種紫花苜蓿光敏色素A 基因沉默一代種子）和WL-903 phyB RNAi T1（即WL-903 品種紫花苜蓿光敏色素B 基因沉默一代）的種子，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)中所用引物序列見表1，phyA、phyB 引用倪俊霞（2013），GAPDH 引用吳鵬舉（2011），F(xiàn)HY1、CRY2B 使用Primer 5 設(shè)計(jì)。 轉(zhuǎn)基因植株生物學(xué)鑒定根據(jù)試驗(yàn)中所用的植物雙元表達(dá)載體pART27 上的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt-II）的片段設(shè)計(jì)。

表1 基因引物序列

1.3 光受體基因表達(dá)量檢測 T1、T2 代種子與野生型的馴鹿和WL-903 的種子花盆里種植，在光照培養(yǎng)箱白晝光周期比例為16 h/8 h， 白晝溫度為24/20 ℃的條件下培養(yǎng)（60 d），試驗(yàn)結(jié)束后次日上午10 點(diǎn)采樣，從頂部摘取苜蓿葉片（3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)）， 把葉片放入高壓滅菌過的凍存管中， 直接放入液氮， 實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?陽性植株鑒定完畢后再進(jìn)行phyA、phyB、CRY2B、FHY1 等基因的定量檢測。

將待測試驗(yàn)樣品紫花苜蓿葉片迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉狀，按照RNA 提取試劑 （Takara，RNAiso Plus） 上的操作說明提取總RNA，Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)測定RNA 濃度及OD 值，OD260/280在1.8 ～2.0。 反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)按照試劑盒RR047A 和2313B（Takara）說明書進(jìn)行，并記錄CT 值。

1.4 數(shù)據(jù)處理 基因表達(dá)量采用相對定量2-△△ct計(jì)算（目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率一致），試驗(yàn)數(shù)據(jù)以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤” 表示， 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件單因素方差分析，Duncan 氏法多重比較。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增片段PCR 鑒定 以轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA 提取DNA 及pART27-phyA、pART27-phyB 的質(zhì)粒為模板， 且以npt-II F1、npt-II R1 作為上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示。轉(zhuǎn)化成功的植株DNA 都擴(kuò)增出了484 bp長的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。 將PCR 鑒定為陽性的含有重組載體的FHY1、CRY2B、npt-II 大腸桿菌菌液送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，通過NCBI 上的工具BLAST 將測序結(jié)果與GenBank 上登錄的npt-II 基因的片段序列進(jìn)行比對分析，顯示大于99%的同源性，表明所克隆的序列即為預(yù)期的片段， 對經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行基因定量。

圖1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 鑒定

2.2 轉(zhuǎn)基因植株phyA、phyB、CRY2B、FHY1 等基因表達(dá)量

2.2.1 轉(zhuǎn)基因植株phyA 的表達(dá)量 如圖2 所示， 馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1、T2 代中phyA 基因的表達(dá)水平顯著低于野生型 （P＜0.05）； 非秋眠型苜蓿WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyA 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著 （P＞0.05），WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyA 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型（P＜0.05）。

圖2 轉(zhuǎn)基因植株phyA 的表達(dá)量

2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株FHY1 的表達(dá)量 如圖3 所示，馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1、T2 代中FHY1 基因的表達(dá)水平顯著低于野生型（P＜0.05）；WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中FHY1 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著（P＞0.05），WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中FHY1 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型（P＜0.05）。 在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中，作為phyA 的下游調(diào)控因子，F(xiàn)HY1 的表達(dá)趨勢與phyA 基本一致。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株FHY1 的表達(dá)量

2.2.3 轉(zhuǎn)基因植株phyB 的表達(dá)量 如圖4 所示， 馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyB基因的表達(dá)水平顯著高于野生型 （P＜0.05），而T2 代和野生型相比雖有增加但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1代中phyB 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型（P＜0.05），WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyB 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著（P＞0.05 ）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株phyB 的表達(dá)量

2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株CRY2B 的表達(dá)量 如圖5 所示，馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中CRY2B基因的表達(dá)水平顯著高于野生型 （P＜0.05），而T2 代和野生型相比雖有增加但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1代中CRY2B 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型（P＜0.05），WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中CRY2B 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著（P＞0.05）。 在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中，CRY2B 的表達(dá)趨勢與phyB 基本一致。

3 討論

phyA 和phyB 在短日照環(huán)境條件下誘導(dǎo)植物的休眠得到了驗(yàn)證 （Svendsen 等，2007；Wake，2000；Olsen 等，1997）， 在短日照條件下，phyA 的超表達(dá)可以誘導(dǎo)植物抑制休眠的發(fā)生， 通過改變其光照時(shí)間的長度方式進(jìn)而改變其休眠反應(yīng)（Olsen，2006）。 phyA 和phyB 表達(dá)量的變化在綠色植物光信號通路中發(fā)揮著及其重要的作用，擬南芥中96% 光誘導(dǎo)的基因是通過phyA 和phyB調(diào)節(jié)完成的（Quail，1994）。 研究發(fā)現(xiàn)，光照時(shí)間的變化調(diào)控了葡萄葉子中phyA 和phyB mRNA 表達(dá)量， 在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了葡萄休眠的產(chǎn)生（Kühn等，2009；Franklin 等，2003；Teuber，1984）。 phyA和phyB 具有某些功能的重疊，協(xié)同作用，這同時(shí)也說明至少部分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是共通的。 所以，phyA 和phyB 組成型突變體可能接受來自不同環(huán)境刺激的信號后，對這些信號進(jìn)行傳遞，最終影響了光形態(tài)建成的反應(yīng)（Franklin 等，2010；Franklin，2009；Franklin 等，2007；Teuber，1984）。 而近期研究多集中于苜蓿秋眠調(diào)控的差異基因和差異蛋白的篩選（Du 等，2018；Du 等，2017），而對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證鮮見報(bào)道。

phyA、phyB 作為紅光、 遠(yuǎn)紅光受體作為光敏色素家族里的重要成員發(fā)揮著關(guān)鍵的作用， 擬南芥研究證明phyB、CRY2B 在控制擬南芥開花的過程中，相互協(xié)同又相互拮抗。轉(zhuǎn)錄組測序的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的差異顯著基因主要發(fā)生在phyA、phyB、CRY2B 三個(gè)基因的兩種途徑上 （Du 等，2017）。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中，F(xiàn)HY1 的表達(dá)趨勢與phyA 基本一致，CRY2B 的表達(dá)和phyB 的表達(dá)近乎完全一致。 根據(jù)在不同月份采樣的光受體基因定量實(shí)驗(yàn)中，9月份四個(gè)品種phyB、CRY2B 的表達(dá)量均增加，二者在調(diào)控秋眠的作用中也相互協(xié)同， 且CRY2B對秋眠的反應(yīng)變化幅度大于其熱應(yīng)激的傷害（樊文娜，2015；Zhang 等，2014）。 轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果也證明，phyA、phyB 下游因子是差異倍數(shù)比較大的因子， 但phyA、phyB 本身差異并不明顯（Du等，2017），推測phyA、phyB 作為光信號的接受因子， 在轉(zhuǎn)錄之前參與了對苜蓿秋眠的調(diào)控。CRY2B 在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑苜蓿秋眠的調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，CRY2B 對秋眠的反應(yīng)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相對休眠（熱應(yīng)激），且在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中，CRY2B 的表達(dá)和phyB 的表達(dá)近乎完全一致， 二者的協(xié)同作用可見一斑，CRY2B 在苜蓿秋眠的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明， 沉默紫花苜蓿中的光敏色素A、B 基因?qū)hyA、phyB、FHY1、CRY2B 等光受體基因表達(dá)量均產(chǎn)生影響；沉默光敏色素A、B 基因，光受體phyA 與FHY1 基因表達(dá)趨同，phyB 與藍(lán)光受體CRY2B 基因表達(dá)趨同；phyA、phyB、FHY1、CRY2B 之間可能存在協(xié)同和互作效應(yīng)，具體作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。