史鵬飛， 李 旺， 樊文娜 ， 楊怡欣， 石亞奇

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003）

休眠是植物必須經(jīng)歷的生長階段， 不能完成正常休眠過程，會影響植物下一階段的生長發(fā)育。植物的休眠分為抑制性休眠、 內生性休眠和生態(tài)休眠3 種類型（Do..rffling，1998）。 紫花苜蓿（Medicago sativaL.）是長日照植物，由秋季光照減少和氣溫下降引起的生理休眠， 即內生性休眠。 正常生長條件下自發(fā)性的休眠， 由本身內部的休眠機制所控制，是苜蓿的一種生長特性，影響其生長性狀（Elgharably 等，2021；Djaman 等，2021）。

光周期是影響休眠的一種重要的環(huán)境因子，植物葉片中的光受體能夠接受光周期變化。 目前研究證實至少四類光受體，紅光、遠紅光受體，藍光受體和紫外光受體 （王靜等，2007；Samach 等，2000；許智宏，1994）。 光敏色素A（phyA）和光敏色素B（phyB）是兩種最主要的光敏色素（遠紅光和紅光受體），參與了植物光形態(tài)建成、生長發(fā)育調控等多個過程（Horvath，2009；Chen，2008）。 有研究證明日照長度的變化可以引起phyA 的表達量發(fā)生變化， 進而調控植物的開花和休眠（Horvath，2009），phyB 通過改變植物內源激素的含量參與對苜蓿秋眠的調控（王成章等，2006）。關于遠紅光受體方面的研究也證明， 遠紅光受體伴侶蛋白（FHY1）在協(xié)同phyA 表達趨向一致（陳芳等，2014）。 藍光受體隱花色素（CRY2B ）主要調節(jié)子葉生長和調控植物的開花時間（李平，2009；Jarillo等，2001）。本試驗研究光敏色素A、B 基因沉默對不同秋眠型紫花苜蓿光受體基因phyA、phyB、CRY2B、FHY1 基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗馴鹿（秋眠1 級，秋眠型）野生型種子、phyA RNAi T1、T2 的種子（即馴鹿品種紫花苜蓿光敏色素A 基因沉默一代與二代種子），WL-903 （秋眠9 級， 非秋眠型）phyA RNAi T1（即WL-903 品種紫花苜蓿光敏色素A 基因沉默一代種子）和WL-903 phyB RNAi T1（即WL-903 品種紫花苜蓿光敏色素B 基因沉默一代）的種子，由河南農業(yè)大學草業(yè)科學實驗室提供。

1.2 引物設計 試驗中所用引物序列見表1，phyA、phyB 引用倪俊霞（2013），GAPDH 引用吳鵬舉（2011），F(xiàn)HY1、CRY2B 使用Primer 5 設計。 轉基因植株生物學鑒定根據(jù)試驗中所用的植物雙元表達載體pART27 上的新霉素磷酸轉移酶基因（npt-II）的片段設計。

表1 基因引物序列

1.3 光受體基因表達量檢測 T1、T2 代種子與野生型的馴鹿和WL-903 的種子花盆里種植，在光照培養(yǎng)箱白晝光周期比例為16 h/8 h， 白晝溫度為24/20 ℃的條件下培養(yǎng)（60 d），試驗結束后次日上午10 點采樣，從頂部摘取苜蓿葉片（3 個生物學重復）， 把葉片放入高壓滅菌過的凍存管中， 直接放入液氮， 實驗室-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?陽性植株鑒定完畢后再進行phyA、phyB、CRY2B、FHY1 等基因的定量檢測。

將待測試驗樣品紫花苜蓿葉片迅速轉移至用液氮預冷的研缽中研磨至粉狀，按照RNA 提取試劑 （Takara，RNAiso Plus） 上的操作說明提取總RNA，Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計測定RNA 濃度及OD 值，OD260/280在1.8 ～2.0。 反轉錄和PCR 反應按照試劑盒RR047A 和2313B（Takara）說明書進行，并記錄CT 值。

1.4 數(shù)據(jù)處理 基因表達量采用相對定量2-△△ct計算（目的基因與內參基因的擴增效率一致），試驗數(shù)據(jù)以 “平均值±標準誤” 表示， 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件單因素方差分析，Duncan 氏法多重比較。

2 試驗結果

2.1 轉化植株擴增片段PCR 鑒定 以轉化植株的基因組DNA 提取DNA 及pART27-phyA、pART27-phyB 的質粒為模板， 且以npt-II F1、npt-II R1 作為上下游引物進行PCR 擴增， 得到的PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1 所示。轉化成功的植株DNA 都擴增出了484 bp長的目的片段，與預期結果一致。 將PCR 鑒定為陽性的含有重組載體的FHY1、CRY2B、npt-II 大腸桿菌菌液送到生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，通過NCBI 上的工具BLAST 將測序結果與GenBank 上登錄的npt-II 基因的片段序列進行比對分析，顯示大于99%的同源性，表明所克隆的序列即為預期的片段， 對經(jīng)過鑒定的轉化植株進行基因定量。

圖1 轉基因植株的PCR 鑒定

2.2 轉基因植株phyA、phyB、CRY2B、FHY1 等基因表達量

2.2.1 轉基因植株phyA 的表達量 如圖2 所示， 馴鹿phyA 沉默的轉基因植株T1、T2 代中phyA 基因的表達水平顯著低于野生型 （P＜0.05）； 非秋眠型苜蓿WL-903 phyA 沉默的轉基因植株T1 代中phyA 基因的表達水平與野生型相比差異不顯著 （P＞0.05），WL-903 phyB 沉默的轉基因植株T1 代中phyA 基因的表達水平顯著高于野生型（P＜0.05）。

圖2 轉基因植株phyA 的表達量

2.2.2 轉基因植株FHY1 的表達量 如圖3 所示，馴鹿phyA 沉默的轉基因植株T1、T2 代中FHY1 基因的表達水平顯著低于野生型（P＜0.05）；WL-903 phyA 沉默的轉基因植株T1 代中FHY1 基因的表達水平與野生型相比差異不顯著（P＞0.05），WL-903 phyB 沉默的轉基因植株T1 代中FHY1 基因的表達水平顯著高于野生型（P＜0.05）。 在phyA、phyB 沉默的轉基因植株中，作為phyA 的下游調控因子，F(xiàn)HY1 的表達趨勢與phyA 基本一致。

圖3 轉基因植株FHY1 的表達量

2.2.3 轉基因植株phyB 的表達量 如圖4 所示， 馴鹿phyA 沉默的轉基因植株T1 代中phyB基因的表達水平顯著高于野生型 （P＜0.05），而T2 代和野生型相比雖有增加但未達到顯著水平（P＞0.05）；WL-903 phyA 沉默的轉基因植株T1代中phyB 基因的表達水平顯著高于野生型（P＜0.05），WL-903 phyB 沉默的轉基因植株T1 代中phyB 基因的表達水平與野生型相比差異不顯著（P＞0.05 ）。

圖4 轉基因植株phyB 的表達量

2.2.4 轉基因植株CRY2B 的表達量 如圖5 所示，馴鹿phyA 沉默的轉基因植株T1 代中CRY2B基因的表達水平顯著高于野生型 （P＜0.05），而T2 代和野生型相比雖有增加但未達到顯著水平（P＞0.05）；WL-903 phyA 沉默的轉基因植株T1代中CRY2B 基因的表達水平顯著高于野生型（P＜0.05），WL-903 phyB 沉默的轉基因植株T1 代中CRY2B 基因的表達水平與野生型相比差異不顯著（P＞0.05）。 在phyA、phyB 沉默的轉基因植株中，CRY2B 的表達趨勢與phyB 基本一致。

3 討論

phyA 和phyB 在短日照環(huán)境條件下誘導植物的休眠得到了驗證 （Svendsen 等，2007；Wake，2000；Olsen 等，1997）， 在短日照條件下，phyA 的超表達可以誘導植物抑制休眠的發(fā)生， 通過改變其光照時間的長度方式進而改變其休眠反應（Olsen，2006）。 phyA 和phyB 表達量的變化在綠色植物光信號通路中發(fā)揮著及其重要的作用，擬南芥中96% 光誘導的基因是通過phyA 和phyB調節(jié)完成的（Quail，1994）。 研究發(fā)現(xiàn)，光照時間的變化調控了葡萄葉子中phyA 和phyB mRNA 表達量， 在轉錄水平調控了葡萄休眠的產生（Kühn等，2009；Franklin 等，2003；Teuber，1984）。 phyA和phyB 具有某些功能的重疊，協(xié)同作用，這同時也說明至少部分信號轉導途徑是共通的。 所以，phyA 和phyB 組成型突變體可能接受來自不同環(huán)境刺激的信號后，對這些信號進行傳遞，最終影響了光形態(tài)建成的反應（Franklin 等，2010；Franklin，2009；Franklin 等，2007；Teuber，1984）。 而近期研究多集中于苜蓿秋眠調控的差異基因和差異蛋白的篩選（Du 等，2018；Du 等，2017），而對關鍵靶基因進行鑒定和功能驗證鮮見報道。

phyA、phyB 作為紅光、 遠紅光受體作為光敏色素家族里的重要成員發(fā)揮著關鍵的作用， 擬南芥研究證明phyB、CRY2B 在控制擬南芥開花的過程中，相互協(xié)同又相互拮抗。轉錄組測序的光信號轉導途徑的差異顯著基因主要發(fā)生在phyA、phyB、CRY2B 三個基因的兩種途徑上 （Du 等，2017）。 本試驗發(fā)現(xiàn)，在phyA、phyB 沉默的轉基因植株中，F(xiàn)HY1 的表達趨勢與phyA 基本一致，CRY2B 的表達和phyB 的表達近乎完全一致。 根據(jù)在不同月份采樣的光受體基因定量實驗中，9月份四個品種phyB、CRY2B 的表達量均增加，二者在調控秋眠的作用中也相互協(xié)同， 且CRY2B對秋眠的反應變化幅度大于其熱應激的傷害（樊文娜，2015；Zhang 等，2014）。 轉錄組測序的結果也證明，phyA、phyB 下游因子是差異倍數(shù)比較大的因子， 但phyA、phyB 本身差異并不明顯（Du等，2017），推測phyA、phyB 作為光信號的接受因子， 在轉錄之前參與了對苜蓿秋眠的調控。CRY2B 在光信號轉導途徑苜蓿秋眠的調控中發(fā)揮著至關重要的作用，CRY2B 對秋眠的反應程度遠遠大于相對休眠（熱應激），且在phyA、phyB 沉默的轉基因植株中，CRY2B 的表達和phyB 的表達近乎完全一致， 二者的協(xié)同作用可見一斑，CRY2B 在苜蓿秋眠的調控中發(fā)揮著重要的作用。

4 結論

本試驗結果表明， 沉默紫花苜蓿中的光敏色素A、B 基因對phyA、phyB、FHY1、CRY2B 等光受體基因表達量均產生影響；沉默光敏色素A、B 基因，光受體phyA 與FHY1 基因表達趨同，phyB 與藍光受體CRY2B 基因表達趨同；phyA、phyB、FHY1、CRY2B 之間可能存在協(xié)同和互作效應，具體作用機理有待于進一步研究。