史鵬飛, 李 旺, 樊文娜 , 楊怡欣, 石亞奇
(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471003;2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南 洛陽(yáng) 471003)
休眠是植物必須經(jīng)歷的生長(zhǎng)階段, 不能完成正常休眠過程,會(huì)影響植物下一階段的生長(zhǎng)發(fā)育。植物的休眠分為抑制性休眠、 內(nèi)生性休眠和生態(tài)休眠3 種類型(Do..rffling,1998)。 紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是長(zhǎng)日照植物,由秋季光照減少和氣溫下降引起的生理休眠, 即內(nèi)生性休眠。 正常生長(zhǎng)條件下自發(fā)性的休眠, 由本身內(nèi)部的休眠機(jī)制所控制,是苜蓿的一種生長(zhǎng)特性,影響其生長(zhǎng)性狀(Elgharably 等,2021;Djaman 等,2021)。
光周期是影響休眠的一種重要的環(huán)境因子,植物葉片中的光受體能夠接受光周期變化。 目前研究證實(shí)至少四類光受體,紅光、遠(yuǎn)紅光受體,藍(lán)光受體和紫外光受體 (王靜等,2007;Samach 等,2000;許智宏,1994)。 光敏色素A(phyA)和光敏色素B(phyB)是兩種最主要的光敏色素(遠(yuǎn)紅光和紅光受體),參與了植物光形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控等多個(gè)過程(Horvath,2009;Chen,2008)。 有研究證明日照長(zhǎng)度的變化可以引起phyA 的表達(dá)量發(fā)生變化, 進(jìn)而調(diào)控植物的開花和休眠(Horvath,2009),phyB 通過改變植物內(nèi)源激素的含量參與對(duì)苜蓿秋眠的調(diào)控(王成章等,2006)。關(guān)于遠(yuǎn)紅光受體方面的研究也證明, 遠(yuǎn)紅光受體伴侶蛋白(FHY1)在協(xié)同phyA 表達(dá)趨向一致(陳芳等,2014)。 藍(lán)光受體隱花色素(CRY2B )主要調(diào)節(jié)子葉生長(zhǎng)和調(diào)控植物的開花時(shí)間(李平,2009;Jarillo等,2001)。本試驗(yàn)研究光敏色素A、B 基因沉默對(duì)不同秋眠型紫花苜蓿光受體基因phyA、phyB、CRY2B、FHY1 基因表達(dá)的影響。
1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)馴鹿(秋眠1 級(jí),秋眠型)野生型種子、phyA RNAi T1、T2 的種子(即馴鹿品種紫花苜蓿光敏色素A 基因沉默一代與二代種子),WL-903 (秋眠9 級(jí), 非秋眠型)phyA RNAi T1(即WL-903 品種紫花苜蓿光敏色素A 基因沉默一代種子)和WL-903 phyB RNAi T1(即WL-903 品種紫花苜蓿光敏色素B 基因沉默一代)的種子,由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)中所用引物序列見表1,phyA、phyB 引用倪俊霞(2013),GAPDH 引用吳鵬舉(2011),F(xiàn)HY1、CRY2B 使用Primer 5 設(shè)計(jì)。 轉(zhuǎn)基因植株生物學(xué)鑒定根據(jù)試驗(yàn)中所用的植物雙元表達(dá)載體pART27 上的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt-II)的片段設(shè)計(jì)。
表1 基因引物序列
1.3 光受體基因表達(dá)量檢測(cè) T1、T2 代種子與野生型的馴鹿和WL-903 的種子花盆里種植,在光照培養(yǎng)箱白晝光周期比例為16 h/8 h, 白晝溫度為24/20 ℃的條件下培養(yǎng)(60 d),試驗(yàn)結(jié)束后次日上午10 點(diǎn)采樣,從頂部摘取苜蓿葉片(3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)), 把葉片放入高壓滅菌過的凍存管中, 直接放入液氮, 實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?陽(yáng)性植株鑒定完畢后再進(jìn)行phyA、phyB、CRY2B、FHY1 等基因的定量檢測(cè)。
將待測(cè)試驗(yàn)樣品紫花苜蓿葉片迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中研磨至粉狀,按照RNA 提取試劑 (Takara,RNAiso Plus) 上的操作說明提取總RNA,Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度及OD 值,OD260/280在1.8 ~2.0。 反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)按照試劑盒RR047A 和2313B(Takara)說明書進(jìn)行,并記錄CT 值。
1.4 數(shù)據(jù)處理 基因表達(dá)量采用相對(duì)定量2-△△ct計(jì)算(目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率一致),試驗(yàn)數(shù)據(jù)以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤” 表示, 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件單因素方差分析,Duncan 氏法多重比較。
2.1 轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增片段PCR 鑒定 以轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA 提取DNA 及pART27-phyA、pART27-phyB 的質(zhì)粒為模板, 且以npt-II F1、npt-II R1 作為上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖1 所示。轉(zhuǎn)化成功的植株DNA 都擴(kuò)增出了484 bp長(zhǎng)的目的片段,與預(yù)期結(jié)果一致。 將PCR 鑒定為陽(yáng)性的含有重組載體的FHY1、CRY2B、npt-II 大腸桿菌菌液送到生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,通過NCBI 上的工具BLAST 將測(cè)序結(jié)果與GenBank 上登錄的npt-II 基因的片段序列進(jìn)行比對(duì)分析,顯示大于99%的同源性,表明所克隆的序列即為預(yù)期的片段, 對(duì)經(jīng)過鑒定的轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行基因定量。
圖1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR 鑒定
2.2 轉(zhuǎn)基因植株phyA、phyB、CRY2B、FHY1 等基因表達(dá)量
2.2.1 轉(zhuǎn)基因植株phyA 的表達(dá)量 如圖2 所示, 馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1、T2 代中phyA 基因的表達(dá)水平顯著低于野生型 (P<0.05); 非秋眠型苜蓿WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyA 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著 (P>0.05),WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyA 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型(P<0.05)。
圖2 轉(zhuǎn)基因植株phyA 的表達(dá)量
2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株FHY1 的表達(dá)量 如圖3 所示,馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1、T2 代中FHY1 基因的表達(dá)水平顯著低于野生型(P<0.05);WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中FHY1 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著(P>0.05),WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中FHY1 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型(P<0.05)。 在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中,作為phyA 的下游調(diào)控因子,F(xiàn)HY1 的表達(dá)趨勢(shì)與phyA 基本一致。
圖3 轉(zhuǎn)基因植株FHY1 的表達(dá)量
2.2.3 轉(zhuǎn)基因植株phyB 的表達(dá)量 如圖4 所示, 馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyB基因的表達(dá)水平顯著高于野生型 (P<0.05),而T2 代和野生型相比雖有增加但未達(dá)到顯著水平(P>0.05);WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1代中phyB 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型(P<0.05),WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中phyB 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著(P>0.05 )。
圖4 轉(zhuǎn)基因植株phyB 的表達(dá)量
2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株CRY2B 的表達(dá)量 如圖5 所示,馴鹿phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中CRY2B基因的表達(dá)水平顯著高于野生型 (P<0.05),而T2 代和野生型相比雖有增加但未達(dá)到顯著水平(P>0.05);WL-903 phyA 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1代中CRY2B 基因的表達(dá)水平顯著高于野生型(P<0.05),WL-903 phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株T1 代中CRY2B 基因的表達(dá)水平與野生型相比差異不顯著(P>0.05)。 在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中,CRY2B 的表達(dá)趨勢(shì)與phyB 基本一致。
phyA 和phyB 在短日照環(huán)境條件下誘導(dǎo)植物的休眠得到了驗(yàn)證 (Svendsen 等,2007;Wake,2000;Olsen 等,1997), 在短日照條件下,phyA 的超表達(dá)可以誘導(dǎo)植物抑制休眠的發(fā)生, 通過改變其光照時(shí)間的長(zhǎng)度方式進(jìn)而改變其休眠反應(yīng)(Olsen,2006)。 phyA 和phyB 表達(dá)量的變化在綠色植物光信號(hào)通路中發(fā)揮著及其重要的作用,擬南芥中96% 光誘導(dǎo)的基因是通過phyA 和phyB調(diào)節(jié)完成的(Quail,1994)。 研究發(fā)現(xiàn),光照時(shí)間的變化調(diào)控了葡萄葉子中phyA 和phyB mRNA 表達(dá)量, 在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控了葡萄休眠的產(chǎn)生(Kühn等,2009;Franklin 等,2003;Teuber,1984)。 phyA和phyB 具有某些功能的重疊,協(xié)同作用,這同時(shí)也說明至少部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是共通的。 所以,phyA 和phyB 組成型突變體可能接受來自不同環(huán)境刺激的信號(hào)后,對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行傳遞,最終影響了光形態(tài)建成的反應(yīng)(Franklin 等,2010;Franklin,2009;Franklin 等,2007;Teuber,1984)。 而近期研究多集中于苜蓿秋眠調(diào)控的差異基因和差異蛋白的篩選(Du 等,2018;Du 等,2017),而對(duì)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行鑒定和功能驗(yàn)證鮮見報(bào)道。
phyA、phyB 作為紅光、 遠(yuǎn)紅光受體作為光敏色素家族里的重要成員發(fā)揮著關(guān)鍵的作用, 擬南芥研究證明phyB、CRY2B 在控制擬南芥開花的過程中,相互協(xié)同又相互拮抗。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的差異顯著基因主要發(fā)生在phyA、phyB、CRY2B 三個(gè)基因的兩種途徑上 (Du 等,2017)。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中,F(xiàn)HY1 的表達(dá)趨勢(shì)與phyA 基本一致,CRY2B 的表達(dá)和phyB 的表達(dá)近乎完全一致。 根據(jù)在不同月份采樣的光受體基因定量實(shí)驗(yàn)中,9月份四個(gè)品種phyB、CRY2B 的表達(dá)量均增加,二者在調(diào)控秋眠的作用中也相互協(xié)同, 且CRY2B對(duì)秋眠的反應(yīng)變化幅度大于其熱應(yīng)激的傷害(樊文娜,2015;Zhang 等,2014)。 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果也證明,phyA、phyB 下游因子是差異倍數(shù)比較大的因子, 但phyA、phyB 本身差異并不明顯(Du等,2017),推測(cè)phyA、phyB 作為光信號(hào)的接受因子, 在轉(zhuǎn)錄之前參與了對(duì)苜蓿秋眠的調(diào)控。CRY2B 在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑苜蓿秋眠的調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,CRY2B 對(duì)秋眠的反應(yīng)程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相對(duì)休眠(熱應(yīng)激),且在phyA、phyB 沉默的轉(zhuǎn)基因植株中,CRY2B 的表達(dá)和phyB 的表達(dá)近乎完全一致, 二者的協(xié)同作用可見一斑,CRY2B 在苜蓿秋眠的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。
本試驗(yàn)結(jié)果表明, 沉默紫花苜蓿中的光敏色素A、B 基因?qū)hyA、phyB、FHY1、CRY2B 等光受體基因表達(dá)量均產(chǎn)生影響;沉默光敏色素A、B 基因,光受體phyA 與FHY1 基因表達(dá)趨同,phyB 與藍(lán)光受體CRY2B 基因表達(dá)趨同;phyA、phyB、FHY1、CRY2B 之間可能存在協(xié)同和互作效應(yīng),具體作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。