夏明輝，張 珅,，趙云峰，汪 瑩，何 凡，陳發(fā)河，林藝芬，陳福泉,

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；3.亞熱帶特色農(nóng)產(chǎn)品采后生物學(xué)（福建農(nóng)林大學(xué)）福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

獼猴桃為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）藤本植物，原產(chǎn)于我國(guó)，在我國(guó)南北方地區(qū)均有大規(guī)模種植，果實(shí)產(chǎn)量居世界首位，是重要的大宗經(jīng)濟(jì)水果[1]，并且具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，其采后成熟過程的重要特征為接近完熟時(shí)果實(shí)迅速軟化，導(dǎo)致果實(shí)貯運(yùn)期受限，貨架期和最佳食用期較短[3]，因此在其采收和商品化處理、流通過程中廣泛采用適當(dāng)早采、單果內(nèi)襯和箱式包裝等方式[4]，以提高果實(shí)耐貯運(yùn)性，并結(jié)合冷藏、氣調(diào)貯藏等手段以延緩后熟過程，延長(zhǎng)其保鮮期[3]。作為冷敏型果實(shí)，獼猴桃在不適宜的低溫條件下極易發(fā)生冷害，主要表現(xiàn)為果肉顆粒狀木質(zhì)化和水浸狀腐敗，嚴(yán)重降低果實(shí)的食用品質(zhì)，導(dǎo)致貯藏、運(yùn)輸、流通和銷售過程中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。

國(guó)內(nèi)外研究人員采用許多化學(xué)和物理方法，如1-甲基環(huán)丙烯[9]、臭氧[10]、乙烯[11]、草酸[12]、褪黑素[13]以及氣調(diào)[14]處理等，通過維持活性氧代謝酶系統(tǒng)較高的清除能力延緩果實(shí)冷害的發(fā)生。在諸多化學(xué)方法中，外部施用植物內(nèi)源調(diào)節(jié)物質(zhì)的方法具有較廣的適用性，也更有助于深入發(fā)掘果蔬冷害發(fā)生與控制的內(nèi)在調(diào)控點(diǎn)，可產(chǎn)生良好的冷害控制效果，加深對(duì)于相關(guān)機(jī)制的理論認(rèn)知[15-17]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是廣泛存在于生物體內(nèi)的天然氨基酸，具有天然無毒、極易獲取、成本低等特點(diǎn)，并且可調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多種脅迫反應(yīng)[18]。研究表明，GABA可以通過提高抗氧化酶活性[19]、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)[19]、維持能量水平[20]、減輕膜脂過氧化程度[21]等作用提高西葫蘆[20]、番石榴[22]、印度油柑[23]等果蔬的組織抗冷性，減輕低溫傷害。但是，目前鮮見將GABA應(yīng)用于獼猴桃采后冷害控制的報(bào)道；GABA是否對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)活性氧清除系統(tǒng)，尤其是非酶清除系統(tǒng)具有調(diào)控效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)氧化還原平衡，增強(qiáng)組織抗冷性，也值得深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用GABA溶液對(duì)采后獼猴桃果實(shí)進(jìn)行貯前處理，研究GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)冷害發(fā)生和活性氧產(chǎn)生、活性氧清除酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的影響，旨在為采后獼猴桃果實(shí)冷害控制實(shí)踐及調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃果實(shí)采自福建省三明市建寧縣聚晟源現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，果實(shí)采收后經(jīng)單果套網(wǎng)袋和瓦楞紙箱包裝，由廂式貨車于5 h內(nèi)運(yùn)至集美大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實(shí)驗(yàn)室（廈門），選取約9 成熟且形狀大小均一、無機(jī)械傷和病蟲害的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

氫氧化鈉、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、乙酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、α-萘胺、亞硝酸鉀、二甲酚橙、硫酸亞鐵銨、乙二胺四乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、H2O2、二硫蘇代糖醇、蛋氨酸、氮藍(lán)四唑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；核黃素、二硫代硝基苯酸鉀、GSH、氧化型谷胱甘肽、還原型輔酶II四鈉鹽、AsA、還原型輔酶I、抗壞血酸氧化酶、單脫氫抗壞血酸（monodehydroascorbic acid，MDHA）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 阿拉?。ㄉ虾＃┰噭┯邢薰?；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀 廈門超技儀器設(shè)備有限公司；全自動(dòng)分析天平 上?；ǔ睂?shí)業(yè)有限公司；UV-8000紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SYG-1220數(shù)顯恒溫水浴鍋 美國(guó)精騏有限公司；JM-05D-80超聲波清洗機(jī)廣東潔盟超聲實(shí)業(yè)有限公司；PSX-330H智能恒溫恒濕箱寧波萊?？萍加邢薰?；DDS-11A電導(dǎo)率儀 上海大普儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)采后處理及貯藏

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已篩選出2.0 mmol/L為較適宜的GABA處理濃度。將獼猴桃果實(shí)隨機(jī)分為兩組，每組300 個(gè)果實(shí)。一組果實(shí)用2.0 mmol/L GABA溶液浸泡20 min，另一組果實(shí)以蒸餾水代替GABA溶液浸泡作為對(duì)照組，處理后的果實(shí)在20 ℃下靜置1 h，自然晾干，然后置于（4±1）℃、（85±5）%相對(duì)濕度的冷庫(kù)中貯藏。貯藏期內(nèi)每10 d隨機(jī)取40 個(gè)獼猴桃果實(shí)樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 細(xì)胞膜透性

參照Zhang Zhengke等[24]的方法，隨機(jī)選取10 個(gè)獼猴桃果實(shí)，用打孔器（8 mm）在每個(gè)果實(shí)赤道面上取3 片2 mm厚的薄片，用電導(dǎo)率儀分別測(cè)定自然滲出電解質(zhì)溶液和組織破壞后滲出電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)率，結(jié)果以相對(duì)電導(dǎo)率表示。

1.3.2.2 冷害指數(shù)

參考Li Ziying等[25]的方法，根據(jù)獼猴桃果實(shí)去皮后表面凹陷和水漬狀部分占整果表面積比例，將冷害指數(shù)分為4 級(jí)：0級(jí)為無冷害癥狀；1級(jí)為冷害發(fā)生面積比例小于25%；2級(jí)為冷害發(fā)生面積比例大于25%且小于50%；3級(jí)為冷害面積比例大于50%且小于75%；4級(jí)為冷害發(fā)生面積比例大于75%。貯藏過程中及時(shí)剔除因微生物侵染而腐爛的果實(shí)，之后不再列入統(tǒng)計(jì)。冷害指數(shù)按式（1）計(jì)算。

1.3.2.3 丙二醛含量

參考Lin Yu zhao 等[26]的方法進(jìn)行丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定，隨機(jī)從20 個(gè)獼猴桃果實(shí)中取2.0 g果肉，采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定其在532 nm波長(zhǎng)處的吸光度，分別在420 nm和600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度用于消除誤差，結(jié)果以μmol/g為單位。

H2O2含量參考王俊文[28]的方法，隨機(jī)從20 個(gè)獼猴桃果實(shí)中取2.0 g果肉，采用二甲酚橙顯色法進(jìn)行測(cè)定，以H2O2標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以μmol/g為單位。

1.3.2.5 可溶性蛋白含量

參考Lin Yifen等[27]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其含量用于后續(xù)酶活力計(jì)算。

1.3.2.6 活性氧清除酶活力

SOD活力的測(cè)定參考楊乾等[29]的方法，隨機(jī)從20 個(gè)獼猴桃果實(shí)中取2.0 g果肉，以每分鐘酶反應(yīng)體系對(duì)氮藍(lán)四唑光化學(xué)還原抑制50%為1 個(gè)活力單位（1 U）。CAT活力的測(cè)定參考Cakmak等[30]的方法，以每分鐘反應(yīng)溶液在240 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 U。APX活力的測(cè)定參考Ren Yanfang等[31]的方法，以每分鐘反應(yīng)體系在290 nm波長(zhǎng)處OD值變化0.01為1 U。上述酶活力結(jié)果均以U/mg pro為單位。

1.3.2.7 AsA和GSH含量

參考胡苗等[32]的方法，隨機(jī)從20 個(gè)獼猴桃果實(shí)中取2.0 g果肉，采用比色法進(jìn)行AsA含量的測(cè)定，對(duì)其還原的亞鐵離子與紅菲咯啉反應(yīng)生成物進(jìn)行比色；通過與5.5’-二硫雙對(duì)硝基苯甲酸（5.5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）反應(yīng)測(cè)定GSH含量，分別以AsA和GSH標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，AsA和GSH含量分別以mg/100 g和μmol/g為單位。

1.3.2.8 AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶活力

參考王懿等[33]的方法，隨機(jī)從20 個(gè)獼猴桃果實(shí)中取2.0 g果肉，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力以每分鐘反應(yīng)體系在340 nm波長(zhǎng)處吸光度減少0.01為1 U；MDHA還原酶（monodehydroascorbate reductase，MDHAR）活力以消耗1 μmol NADH為1 U；脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）活力以生成1 μmol的AsA為1 U。結(jié)果均以U/mg pro為單位。

1.3.2.9 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率和總還原力

參考Chen Chen等[34]的方法，隨機(jī)從20 個(gè)獼猴桃果實(shí)中取2.0 g果肉，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除法和亞鐵離子法分別測(cè)定DPPH自由基清除率及總還原力，分別在517 nm和700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，DPPH自由基清除率采用公式（2）計(jì)算?？傔€原力以700 nm波長(zhǎng)處吸光度表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，使用Microsoft Excel 2019軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖。采用SPSS Statistics 26軟件中單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。采用Origin 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析（principal components analysis，PCA）并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)冷害的影響

如圖1A所示，冷藏獼猴桃果實(shí)的冷害指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，與對(duì)照組果實(shí)相比，處理組果實(shí)的冷害指數(shù)在20～40 d和60 d時(shí)顯著較低（P＜0.05，P＜0.01）。圖1B顯示，對(duì)照組獼猴桃果實(shí)的細(xì)胞膜透性在0～10 d迅速上升，隨后緩慢升高。由于采后果實(shí)接近完熟時(shí)細(xì)胞膜透性會(huì)快速上升，可推斷本研究供試果實(shí)冷藏條件下的快速后熟期為貯藏0～10 d。GABA處理組果實(shí)細(xì)胞膜透性的變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致，且在整個(gè)貯藏期內(nèi)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01）。由圖1C可知，獼猴桃果實(shí)MDA含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加；與對(duì)照組相比，經(jīng)GABA處理的果實(shí)MDA含量在貯藏0～30 d緩慢升高，其中在10～30 d和60 d時(shí)顯著較低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)冷害指數(shù)（A）、細(xì)胞膜透性（B）和MDA含量（C）的影響Fig.1 Effect of GABA treatment on chilling injury index (A),cell membrane permeability (B),and MDA content (C) in kiwifruit during cold storage

2.2 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

圖2 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)產(chǎn)生速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.2 Effect of GABA treatment on superoxide anion radical production rate (A) and H2O2 content (B) in kiwifruit during cold storage

2.3 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)活性氧清除酶活力的影響

如圖3A所示，對(duì)照組和GABA處理組果實(shí)的SOD活力均在0～10 d上升，之后隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷下降；與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)的SOD活力在10～30 d和50 d時(shí)顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。由圖3B可知，對(duì)照組果實(shí)CAT活力在整個(gè)貯藏期內(nèi)逐漸下降，而GABA處理組果實(shí)CAT活力在0～10 d升高，10～20 d迅速下降，隨后呈緩慢降低趨勢(shì)，并且在整個(gè)貯藏期內(nèi)與對(duì)照組相比顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。圖3C顯示，在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照組和GABA處理組果實(shí)APX活力均在貯藏0～20 d上升并到達(dá)高峰，20～60 d逐漸下降；相較于對(duì)照組，GABA處理組果實(shí)APX活力在20 d和40～60 d時(shí)顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)SOD（A）、CAT（B）和APX（C）活力的影響Fig.3 Effect of GABA treatment on SOD (A),CAT (B) and APX (C)activities in kiwifruit during cold storage

2.4 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)AsA和GSH含量的影響

如圖4A所示，對(duì)照組果實(shí)AsA含量在0～10 d快速升高，10～30 d緩慢上升，30～60 d不斷下降；與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)AsA含量在0～10 d升高較快，10～30 d維持在較高水平，隨后逐漸下降，且在貯藏10～60 d極顯著較高（P＜0.01）。由圖4B可知，對(duì)照組和GABA處理組果實(shí)的GSH含量均在0～40 d逐漸上升，40～60 d迅速下降，且與對(duì)照組相比GABA處理組果實(shí)GSH含量在10～40 d和60 d時(shí)顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)AsA（A）和GSH（B）含量的影響Fig.4 Effect of GABA treatment on the contents of AsA (A) and GSH (B)in kiwifruit during cold storage

2.5 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)AsA-GSH循環(huán)酶活力的影響

如圖5A所示，對(duì)照組果實(shí)GR活力在貯藏0～40 d緩慢升高，40～60 d快速下降；而GABA處理組果實(shí)的GR活力在0～30 d迅速上升，30～60 d迅速下降。與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)的GR活力在30～40 d極顯著較高（P＜0.01）。圖5B顯示，對(duì)照組果實(shí)MDHAR活力在0～30 d上升并達(dá)到高峰，30～50 d迅速下降后趨于穩(wěn)定；GABA處理組果實(shí)的MDHAR活力變化趨勢(shì)與對(duì)照組一致，并在20～30 d顯著較高（P＜0.05，P＜0.01）。由圖5C可知，對(duì)照組果實(shí)DHAR活力在貯藏期內(nèi)變化較平穩(wěn)，0～40 d緩慢升高，隨后有所降低；與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)DHAR活力在0～30 d快速上升并達(dá)到峰值，30～40 d迅速下降，隨后較為穩(wěn)定，且在整個(gè)貯藏期間均極顯著較高（P＜0.01）。

圖5 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃GR（A）、MDHAR（B）和DHAR（C）活力的影響Fig.5 Effect of GABA treatment on the activities of GR (A),MDHAR (B) and DHAR (C) in kiwifruit during cold storage

2.6 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)DPPH自由基清除率和總還原力的影響

如圖6所示，對(duì)照組和GABA處理組果實(shí)的DPPH自由基清除率和總還原力均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，表明果實(shí)抗氧化性逐漸降低。而在相同貯藏期內(nèi)，與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)具有顯著較高的抗氧化性（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 GABA處理對(duì)冷藏獼猴桃果實(shí)DPPH自由基清除能力（A）和總還原力（B）的影響Fig.6 Effect of GABA treatment on DPPH radical scavenging capacity (A)and total reducing power (B) in kiwifruit during cold storage

2.7 相關(guān)性分析及PCA

如圖7A所示，在冷藏期間，對(duì)照組獼猴桃果實(shí)冷害指數(shù)與細(xì)胞膜透性呈顯著正相關(guān)（r＝0.83，P＜0.05）。細(xì)胞膜透性和MDA含量呈顯著正相關(guān)（r＝0.87，P＜0.05），MDA含量與產(chǎn)生速率（r＝0.94）、H2O2含量（r＝0.97）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。產(chǎn)生速率與SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.86，P＜0.05）。H2O2含量與CAT活力呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.93，P＜0.05）。MDHAR和DHAR活力均與AsA含量呈正相關(guān)，GR活力與GSH含量呈顯著正相關(guān)（r＝0.94，P＜0.05）。冷害指數(shù)（r＝-0.96）和細(xì)胞膜透性（r＝-0.93 ）均與總還原力呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）?？傔€原力與產(chǎn)生速率（r＝-0.95）和H2O2含量（r＝-0.99）均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），并與SOD活力（r＝0.84）和CAT活力（r＝0.91）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。采用PCA法分析了對(duì)照組和GABA處理組獼猴桃果實(shí)冷害相關(guān)指標(biāo)和活性氧代謝相關(guān)酶的活力。如圖7B所示，通過分析協(xié)方差矩陣的特征值，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)主成分（PC）占數(shù)據(jù)集總方差的86.6%，表明降維后的數(shù)據(jù)能夠很好地表征原始數(shù)據(jù)。PC1涵蓋了數(shù)據(jù)集中53.6%的方差，主要體現(xiàn)果實(shí)冷害、活性氧水平和活性氧清除酶活力的特征值變化。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和GABA處理組的負(fù)荷值在PC1上均不斷增大，表明活性氧清除酶活力逐漸下降，活性氧不斷積累，冷害指數(shù)升高。與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)能夠維持較低的負(fù)荷值，說明GABA處理能夠較好地維持冷藏獼猴桃果實(shí)活性氧清除酶系統(tǒng)的清除能力，延緩活性氧積累，減緩冷害的發(fā)生。PC2涵蓋了數(shù)據(jù)集中33.0%的方差，主要體現(xiàn)活性氧清除非酶系統(tǒng)（AsA-GSH循環(huán)）與冷害和活性氧水平之間的關(guān)系。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和GABA處理組的負(fù)荷值在PC2上均先增大后減小，AsA-GSH循環(huán)中相應(yīng)物質(zhì)含量和酶活力在貯藏中期均達(dá)到高峰。與對(duì)照組相比，GABA處理組果實(shí)能夠使以上指標(biāo)維持較高的負(fù)荷值，說明GABA處理能夠提高AsAGSH循環(huán)的活力，延緩活性氧的積累及冷害的發(fā)生。

圖7 冷藏獼猴桃果實(shí)冷害和活性氧代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析（A）和PCA（B）Fig.7 Correlation analysis (A) and principal components analysis plot(B) of chilling injury related indexes versus ROS of postharvest kiwifruit during cold storage

3 討論

細(xì)胞膜是果實(shí)細(xì)胞內(nèi)外生理生化狀態(tài)變化的重要反映者，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵屏障，而果蔬冷害發(fā)生的初級(jí)與次級(jí)反應(yīng)均與細(xì)胞膜的相態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等變化有關(guān)[35]。作為植物低溫脅迫下的主要次級(jí)反應(yīng)，活性氧的大量產(chǎn)生與積累會(huì)直接影響細(xì)胞膜系統(tǒng)和生物大分子，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，導(dǎo)致膜透性升高[12]。MDA作為活性氧攻擊細(xì)胞膜脂的產(chǎn)物，也具有較強(qiáng)的氧化性，會(huì)進(jìn)一步加重細(xì)胞膜的損傷，從而加劇冷害癥狀。研究表明，外源GABA處理能夠延緩櫻桃[19]、番石榴[22]和桃[36]等果實(shí)冷藏期間冷害指數(shù)、細(xì)胞膜透性和MDA含量的上升，從而延緩果實(shí)冷害。Huang Hua等[37]研究發(fā)現(xiàn)，采用蘋果酸處理可以延緩香蕉果實(shí)產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升，從而減緩冷害進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，獼猴桃果實(shí)冷害指數(shù)、細(xì)胞膜透性和MDA含量在低溫貯藏過程中都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高（圖1），同時(shí)產(chǎn)生速率和H2O2含量不斷上升（圖2）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，細(xì)胞膜透性與冷害指數(shù)和MDA含量在整個(gè)貯藏期間均呈顯著正相關(guān)，而MDA含量與產(chǎn)生速率和H2O2含量在整個(gè)貯藏期內(nèi)均呈顯著正相關(guān)（圖7A）。由PCA結(jié)果可知，冷害指數(shù)、細(xì)胞膜透性、MDA含量、產(chǎn)生速率和H2O2含量都在PC1中具有較高的正載荷值，且GABA處理組果實(shí)的正載荷值低于對(duì)照組果實(shí)（圖7B）。由此推斷，獼猴桃果實(shí)冷害的發(fā)生與冷藏過程中活性氧大量積累從而加劇膜脂過氧化，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有關(guān)。GABA處理顯著抑制了冷藏獼猴桃果實(shí)冷害指數(shù)、細(xì)胞膜透性和MDA含量的上升（圖1），同時(shí)延緩了產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升（圖2），說明GABA處理可以通過延緩活性氧的積累，減少果實(shí)組織中MDA的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，保持細(xì)胞膜較好的完整性，減輕果實(shí)在低溫脅迫下的功能失調(diào)。

低溫脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的不平衡會(huì)引發(fā)哈密瓜[8]、甜瓜[29]和杏[38]等果實(shí)體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，加劇其生理失調(diào)與冷害癥狀。許多研究表明，減輕氧化脅迫對(duì)維持冷敏型果實(shí)細(xì)胞膜完整性、提高其抗冷性、延緩低溫冷害有重要作用，其內(nèi)在主導(dǎo)因素為酶和非酶系統(tǒng)組成的活性氧清除系統(tǒng)[29]?；钚匝跚宄赶到y(tǒng)是主要的活性氧清除方式，其中SOD專一歧化形成H2O2，CAT和APX可將H2O2還原為H2O和O2[39]，從而減輕氧化損傷。何歡等[38]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理能夠維持杏果實(shí)較高的SOD、CAT和APX活性，延緩產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升，減輕細(xì)胞膜損傷，延緩果實(shí)冷害。Vali等[19]報(bào)道，采用GABA處理延緩了櫻桃果實(shí)中和H2O2的累積，并且伴隨著SOD、CAT和APX活性的增加，表明GABA可以通過調(diào)節(jié)活性氧清除酶系統(tǒng)活性來延緩櫻桃果實(shí)的冷害。本研究中，對(duì)照組果實(shí)在貯藏期內(nèi)不斷升高的產(chǎn)生速率與SOD活力呈顯著負(fù)相關(guān)，同樣持續(xù)增加的H2O2含量與不斷下降的CAT活力呈顯著負(fù)相關(guān)（圖7A）。PCA結(jié)果表明，在PC1中產(chǎn)生速率和H2O2含量具有較高的正載荷值，SOD和CAT活力具有較高的負(fù)載荷值，并且GABA處理組上述各點(diǎn)的載荷值均低于對(duì)照組（圖7B）。由此可知，冷藏獼猴桃果實(shí)活性氧清除酶（SOD、CAT和APX）活力在果實(shí)快速成熟的0～10 d期間均升高，可能是由于接近完熟時(shí)相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)與蛋白合成增加，以應(yīng)對(duì)較高的活性氧產(chǎn)生速率，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)，減輕細(xì)胞損傷；隨后SOD和CAT活力隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)迅速降低，APX活力在20 d后快速下降，表明活性氧清除酶系統(tǒng)活力下降，活性氧大量積累，細(xì)胞氧化損傷加劇，果實(shí)冷害進(jìn)程加快。與對(duì)照組相比，GABA處理延緩了果實(shí)產(chǎn)生速率和H2O2含量的上升（圖2），并且增大了SOD、CAT和APX的活力（圖3）。由此可推斷，GABA處理可以通過增強(qiáng)冷藏獼猴桃果實(shí)活性氧清除酶系統(tǒng)的能力延緩活性氧積累，從而減輕獼猴桃果實(shí)的冷害癥狀。

AsA和GSH作為采后果實(shí)中的重要抗氧化活性物質(zhì)，在非酶促活性氧清除系統(tǒng)中起著重要的作用[40]。AsA可通過自身還原性或作為電子供體在APX催化下清除H2O2[33,41]，氧化生成MDHA。MDHA可由MDHAR以NADH為電子供體催化還原，重新形成AsA[33]，或進(jìn)一步氧化成脫氫AsA，而后者通過DHAR作用亦可還原為AsA，使AsA再生；DHAR也可將GSH氧化成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），GSSG可由GR催化還原為GSH，構(gòu)成AsA-GSH循環(huán)[42]。此外，GSH自身也可清除活性氧，生成GSSG[29]。采用甘氨酸甜菜堿或NO處理均能通過提高冷藏桃果實(shí)MDHAR、DHAR和GR活性來維持AsA和GSH水平，減少活性氧積累，延緩冷害進(jìn)程[33,43]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組獼猴桃果實(shí)AsA含量在后熟期不斷增加（圖4A），在0～10 d快速升高，并于10～30 d維持在較高水平，APX、MDHAR、DHAR活力分別在0～20 d、0～30 d和0～40 d逐漸增加達(dá)到高峰，隨后逐漸下降（圖3C及圖5B、C）；而GSH含量和GR活力均在0～40 d快速增加，隨后下降（圖4 B、5 A）。相關(guān)性分析表明，對(duì)照組果實(shí)的MDHAR（r＝0.60）和DHAR活力（r＝0.61）在貯藏期內(nèi)與AsA含量呈正相關(guān)，DHAR活力和GSH含量呈顯著正相關(guān)（r＝0.86，P＜0.05），GR活力和GSH含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（圖7A）。PCA結(jié)果表明，在PC2中AsA和GSH含量與MDHAR、DHAR和GR活力都具有較高的正載荷值，其中對(duì)照組和GABA處理組果實(shí)的上述載荷值在貯藏30～40 d時(shí)最高，且GABA處理組的正載荷值均高于對(duì)照組（圖7B）。由此可推斷，在獼猴桃果實(shí)快速后熟期（0～10 d），MDHAR、DHAR和GR活力的快速上升促進(jìn)了AsA和GSH積累，這可能與冷藏初期果實(shí)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)有關(guān)；隨著冷藏的進(jìn)行，MDHAR、DHAR和GR活力在貯藏中期果實(shí)完熟時(shí)（30～40 d）達(dá)到高峰，此時(shí)AsA-GSH循環(huán)的活性氧清除能力最高，以抵御低溫導(dǎo)致的活性氧爆發(fā)；而后隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，AsA和GSH含量以及MDHAR、DHAR和GR活力下降，即AsA-GSH循環(huán)活性氧清除能力降低，致使活性氧加速積累，細(xì)胞膜損傷加劇。GABA處理組果實(shí)相較于對(duì)照組保持了較高的AsA和GSH水平（圖4）以及MDHAR、DHAR和GR活力（圖5），說明GABA處理能夠促進(jìn)AsAGSH循環(huán)運(yùn)行，提升活性氧非酶清除系統(tǒng)的活性，從而減輕冷害。

果實(shí)組織的DPPH自由基清除率和總還原力可用來衡量其抗氧化能力[26]。本研究中，在貯藏期內(nèi)不斷降低的DPPH自由基清除率和總還原力與冷害指數(shù)、細(xì)胞膜透性、產(chǎn)生速率和H2O2含量呈顯著負(fù)相關(guān)（圖7A），與活性氧代謝酶（SOD和CAT）活力呈顯著正相關(guān)（圖7A）。推測(cè)獼猴桃果實(shí)冷害進(jìn)程中，果實(shí)內(nèi)活性氧大量積累，活性氧清除能力降低，導(dǎo)致了組織抗氧化能力減弱。GABA處理能夠使枇杷果實(shí)在冷藏期間維持較高的DPPH自由基清除率和總還原力（圖6），說明GABA處理維持了果實(shí)的抗氧化能力，從而減輕氧化脅迫，延緩細(xì)胞膜損傷，延遲果實(shí)冷害進(jìn)程。