黃閩忠 許黎娟 鄭杰輝 莆田市第一醫(yī)院產(chǎn)前診斷科 (福建 莆田 351100)
內(nèi)容提要:目的:為了提高低比例嵌合體核型分析的性能,研究染色體全自動掃描儀在該方面的作用,從而發(fā)現(xiàn)可改進(jìn)的部分,以提高低比例嵌合體核型檢出率。通過與傳統(tǒng)方法比對,探討染色體全自動掃描儀在低比例嵌合體核型分析中的價值。方法:收集在本院進(jìn)行診斷、咨詢的2000例女性患者作為研究對象,采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組(n=1000)和研究組(n=1000),對照組采用顯微鏡手動分析法,研究組采用染色體全自動掃描儀系統(tǒng)分析法,取外周血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),常規(guī)染色體采用G顯帶技術(shù)核型分析,對照組和研究組均分析計數(shù)30個中期分裂相,分析5個核型,出現(xiàn)異常者則加倍核型分析,計數(shù)100個核型。結(jié)果:通過觀察計數(shù),對照組中,檢查時出現(xiàn)低比例嵌合體5例,檢查低比例嵌合體率為0.5%;研究組中,檢查時出現(xiàn)低比例嵌合體20例,檢查低比例嵌合體率為2%,查出率顯著上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:相比傳統(tǒng)手動核型分析方法,染色體全自動掃描儀在低比例嵌合體核型分析方面,提高了低比例嵌合體核型的檢出率和準(zhǔn)確度,給臨床提供診斷參考,具有較高的應(yīng)用價值。
嵌合體說的是一個胚胎中有兩種或兩種以上遺傳構(gòu)成有差異的細(xì)胞系現(xiàn)象[1],即一個胚胎中存在兩種或兩種以上染色體數(shù)目不同的細(xì)胞群,嵌合占比低的稱低比例嵌合體[2]。嵌合體的形成原因是在有絲分裂期間,染色體不分離從而形成45,X、47,XXX、46,XX三種,末期延遲導(dǎo)致染色體丟失,形成2種配子,分別為45,X、46,XX[3]。嵌合體是一種染色體異常,其形成原因分為兩種類型。首先是同源嵌合體,它是在受精卵形成后的卵裂和胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)突變導(dǎo)致的。這種突變可能會在胚胎發(fā)育的任何階段發(fā)生,從而形成全身性或者組織部分性嵌合體。同源嵌合體可能會受到多種外界因素的影響,例如物理、化學(xué)因素等。而異源嵌合體則通常出現(xiàn)在骨髓移植過程中。在同一個體內(nèi),不同來源的細(xì)胞系會結(jié)合,從而形成異源嵌合體。并且嵌合體患者中異常核型的比例影響著患者的臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度,伴隨著異常核型比例的升高而使患者有更高的風(fēng)險,但也不排除存在與這種情況不一致的現(xiàn)象。通常情況下,在顯微鏡下人工對染色體中期分裂相進(jìn)行查找是一項極其費時費力的工作,而且由于長時間的觀察容易導(dǎo)致視覺疲勞,忽略掉一些不太明顯的異常核型,從而造成人為的觀察結(jié)果出錯而導(dǎo)致錯誤的診斷。因此,染色體全自動掃描儀正是對焦這一問題實現(xiàn)其工作性能的,它結(jié)合了顯微鏡、全自動掃描、圖像、核型分析和計算機(jī)等多種技術(shù)[4],工作模式、操作管理和質(zhì)量控制使其得到廣泛應(yīng)用。本文探討染色體全自動掃描儀在低比例嵌合體核型分析中的應(yīng)用價值。
收集2016年11月~2021年1月在本院進(jìn)行診斷、咨詢的2000例女性患者作為研究對象,其有不良生育史或者原發(fā)性、繼發(fā)性不孕癥等,年齡25~45歲,平均(33.87±5.34)歲,采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組和研究組。對照組中有1000例,年齡26~44歲,平均(34.19±5.37)歲。研究組中有1000例,年齡25~44歲,平均(33.55±5.19)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并通過,且患者及其家屬均簽署知情同意書。研究組和對照組的年齡等基本資料經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較無顯著差異性(P>0.05),結(jié)果具有可比性。
納入標(biāo)準(zhǔn):①成年女性;②沒有溝通障礙及智力障礙;③資料信息完全;④知道研究具體情況且簽署知情同意書,在專業(yè)人員指導(dǎo)下積極配合研究。
排除標(biāo)準(zhǔn):①女性或其配偶存在染色體異常;②具有不良孕產(chǎn)史等;③有精神病或有精神病家族史。
染色體檢查方法為取女性患者外周血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),放入溫度為37°C、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6d或者7d,期間連續(xù)觀察細(xì)胞生長狀況,并且及時換液,當(dāng)出現(xiàn)許多個克隆的圓形細(xì)胞時加入秋水仙素,然后再培養(yǎng)3h左右,進(jìn)而收獲制片,常規(guī)染色體采用G顯帶技術(shù)核型分析。對照組和研究組都分析計數(shù)30個中期分裂相,分析5個核型,出現(xiàn)異常者則加倍核型分析,計數(shù)100個核型。
對照組采用顯微鏡手動分析法,即標(biāo)本經(jīng)過培養(yǎng)、收獲、制片、顯帶后,在顯微鏡下使用傳統(tǒng)核型分析方法進(jìn)行核型分析和核型計數(shù)。
研究組采用染色體全自動掃描儀系統(tǒng)分析法,標(biāo)本經(jīng)過培養(yǎng)、收獲、制片、顯帶后,將其放入掃描儀中進(jìn)行掃描,由系統(tǒng)里的分析軟件自動分析核型,結(jié)果顯示在電腦上,分析軟件與自動掃描平臺配置使用,設(shè)定掃描2張片子,每個片子上有100個中期分裂相,自動掃描儀系統(tǒng)中的中期分裂相選擇分析具有條件穩(wěn)定、要求標(biāo)準(zhǔn)化的特點。
觀察統(tǒng)計嵌合體的數(shù)量,包括47,XXX和45,X和46,XX。通常,對30例染色體進(jìn)行了普通計數(shù),5例進(jìn)行了核型分析。如果出現(xiàn)下列情況,當(dāng)清點計數(shù)時,只有一種染色體是45,X或47,XXX,則需要增加數(shù)量到100種染色體核型。加二減三原則的含義是:100個核型中同一染色體缺少1條,且有3個或3個以上的核型;或者說是,100個核型中同一染色體上多出1條,且有2個或2個以上的核型,那就屬于嵌合體。認(rèn)為<10%的可能是低比例嵌合體。
采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以[n(%)]形式顯示,再行檢驗獲得統(tǒng)計值。P<0.05為組間數(shù)據(jù)對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
使用顯微鏡手動分析法對1000例女性患者進(jìn)行染色體核型檢查,檢查時出現(xiàn)低比例嵌合體5例,檢查低比例嵌合體率為0.5%。使用染色體全自動掃描儀系統(tǒng)分析法對1000例女性患者進(jìn)行染色體核型檢查,檢查時出現(xiàn)低比例嵌合體20例,檢查低比例嵌合體率為2%。兩組的低比例嵌合體查出率之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.114,P=0.003),研究組中檢查出嵌合體的數(shù)量顯著高于對照組中的數(shù)量,查出率明顯上升。說明染色體全自動掃描儀提高了低比例嵌合體的查出率。染色體全自動掃描儀分析100個核型中發(fā)現(xiàn)45,X的核型有4個,并且保證了顯微鏡下中期分裂相四周不存在其他核型染色體,見表1。
表1 兩組低比例嵌合體的檢出情況
在胚胎發(fā)育過程中,在胚胎發(fā)生過程中,或在胚胎成熟后24h以內(nèi),均可產(chǎn)生畸形的染色體。在2~4d(分裂和胚胎階段),嵌合產(chǎn)物的數(shù)量會發(fā)生變化。在3個胚胎細(xì)胞中,其中一個胚胎細(xì)胞中的一種細(xì)胞發(fā)生了染色體的改變,從而造成了胚胎細(xì)胞所形成的細(xì)胞和細(xì)胞功能的改變[5]。在不同的組織和器官中,如果出現(xiàn)了一些有缺陷的染色體嵌合體,那么通過外周血液的檢測是很難檢測到的。在進(jìn)行染色體核型分析的時候,偶爾會遇到1個核型是45,X的情況,在使用顯微鏡分析的時候,通常的方法是增加計數(shù),然后在鏡面下手動找核型。但是,在選擇的時候,并沒有固定的標(biāo)準(zhǔn),而且很困難。通常,當(dāng)數(shù)到30~50個核型時,大概率就不想再繼續(xù)進(jìn)行了。因此,大部分的人都會覺得,在采集制作過程中會出現(xiàn)缺失,用這樣的傳統(tǒng)人工核型分析和計數(shù)的方法,即使能夠勉強(qiáng)計數(shù)到100個核型,也有可能會遺漏一些異常核型,從而造成低比例嵌合體核型的查出率下降。
自從出現(xiàn)染色體全自動掃描儀后,上述問題便開始得到解決,隨著技術(shù)的改善和性能的優(yōu)化,全自動掃描儀得到廣泛的應(yīng)用[6-9],以便于對異常染色體的識別和分析判斷?,F(xiàn)下,一直在對染色體全自動掃描儀內(nèi)部的部件進(jìn)行升級,使準(zhǔn)確度能夠達(dá)到更高[10]。掃描儀系統(tǒng)組成和配置包括顯微鏡部分、掃描系統(tǒng)主機(jī)部分、核型分析終端部分和黑白激光打印機(jī),它內(nèi)嵌有一套標(biāo)準(zhǔn)化的中期分裂相選擇功能,掃描拍攝的用于核型分析的片子數(shù)量可自行確定,一般給一個患者掃描2~3張片子,再由系統(tǒng)選擇清晰、分散性好的染色體中期分裂相,如圖1所示。本文分析5個,計數(shù)30個核型,如果出現(xiàn)異常就計數(shù)100個核型。分裂相會非常清晰地顯示在電腦屏幕上,可以打印報告。
圖1.染色體中期分裂相圖
周靜等[11]研究報道,在羊水細(xì)胞性染色體嵌合產(chǎn)前診斷中,傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)的檢測結(jié)果并不準(zhǔn)確,會丟失異常類型的獲得數(shù)據(jù),因此需要選擇更精準(zhǔn)的分析技術(shù),綜合分析以提供更準(zhǔn)確的臨床信息,指導(dǎo)產(chǎn)前診斷和臨床咨詢。也有研究表明[12],對于淋巴細(xì)胞微核試驗中,對比全自動染色體掃描儀和傳統(tǒng)手動收獲淋巴細(xì)胞,結(jié)果顯示,使用前者方法得到的微核率、微核細(xì)胞率和微核陽性率均優(yōu)于后者,因此,認(rèn)為使用全自動染色體掃描儀不僅可以減輕實驗室人員的工作量,還可以提高淋巴細(xì)胞微核的檢出率。
本研究中,使用兩種方法進(jìn)行低比例嵌合體核型分析,對照組采用顯微鏡手動分析法,研究組采用染色體全自動掃描儀系統(tǒng)分析法,從實驗結(jié)果上看,對照組檢查出的嵌合體例數(shù)為5,研究組檢查出的嵌合體例數(shù)為20,嵌合體檢出率明顯上升,P<0.05,兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這是因為,傳統(tǒng)顯微鏡核型分析完全是手工操作的,在自身顯微鏡下進(jìn)行分裂相分析時,一般選擇具有比較完整特征的核型分析,會忽略不太明顯的異常核型,因此很難發(fā)現(xiàn)比例較低的嵌合體。而染色體全自動掃描系統(tǒng)內(nèi)部有一套完善的標(biāo)準(zhǔn)化的識別和判斷中期分裂相的功能,在超大工作量的同時,工作效率也不會降低,提高了低比例嵌合體核型的查出率。
綜上所述,染色體全自動掃描儀在低比例嵌合體核型分析方面,提高了低比例嵌合體的檢出率,彌補(bǔ)了人工分析的不足,為臨床提供低比例嵌合體診斷的參考依據(jù),具有較高的應(yīng)用價值。盡管有嵌合體形成的人群不一定會出現(xiàn)癥狀,但這種遺傳物質(zhì)的存在可能會影響生育。它可能會導(dǎo)致胎兒畸形或者胚胎停止發(fā)育的幾率增加。所以在必要時,應(yīng)該進(jìn)行胚胎染色體檢查,以保證胚胎的健康。