楊全偉,黃文濤,陳一璇,胡松

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430022)

神經(jīng)元丟失是多種神經(jīng)退行性疾病的主要誘發(fā)原因。神經(jīng)損傷的臨床表現(xiàn)主要為記憶缺陷、震顫麻痹、舞蹈癥狀及肌肉萎縮等功能性障礙等,從而影響記憶、運(yùn)動(dòng)、思考、交流、吞咽和呼吸等功能。目前,減少或控制神經(jīng)元損傷或丟失的方法或藥物仍然有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

現(xiàn)已證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件,由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激常導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)或錯(cuò)誤折疊蛋白的蓄積,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá),如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激球蛋白結(jié)合蛋白(globulin-binding protein,BIP)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶12(csyteine aspartic acic specific protease,Caspase-12)。一方面,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)將信號(hào)逆向傳入細(xì)胞核,產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄調(diào)控,保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的損傷[1];另一方面,長(zhǎng)期高強(qiáng)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生[2],引起抗凋亡B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)與凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)比值改變。

芹菜素(apigenin,Api)又稱芹黃素、洋芹素,是一種黃酮類(lèi)單體化合物,存在于多種果蔬(蘋(píng)果及芹菜等),尤以芹菜中含量最高。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),芹菜素具有多種生物學(xué)活性,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用,也可用于治療老年癡呆、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病[3]。雖然目前有文獻(xiàn)報(bào)道芹菜素可以通過(guò)抗氧化作用阻止1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(human neuroblastoma,SH-SY5Y)凋亡發(fā)生[4],防治帕金森病,但大部分研究集中于抗腫瘤領(lǐng)域,對(duì)芹菜素是否能抑制神經(jīng)元丟失、尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生筆者未見(jiàn)報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)以毒胡蘿卜素(thapsigargin,TG)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,探討芹菜素逆轉(zhuǎn)TG所致SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 BIP、CHOP、Bcl-2、Caspase-12、β激動(dòng)蛋白(β-actin)、Bax 均購(gòu)于武漢愛(ài)博泰克(ABclonal)生物科技有限公司,批號(hào)分別為A0241、A0221、A0209、A0217、AC026及A19684;芹菜素(含量≥98%)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA,含量≥98%)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技有限公司,批號(hào)分別為A106676、#F1828076;TG購(gòu)于默克中國(guó)有限公司(批號(hào):67526-95-8,含量≥98%);改良Eagle(Dulbecco's modification of Eagle's medium,DMEM)培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)HyClone公司(批號(hào):D5671);胎牛血清購(gòu)于Gibco公司(批號(hào):10099);二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)測(cè)定蛋白定量試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司,批號(hào)分別為2021-A、40210ES10;強(qiáng)裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)購(gòu)于杭州弗德生物科技有限公司(批號(hào):FD008);SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)于武漢谷歌生物有限公司,鑒定報(bào)告由武漢谷歌生物有限公司提供。

1.2儀器 水平搖床(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司,型號(hào):TS-1);細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司,型號(hào):360);電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司,型號(hào):165-8004);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司,型號(hào):SW-CT-2D);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司,型號(hào):Synergy-2);化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,型號(hào):ChemiDoTMXRS+)。

1.3細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、青霉素(100 U·mL-1)和鏈霉素(100 mg·mL-1)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,培養(yǎng)條件:37 ℃,5%二氧化碳(CO2),恒溫恒濕。隔天換培養(yǎng)基1次,細(xì)胞融合度達(dá)到80%傳代,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 以TG制備內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型,研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致內(nèi)源性凋亡途徑,如濃度和時(shí)間依賴性TG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物BIP顯著增加,則判定為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激造模成功。實(shí)驗(yàn)分組[5]:對(duì)照組(CON組,2%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基)、TG組(以2%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基配制TG)、TG+芹菜素組(以2%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基配制TG與芹菜素)。

為考察TG造模最佳濃度與時(shí)間,設(shè)置TG濃度梯度為0.5、1.0、2.0、3.0 μmol·L-1;TG處理細(xì)胞時(shí)間分別為4、6、8、10 h。另外,當(dāng)細(xì)胞貼壁密度達(dá)80%時(shí),設(shè)置預(yù)防性給予芹菜素濃度分別為10、20、30 μmol·L-1,檢測(cè)細(xì)胞活力,觀察芹菜素在TG所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的作用。用2%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基配制4-丁苯酸(PBA)濃度為1.5 mmol·L-1溶液,-4 ℃保存?zhèn)溆谩BA是內(nèi)質(zhì)保護(hù)劑,可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性[6]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)·mL-1,每孔100 μL接種于96孔板,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)約24 h,按照“1.4節(jié)”分組方法給藥,給藥完成后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中給藥2 h,酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%。A(加藥)、A(空白)及A(0加藥):參照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)方法,按是否含有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液,測(cè)定A值。

1.6蛋白免疫印跡法(western blotting,WB)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白及凋亡蛋白表達(dá)[4]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)·mL-1,接種于6孔板,37 ℃、5%CO2條件下,過(guò)夜培養(yǎng)12～14 h后,待次日細(xì)胞密度為70%～80%時(shí),給予10 μmol·L-1芹菜素預(yù)處理1 h;隨后,1.0 μmol·L-1TG給藥10 h。收集細(xì)胞,PBS洗3次,加入RIPA,冰浴裂解15 min,收集細(xì)胞裂解液于1.5 mL離心管內(nèi);12 000 r·min-1離心10 min(r=6 cm),取上清液,采用BCA蛋白定量檢測(cè)法,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)562 nm條件下測(cè)定蛋白含量。定量后的蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白電泳,蛋白上樣量10～20 μg。電泳條件起始電壓60 V,到達(dá)分離膠后調(diào)整為120 V。轉(zhuǎn)膜條件為聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜恒流(電流300 mA)轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h,4 ℃過(guò)夜,給藥一抗BIP(1：1000)、CHOP(1：1 000)、Bcl-2(1：1 000)、CASPASE-12(1：1 000)、Bax(1：1 000)以及β-actin(1：5 000)蛋白,TBST緩沖液洗3次,給藥二抗,ECL化學(xué)發(fā)光顯影,化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分別檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1芹菜素對(duì)TG誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 結(jié)果顯示,與CON組比較,隨著TG濃度增加,SH-SY5Y細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降(P<0.01),當(dāng)TG濃度>1.0 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞活力未見(jiàn)明顯改變,故選擇TG濃度1.0 μmol·L-1作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的造模濃度。TG時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與CON組比較,隨著TG處理時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.01)。TG處理10 h后,細(xì)胞活性降至最低。因此,選擇TG給藥時(shí)間為10 h。分別給予10、20、30 μmol·L-1芹菜素預(yù)處理細(xì)胞1 h,給予1.0 μmol·L-1TG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下,確定10 μmol·L-1芹菜素預(yù)處理可明顯改善細(xì)胞活力(P<0.01)。因此本實(shí)驗(yàn)選擇芹菜素預(yù)處理濃度為10 μmol·L-1,結(jié)果見(jiàn)圖1。

①與CON組比較,t=5.31～7.14,P<0.01;②與CON組比較,t=3.13～9.62,P<0.01 ;③與TG組比較,t=0.39～6.47,P<0.01。圖1 芹菜素對(duì)TG誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響 ① Compared with CON group,t=5.31-7.14,P<0.01;② Compared with CON group,t=3.13-9.62,P<0.01;③ Compared with TG group,t=0.39-6.47,P<0.01.Fig.1 Effect of apigenin on the viability of SH-SY5Y cells induced by TG

2.2芹菜素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP表達(dá)的影響 與CON組比較,TG組BIP表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01);與TG組比較,芹菜素預(yù)處理組BIP表達(dá)降低(P<0.05),TG+PBA組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被明顯抑制(P<0.05),見(jiàn)圖2。

①與CON組比較,t=5.25,P<0.01;②與TG組比較,t=3.81,2.397,P<0.05。圖2 芹菜素對(duì)BIP蛋白表達(dá)的影響① Compared with CON group,t=5.25,P<0.01;② Compared with TG group,t=3.81,2.397,P<0.05.Fig.2 Effect of apigenin on BIP protein

2.3芹菜素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白CHOP表達(dá)的影響 WB結(jié)果顯示,與CON組比較,TG組CHOP蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.01);與TG組比較,TG+芹菜素組CHOP表達(dá)顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖3。

①與CON組比較,t=9.43,P<0.01;②與TG組比較,t=4.61,P<0.05。圖3 芹菜素對(duì)CHOP蛋白表達(dá)的影響① Compared with CON group,t=9.43,P<0.01;②Compared with TG group,t=4.61,P<0.05.Fig.3 Effect of apigenin on CHOP protein

2.4芹菜素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Caspase-12蛋白表達(dá)的影響 與CON組比較,TG組Caspase-12蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05);與TG組比較,TG+芹菜素組表達(dá)趨勢(shì)降低(P<0.05),見(jiàn)圖4。

①與CON組比較,t=3.02,P<0.05;②與TG組比較,t=4.56,P<0.05。圖4 芹菜素對(duì)Caspase-12蛋白的影響①Compared with CON group,t=3.02,P<0.05;②Compared with TG group,t=4.56,P<0.05.Fig.4 Effect of apigenin on Caspase-12 protein

2.5芹菜素對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響 與CON組比較,TG組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減少 (P<0.05),促凋亡蛋白Bax表達(dá)增多,Bcl-2/Bax比值顯著下降(P<0.05)。與TG組比較,TG+芹菜素組Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),Bax表達(dá)也有下調(diào)趨勢(shì),Bcl-2/Bax比值顯著增加 (P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖5。

①與CON組比較,t=3.31～5.67,P <0.05;②與TG組比較,t=2.84～5.16,P<0.05。圖5 芹菜素對(duì)BCL2/BAX蛋白表達(dá)的影響① Compared with CON group,t=3.31-5.67,P<0.05;② Compared with TG group,t=2.84-5.16,P<0.05.Fig.5 Effect of apigenin on BCL2/BAX protein

3 討論

神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生機(jī)制包括活性氧生成、線粒體功能障礙、炎癥、折疊蛋白積累和泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能障礙等。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成和折疊的場(chǎng)所,其錯(cuò)誤折疊或合成障礙將誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為了克服內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,細(xì)胞內(nèi)形成一套特定的信號(hào)處理通路,稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路[7]。BIP作為分子伴侶蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的主要調(diào)控因子,利用細(xì)胞降解機(jī)制使未折疊的蛋白質(zhì)重新折疊或降解。研究發(fā)現(xiàn),包括PERK/Caspase-12激酶通路和ATF6/CHOP通路等都參與BIP介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[8]。隨著高強(qiáng)度或長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡發(fā)生,在此過(guò)程中,細(xì)胞調(diào)動(dòng)一系列精確機(jī)制,來(lái)保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和組裝的動(dòng)態(tài)平衡[9]。

文獻(xiàn)[10]報(bào)道,SH-SY5Y細(xì)胞系作為神經(jīng)退行性疾病研究的常用細(xì)胞系,主要用于研究帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制。本研究顯示,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG(1.0 μmol·L-1)處理時(shí)間為10 h時(shí),SH-SY5Y細(xì)胞活力顯著下降,而1.0 μmol·L-1芹菜素預(yù)處理1 h可恢復(fù)TG所致SH-SY5Y細(xì)胞活力下降,起到保護(hù)作用。此外,還發(fā)現(xiàn)TG可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP、CHOP、Caspase-12表達(dá)增多,Bcl-2表達(dá)明顯降低,而B(niǎo)ax表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。研究證實(shí),TG可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并引起細(xì)胞凋亡。

前期研究認(rèn)為,芹菜素可以抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡發(fā)生[11],淀粉樣蛋白也可以作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑,用于各種神經(jīng)元細(xì)胞模型。筆者發(fā)現(xiàn),在TG誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中,芹菜素預(yù)處理組可以明顯逆轉(zhuǎn)BIP、CHOP、Caspase-12、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bcl-2/Bax比值,但對(duì)Bax的作用不明顯。提示芹菜素可能通過(guò)抑制TG所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生,阻止細(xì)胞凋亡,從而抑制神經(jīng)細(xì)胞損傷。然而,芹菜素抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的具體分子機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究。

綜上所述,芹菜素能夠逆轉(zhuǎn)TG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致細(xì)胞活力改變,并抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。本研究為芹菜素治療神經(jīng)退行性疾病提供了實(shí)驗(yàn)參考。