茍歡,劉嶸,熊微,施春陽,方建國,王文清

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院 1.藥學部;2.婦科,武漢 430030)

二黃栓由雄黃、黃連等藥味組成,臨床用于治療高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染的子宮頸炎癥及子宮頸上皮內瘤樣病變Ⅰ級[1]。筆者在本研究采用適宜的制劑技術開發(fā)其栓劑,按中藥新藥分類本品為在研1.1類新藥。通過熱融法使藥物以無定形態(tài)均勻分散在基質中,形成栓劑,在腔道經黏膜吸收,可規(guī)避藥物首關效應,維持血藥濃度穩(wěn)定,獲得更優(yōu)藥效。通過考察不同基質類型和制備條件對制備工藝的影響,經G1-熵權法結合正交實驗設計建立二黃栓的制備工藝,并利用雄黃與其他原輔料理化性質差異考察不同前處理方法對二黃栓中二硫化二砷(As2S2)含量測定的影響,建立了碘量法和原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrometry,AAS)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AA-6300C原子吸收分光光度儀(日本島津公司);HL-1型砷空心陰極燈(河北寧強光源有限公司);HeraeusMultifuge X1R離心機(賽默飛世爾科技公司);AUW220D分析天平(日本島津公司,感量:0.01 mg);RB-1融變時限測試儀(天津市國銘醫(yī)藥設備有限公司);JHH-6數顯恒溫水浴鍋(金壇市精達儀器制造有限公司)。

1.2試藥 砷元素標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心,批號:223004-6,1 000 μg·mL-1);二黃栓(自制,批號:20220212,20220314,20220510,20221109,20221221),水飛雄黃粉(湖南柳城中藥飲片有限公司,批號:210105),其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1評價指標賦權

2.1.2熵權法 熵權法是根據各項指標值的離散程度確定權重,避免了人為因素帶來的偏差,能更好地解釋所得結果,計算過程參考柯寄明等[4-5]所用方法,得客觀權重w2。

2.2二黃栓的制備工藝

2.2.1二黃栓的基質處方優(yōu)化 由于基質類型及用量對栓劑的成型工藝具有較大影響,因此考察了36型混合脂肪酸甘油酯(油脂性)、硬脂酸聚烴氧(40)酯(水油兼容性)、甘油明膠(水溶性)3種類型及其用量(每粒0.66、0.99、1.32 g)對二黃栓成型工藝的影響。通過設計L9(34)正交實驗,采用 G1-熵權法對外觀性狀、質量差異和融變時限進行綜合評分,按“2.1節(jié)”下計算得各評價指標的權重值,見表1。

表1 基質處方優(yōu)化評價指標的權重值Tab.1 Weight values of matrix prescription optimization evaluation indexes

由表2可知,基質類型對栓劑制備工藝的影響程度大于基質用量,其中A1>A2>A3,B2>B1>B3,根據表3可得,僅基質類型對成型工藝有顯著影響,結合直觀和方差分析結果,選用最佳基質為混合脂肪酸甘油酯,用量為每粒0.99 g,與藥味總量配比為3：1。

表2 二黃栓基質處方優(yōu)化L9(34)正交實驗結果Tab.2 L9(34)orthogonal results of matrix formulation optimization for Erhuang suppository

表3 基質處方優(yōu)化方差分析表Tab.3 Results of variance analysis of matrix formulation optimization

2.2.2二黃栓的制備條件優(yōu)化 考察基質熔融溫度、攪拌時間、注模溫度對制備工藝的影響,通過設計L9(34)正交實驗,采用G1-熵權法對外觀性狀、質量差異和融變時限進行綜合評分,結果見表4—6。

表4 制備工藝評價指標的權重值Tab.4 Weight values of preparation process evaluation indexes

由表5可知,各因素對栓劑制備工藝影響程度:基質熔融溫度>攪拌時間>注模溫度,其中A2>A1>A3,B2>B3>B1,C3>C1>C2;由表6可得,3個因素對制備工藝均無顯著影響。結合直觀和方差分析結果,最終優(yōu)選制備條件為A2B2C3。即基質置60 ℃水浴至熔融狀態(tài),再按處方比例加入各藥粉攪拌20 min至溶液均勻,50 ℃灌注,冷卻成型,即得。

表5 二黃栓制備工藝的L9(34)正交實驗結果Tab.5 L9(34)orthogonal results of preparation process for Erhuang suppository

表6 制備工藝的方差分析Tab.6 Results of variance analysis of preparation process

2.3工藝驗證 根據最佳制備工藝,按處方比例稱取并制備二黃栓3批。最終栓劑的各指標等均符合《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定,表明該制備工藝穩(wěn)定、重現性好,可進行大規(guī)模生產。

2.4不同前處理方法測定二黃栓中As2S2的含量 碘量法測定中成藥中礦物藥時,取樣量、試劑用量及滴定液用量等因素直接影響滴定結果的準確性。通過高效的前處理方法除去基質等物質后可減小消解試劑用量,減小干擾,并增大滴定液用量,減小誤差,是消解法與碘量法結合測定的關鍵點。根據雄黃和其他原輔料的理化性質差異,選擇下列方法進行考察,按“2.5.2”和“2.6.3”方法測定含量,結果見表7。

表7 不同前處理方法對二黃栓含量測定的影響Tab.7 Effect of different pretreatment methods on content determination of Erhuang suppository

由表7可知,碘量法測定時,直接消解處理耗時長效率低。因雄黃粉易吸附管壁,經離心和過濾處理后含量偏低,以上3種方法不適于本栓制備。結果表明經水和正丁醇除雜富集后進行消解為碘量法最佳前處理方法,該方法進行優(yōu)化后最終條件為水和正丁醇的比例為1：3、水浴溫度為80 ℃、消解液用量為16 mL。AAS測定時,采用直接消解法和萃取-消解法測得As2S2含量較高,前者取樣量減少時,消解時間可縮短,步驟簡單,操作方便,因此選擇直接消解。

2.5碘量法測定As2S2含量方法學考察

2.5.1對照品貯備液 取雄黃對照品(本課題組精制,經碘量法測定As2S2含量為99.38%)約1.25 g,精密稱定,置凱式定氮瓶,按“2.5.2節(jié)”方法,定容至250 mL,得As2S2含量為5.00 mg·mL-1對照品貯備液。

2.5.2供試品溶液 取二黃栓5粒,切碎,混勻,取約1.5 g,精密稱定,置錐形瓶,加正丁醇30 mL和水10 mL,80 ℃水浴加熱至全部融化,振搖,靜置,趁熱除去正丁醇層液體,蒸干水層液,加硫酸鉀2 g、硫酸銨5 g與硫酸20 mL,后續(xù)照《中華人民共和國藥典》(2020年版)一部雄黃含量測定[6]項下進行,即得供試品溶液。采用碘滴定液進行滴定,每毫升碘滴定液(0.05 mol·L-1)相當于As2S25.348 mg[6]。

2.5.3專屬性考察 取處方中除雄黃外的其他藥味制備陰性樣品,按“2.5.2節(jié)”方法測定,結果碘滴定液消耗2滴,表明樣品中其他藥材對測定無干擾。

2.5.4線性關系考察 分別精密吸取對照品貯備液12、18、24、30、36、42、50 mL,加水稀釋至100 mL,測定As2S2含量。以As2S2取樣量為橫坐標(X,mg),以碘滴定液(0.05 mol·L-1)消耗體積為縱坐標(Y,mL)。結果表明As2S2取樣量在59.88～249.48 mg范圍內與碘滴定液消耗體積(mL)呈良好的線性關系,回歸方程Y=0.187 0X+0.527 5,r=0.999 0。

2.5.5穩(wěn)定性實驗 取二黃栓約1.5 g,精密稱定,按“2.5.2節(jié)”方法處理并于0、2、4、8、12 h測定As2S2含量,結果RSD為2.32%(n=5),表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.5.6重復性實驗 取二黃栓約1.5 g,精密稱定,共6份,按“2.5.2節(jié)”方法測定含量,結果As2S2平均含量為65.58 mg·g-1,RSD為1.26%,表明該方法的重復性良好。

2.5.7加樣回收率實驗 取已知As2S2含量的二黃栓約0.75 g,精密稱定,共6份,精密加入雄黃對照品60 mg,按“2.5.2節(jié)”方法處理后測定含量,結果平均加樣回收率為101.48%,RSD為1.16%(n=6)。

2.6AAS測定As2S2含量方法學考察

2.6.1儀器條件 采用火焰原子化器,氘燈扣除背景,以乙炔為燃氣、空氣為助燃氣進行測定。元素:As,波長193.7 nm,燈電流10 mA,狹縫0.7 nm,燃氣流量2.2 L·min-1,燃燒頭高度5 mm,霧化器提升時間3 s,積分時間5 s。

2.6.2標準溶液 精密吸取1 000 μg·mL-1砷標準溶液2、4、6、8、10 mL,分置100 mL量瓶,用空白溶液(2%硝酸溶液)稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.6.3供試品溶液 取二黃栓5粒,切碎,混勻,取約0.25 g,精密稱定,置錐形瓶,加硫酸鉀1 g、硫酸銨2 g與硫酸8 mL,消解,放冷,置200 mL量瓶中并用水稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.6.4專屬性考察 取空白溶液和陰性樣品溶液,按“2.6.1節(jié)”條件測定吸光度,結果吸光度為供試品溶液的1.50%,表明其對測定無干擾。

2.6.5線性關系考察 取濃度分別為20、40、60、80、100 μg·mL-1的砷標準溶液,按“2.6.1節(jié)”條件測定吸光度,以砷元素濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標,以吸光度(Y)為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程為:Y=6.353 0×10-3X+0.055 8,r=0.998 6。結果表明砷元素的濃度在20～100 μg·mL-1范圍內與吸光度的線性關系良好。

2.6.6儀器精密度實驗 取砷標準溶液(60 μg·mL-1),按“2.6.1節(jié)”條件連續(xù)測定6次,結果RSD為3.17%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.6.7穩(wěn)定性實驗 取二黃栓約0.25 g,精密稱定,按“2.6.3節(jié)”方法處理并分別于0、2、4、8、12 h測定吸光度,結果RSD為3.66%(n=5),表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.6.8重復性實驗 取二黃栓約0.25 g,精密稱定,共6份,按“2.6.3節(jié)”方法處理后測定吸光度,結果As2S2平均含量為66.09 mg·g-1,RSD為2.91%(n=6),表明該方法重復性良好。

2.6.9加樣回收率實驗 取二黃栓約0.125 g,精密稱定,共9份,分別精密加入砷標準溶液4.8、6.0、7.2 mL(相當于樣品中砷含量的80%、100%、120%),各3份,按“2.6.3節(jié)”方法處理后測定吸光度,結果平均加樣回收率為99.31%～105.20%,RSD<3.05%(n=9)。

2.7樣品測定結果的比較 取樣品5批,分別采用碘量法和AAS測定,AAS測定的砷含量通過As與As2S2的分子量轉換計算得As2S2含量。對兩種測定方法結果進行t檢驗,結果表明差異無統(tǒng)計學意義,見表8。

表8 5批樣品測定結果Tab.8 Determination results of five batches of samples n=2,mg·g-1

3 討論

3.1指標賦權與評價方法 在多指標綜合評價中賦權方法和各指標權重最為重要。目前栓劑多采用主觀賦權評價制備工藝,根據評價指標重要程度主觀給予權重,可能造成權重分配不合理或與實際差異過大,最終結果缺乏準確性。通過G1法主觀賦權快速計算,無需一致性檢驗,再結合熵權法進行客觀賦權,可靠性和準確性更強[4]。本研究采用G1-熵權法組合賦權方法對栓劑制備工藝進行評價,不局限于主觀評價,可同時兼顧決策者的主觀性和待評價各指標的客觀聯系,使二黃栓制備工藝的綜合評價結果更加科學準確。

3.2不同基質材料對二黃栓制備工藝的影響 栓劑基質有油脂性基質包括天然的脂肪酸和合成脂肪酸酯等,水溶性基質包括聚氧乙烯、甘油明膠、泊洛沙姆和聚乙二醇類等[7]。本研究選擇幾種類型中具有代表性的常用基質進行考察。在篩選基質時發(fā)現水溶性基質甘油明膠不適于本栓的制備,處方中的白礬遇水會產生氫氧化鋁吸附膠體粒子,導致整體凝固,無法灌裝。因此在考察基質時含白礬等栓劑應注意藥物與水溶性基質是否會發(fā)生反應。水油兼容性基質硬脂酸聚烴氧(40)酯熔化時產生小氣泡,在栓劑中形成氣孔,造成質量差異較大。最終優(yōu)選混合脂肪酸甘油酯為基質,用量為每粒0.99 g,與藥味總量配比為3：1。

3.3不同制備條件對二黃栓制備工藝的影響 基質熔融溫度、攪拌時間等諸多因素影響栓劑的制備工藝?；|熔融溫度影響溶液流動性和混合均勻度等,熔融溫度過低,溶液流動性低,藥粉不易分散,造成有效成分不均勻;熔融溫度過高,與注模溫度溫差過大,冷卻時間太長,影響制備效率。攪拌時間過短,藥粉混合不均勻,外觀色澤不均一。注模溫度對灌裝成型有直接影響,溫度過高,灌注后冷卻時間較長,雄黃容易沉降,導致溶液分層,造成含量不均勻;溫度過低,灌注時容易造成栓劑中空或者殘缺,不合格產品增多[8]。通過考察不同制備條件對二黃栓制備工藝的影響,得最佳制備工藝,對二黃栓的工業(yè)化生產具有較好的實際應用價值,并為同類栓劑的制備提供參考。

3.4不同前處理方法對砷含量測定的影響 目前砷含量測定方法主要有電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[9-10]、AAS[11-13]、碘量法[14]等。ICP-MS檢出限低,精密度好,能同時測定多元素,但當樣品中砷含量較高時,容易污染儀器,昂貴的價格也影響了其通用性[9]。AAS專屬性強,靈敏度高,選用火焰原子化器測定,操作步驟簡單,滿足實驗需求[13]。滴定分析法靈敏度比AAS低,但因具有準確、快捷、節(jié)約等優(yōu)點使其成為檢測分析領域的經典方法,常用于礦物藥的含量測定[15]。《中華人民共和國藥典》(2020年版)一部采用經典的分析方法碘量法對雄黃中As2S2進行含量測定[6]。本研究采用碘量法和AAS測定樣品,結果表明無顯著性差異,說明兩種方法均適用于本栓中As2S2的含量測定。根據不同檢測方法結合特定的前處理方法,使其含量測定更具準確性和科學性,為中成藥中礦物藥的含量測定提供借鑒。