郭 鑫,夏子怡,吳 波,夏廣清*,臧 皓*
魚鰾是多數(shù)硬骨魚類具有的一種呼吸輔助器官[1].魚鰾可分為新鮮魚膠和干制魚膠,干制后呈現(xiàn)淡黃色、角質(zhì)狀[2],常用于緩解腎虛滑精等癥狀[3].魚鰾的化學(xué)成分包括粘性蛋白、礦物質(zhì)和維生素等,其中蛋白含量高達(dá)79%[4].目前,魚鰾作為魚類產(chǎn)品生產(chǎn)中的附屬品,其功能性并未得到高度重視,導(dǎo)致魚鰾的利用率較低.
蛋白質(zhì)和多肽在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要作用,可調(diào)節(jié)生理功能,包括清除體內(nèi)自由基,調(diào)節(jié)身體亞健康等多種癥狀[5-6].董倍余等[7]采用水酶法制備鯽魚多肽,該多肽具有較強(qiáng)清除DPPH 自由基的能力.周勰等[8]采用水酶法制備烏賊纏卵腺多肽,結(jié)果顯示該多肽對(duì)羥自由基等具有良好的清除能力且呈現(xiàn)劑量依賴性.張麗娜等[9]發(fā)現(xiàn)魚籽多肽可通過(guò)清除ROS 降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,進(jìn)而提高抗氧化能力.多數(shù)研究表明,動(dòng)物類多肽具有較好的抗氧化活性且和相對(duì)應(yīng)的提取工藝有關(guān).因此,本文對(duì)魚鰾多肽的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,以期為進(jìn)一步的活性評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ).海洋類動(dòng)物的蛋白與多肽大部分具有用藥劑量小、效果好等優(yōu)點(diǎn)[10-11],因此具有較廣闊的發(fā)展前景.本研究采用水酶法進(jìn)行提取,參照小球藻多肽的方法[12],優(yōu)化了提取魚鰾多肽的工藝.
干燥魚鰾,通化皇嘉鹿業(yè)有限公司;堿性蛋白酶(60 000 U/g)、胰蛋白酶(250 000 U/g),北京索萊寶公司.ReadMax1900Plus 型光吸收酶標(biāo)儀,上海閃普生物科技公司.
1.2.1 蛋白酶解法制備魚鰾多肽工藝
取干燥魚鰾,稱量,剪碎,放入水中浸泡,4 ℃過(guò)夜后,溫度60 ℃煮1 h,倒入組織搗碎勻漿機(jī),攪拌30 min,待其變成黏液狀物質(zhì)后,水浴60 ℃下1 h 進(jìn)行兩次提取,并合并濾液,冷卻至室溫后進(jìn)行pH 調(diào)節(jié),隨后加入酶酶解(表1),待酶解結(jié)束后沸水中滅酶10 min,離心,取上清液置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥50 h,即得魚鰾多肽.
表1 不同蛋白酶最適水解參數(shù)
1.2.2 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽的工藝優(yōu)化
單因素實(shí)驗(yàn):考查酶解過(guò)程中pH、酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)ABTS 清除率的影響.固定反應(yīng)條件中酶添加量10 000 U/g,酶解時(shí)間5 h,酶解溫度60 ℃,考察溶液pH(7、8、9、10、11)對(duì)ABTS 清除率的影響;固定反應(yīng)條件pH 9,時(shí)間5 h,溫度60 ℃,考察酶添加量(6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g)對(duì)ABTS 清除率的影響;固定反應(yīng)條件pH 9,酶添加量10 000 U/g,酶解溫度60 ℃,考察酶解時(shí)間(3 h、4 h、5 h、6 h、7 h)對(duì)ABTS 清除率的影響;固定反應(yīng)條件pH 9,酶添加量10 000 U/g,酶解時(shí)間5 h,考察酶解溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)對(duì)ABTS清除率的影響.
正交試驗(yàn)設(shè)計(jì):根據(jù)堿性蛋白酶最適水解條件及單因素試驗(yàn)結(jié)果,選用正交試驗(yàn)探究各條件間的交互作用對(duì)ABTS 清除率的影響,進(jìn)而得到魚鰾多肽酶解的最佳工藝(表2).
如圖1 所示,不同蛋白酶酶解多肽的ABTS清除率存在一定的差異,但均呈現(xiàn)劑量依賴性,隨著多肽劑量的增加,ABTS 清除率不斷升高.在各個(gè)濃度顯示的結(jié)果當(dāng)中,堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率均顯著高于胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解多肽;在濃度為5 mg/mL時(shí),堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率最大,為91.32%±3.21%,胰蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率為80.53%±3.24%,胃蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率最低,為52.63%±1.34%.比較三種不同蛋白酶酶解魚鰾多肽的情況,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選取具有更高ABTS 清除率的堿性蛋白酶進(jìn)行魚鰾多肽酶解工藝的優(yōu)化.
圖1 各蛋白酶最適條件下的ABTS 清除率
2.2.1 pH 對(duì)堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS清除率的影響
圖2 顯示,ABTS 清除率隨溶液pH 值的增大而逐漸增加,當(dāng)pH 值為10 時(shí),達(dá)到ABTS 清除率的最大值;但隨著pH 值繼續(xù)增大,反而抑制了ABTS 的清除率.因此,在本試驗(yàn)條件下,適宜的pH 值為10.
圖2 pH 對(duì)ABTS 清除率的影響
2.2.2 酶添加量對(duì)堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響
圖3 顯示,酶添加量小于12 000 U/g 時(shí),ABTS 清除率呈顯著升高趨勢(shì)(P<0.05),酶添加量為12 000 U/g 時(shí),ABTS 清除率達(dá)到最大值.因此,選擇酶添加量12 000 U/g 時(shí)為最佳.
圖3 酶添加量對(duì)ABTS 清除率的影響
2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響
圖4 顯示,ABTS 清除率在3~6 h 之間顯著提高(P<0.05),魚鰾多肽的ABTS 清除率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加,6 h 時(shí)達(dá)到最大值,隨后,ABTS 清除率變化不顯著(P>0.05).考慮成本等原因,選擇6 h 作為適宜酶解時(shí)間.
圖4 酶解時(shí)間對(duì)ABTS 清除率的影響
2.2.4 酶解溫度對(duì)堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響
圖5 顯示,溫度在45~60 ℃時(shí),魚鰾多肽ABTS 清除率顯著提高(P<0.05),此時(shí)魚鰾多肽ABTS 清除率達(dá)到最大值.溫度高于60 ℃后,魚鰾多肽可能有部分發(fā)生變性,魚鰾多肽的ABTS 清除率下降.所以選擇適宜酶解溫度為60 ℃.
圖5 酶解溫度對(duì)ABTS 清除率的影響
在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)篩選出最佳工藝參數(shù)(表3).
表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
影響堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽工藝的主次因素分別為酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH,最佳提取條件是A1B3C1D1.在此條件下,測(cè)得魚鰾多肽為2 mg/mL 時(shí),ABTS 清除率為43.25%±0.95%.
本研究以魚鰾多肽的ABTS 清除率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行最優(yōu)酶的篩選和進(jìn)一步的工藝優(yōu)化,采用正交試驗(yàn)優(yōu)化魚鰾多肽的提取工藝,得到最優(yōu)的提取方案,即:提取pH 9、酶添加量10 000 U/g、時(shí)間5 h、溫度60 ℃.本試驗(yàn)確定了魚鰾多肽的最佳提取方案,可為魚鰾多肽的現(xiàn)代應(yīng)用提供參考,為魚鰾食品藥品的相關(guān)方向研究與開發(fā)提供依據(jù).
通化師范學(xué)院學(xué)報(bào)2023年10期