陳景運，甘麥鄰，胡 曉，沈林園，朱 礪*

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130；3. 內(nèi)江市畜牧業(yè)發(fā)展中心，四川 內(nèi)江 641000；4. 內(nèi)江市種豬場，四川 內(nèi)江 641000）

內(nèi)江豬是我國優(yōu)良地方豬種，屬西南型豬種。主要分布于四川盆地中部沱江流域的內(nèi)江市、資陽市和自貢市。內(nèi)江豬適應(yīng)性強、耐粗飼、配合力好、雜種優(yōu)勢明顯，在高寒氣候、高海拔地區(qū)和極端不良的環(huán)境下均能表現(xiàn)出優(yōu)異的抗逆性和耐受性[1]。2000 年，農(nóng)業(yè)部將內(nèi)江豬列為了“國家級畜禽資源保護品種”[2]。2019年受“非洲豬瘟”疫情影響，內(nèi)江豬核心種群數(shù)量僅維持在180 頭左右[3]。內(nèi)江豬遺傳資源的保存不容忽視。

在當(dāng)前非洲豬瘟仍舊肆虐的背景下，冷凍保存是安全有效的遺傳資源保存方法。針對大型哺乳動物，常見的冷凍保存方式主要有冷凍精液、冷凍體細胞和冷凍胚胎[4]。冷凍精液可以持久保存，理論上不受時間、區(qū)域還有種豬壽命的制約，可以使種公豬的利用效率得到最大幅度的提升。雖然冷凍精液是目前技術(shù)上比較成熟的一種保存方式，但也存在只能保存雄性配子的缺點。而與冷凍精液相比，后兩種冷凍保存方式門檻較高。冷凍體細胞則需要首先分離體細胞，再進行冷凍保存。此外復(fù)蘇解凍后還需要依賴克隆、胚胎移植等技術(shù)完成新個體的生命延續(xù)。而冷凍胚胎也涉及到同期發(fā)情、超數(shù)排卵和胚胎移植等技術(shù)。

豬精脂質(zhì)含量和組分特征與其他哺乳動物（牛、羊等）相差較大，導(dǎo)致其對低溫特別敏感，抗凍性較差。精液冷凍后存活率低，使用凍精配種受胎率低，相關(guān)技術(shù)仍不成熟[5-6]。長期以來，研究人員將主要精力集中于降低精子冷凍過程的低溫打擊，但精液的解凍過程缺乏關(guān)注。精液冷凍保存同時包含冷凍和解凍兩個聯(lián)系緊密又相互獨立的過程。豬精液冷凍和解凍過程同樣經(jīng)歷了“固態(tài)”和“液態(tài)”2種形態(tài)的轉(zhuǎn)變，因此豬冷凍精液的解凍過程與豬精液冷凍過程同樣重要。

鑒于內(nèi)江豬的現(xiàn)狀，本研究旨在以精液為重要遺傳資源物質(zhì)，建立和優(yōu)化內(nèi)江豬精液冷凍、解凍程序，以期利用冷凍精液為內(nèi)江豬保種提供技術(shù)支撐，為內(nèi)江豬資源保護和推廣利用等相關(guān)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

常溫稀釋液（AndroPRO Plus）、冷凍基礎(chǔ)液（Androhep?CryoGuard Cooling & Freezing Extender）、解凍液（Androhep?CryoGuard Thaw Extender）（Minitube，德國）、新鮮雞蛋、甘油（索萊寶科技有限公司，北京）和0.25 mL 細管（IMV，法國）。精漿生化指標檢測所需試劑盒（過氧化氫、丙二醛等）均購自北京索萊寶科技有限公司，測定時參考試劑盒說明書進行。

1.2 公豬精液采集及品質(zhì)測定

采集正常使用的內(nèi)江公豬精液（由內(nèi)江豬保種場提供），鏡檢合格（按場內(nèi)標準）后使用稀釋液按原精和稀釋液1∶1比例稀釋內(nèi)江豬精液，平衡2 h后進行運輸（17 ℃車載冰箱）至實驗室（由于當(dāng)?shù)夭痪邆錂z測生化指標和制作冷凍精液的條件，因此使用常溫稀釋精液運輸至實驗室后，再開展后繼實驗）。鏡檢，當(dāng)精子活率高于80%，活力高于50%，可用于后繼試驗。為進一步分析內(nèi)江豬精液品質(zhì)，本研究同時使用了大白豬作為參考，用上述同樣的方法采取大白豬精液用于試驗。

精液品質(zhì)包含：精子形態(tài)、活率、活力和運動狀態(tài)（快速前進精子數(shù)、慢速前進精子數(shù)、環(huán)形移動精子數(shù)和原地運動精子數(shù)）。精漿生化指標測定：精漿中鋅離子濃度、過氧化氫含量、丙二醛和甘油三酯濃度。

1.3 冷凍精液制作

內(nèi)江豬冷凍精液采用0.25 mL 細管裝管，并使用液氮作為媒介的程序化冷凍，參考課題組此前研究[7]。鏡檢計算精子總數(shù)（精子總數(shù)=精液密度×精液量。冷凍精液密度設(shè)為2 億/mL，因此凍精總量=總精子數(shù)÷2 億/mL，并計算后續(xù)冷凍稀釋液各組分的用量），當(dāng)精子活率高于80%，活力高于50%時，可用于制作冷凍精液。依據(jù)計算量進行冷凍稀釋液和營養(yǎng)液配制。冷凍稀釋液Ⅰ：根據(jù)說明書首先配制冷凍基礎(chǔ)液，待其充分溶解后以冷凍基礎(chǔ)液∶新鮮蛋黃=4∶1 比例加入新鮮雞蛋蛋黃。冷凍稀釋液Ⅱ：在冷凍稀釋液Ⅰ中加入終濃度6%（或8%（改進后配方），整個體系中為3%或4%）的甘油，提前預(yù)冷到4 ℃。精液在提前17 ℃預(yù)冷好的離心機中以2 300 ×g離心5 min（改進后為2 000 ×g離心7 min），將沉淀按4億/mL的濃度加入冷凍稀釋液Ⅰ，混合吹勻后于4 ℃進行平衡，時間為2.5 h。精液4 ℃平衡后按1∶1 比例加入冷凍稀釋液Ⅱ，形成2億/mL濃度的冷凍前精液。冷凍前隨機抽取3～5支精液進行冷凍前鏡檢（冷凍前精液活率不低于50%，活力不低于40%）。鏡檢合格后，精液進行液氮熏蒸程序化冷凍，精液細管在距液氮液面高度5 cm左右（溫度-80～-120 ℃）熏蒸8 min后投入液氮，在液氮中進行長期保存。

1.4 冷凍精液解凍

冷凍精液解凍參考本課題組前期研究[8]。將內(nèi)江豬冷凍精液細管從液氮中取出后迅速放入提前預(yù)熱的恒溫水浴鍋（37、42、56 ℃），并計時（記20、15或10 s），取出精液后按1∶9的比例將凍融精液與解凍液混合。將解凍好的精液37 ℃預(yù)熱平衡3 min，在顯微鏡下觀察并使用精子自動分析系統(tǒng)（Andro-Vision，Minitube，德國）分析精子活率、活力快速前進運動精子數(shù)、慢速運動精子數(shù)、環(huán)狀運動精子數(shù)和原地運動精子數(shù)等指標。

1.5 統(tǒng)計分析

使用WPS Office表格工具錄入數(shù)據(jù)并做初步的整理和分析。使用SPSS 22.0（IBM，USA）進行單因素方差分析。除特殊標注外所有結(jié)果使用平均值±標準差表示。對于統(tǒng)計分析結(jié)果，P＜0.05，視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)江豬公豬精液品質(zhì)

對5 頭內(nèi)江公豬精液品質(zhì)進行了分析，發(fā)現(xiàn)平衡12 h后內(nèi)江豬精液活力指標顯著下降，原地移動精子數(shù)顯著上升（圖1B）。而常溫（17 ℃）保存3 d后活率、活力和快速前進精子均顯著下降，同時原地移動精子顯著上升（圖1C）。從變化規(guī)律來看，差異指標的變化主要發(fā)生在前12 h，而常溫保存12 h至常溫保存3 d所有精子指標均無顯著差異變化（表1）。

表1 內(nèi)江豬公豬精液品質(zhì)Table 1 Semen quality of boars in Neijiang pigs %

圖1 內(nèi)江豬公豬精子運行軌跡和狀態(tài)Figure 1 Trajectory of boar sperm in Neijiang pigs

本研究進一步對同一時間采集的內(nèi)江豬和大白公豬精漿生化指標進行分析，發(fā)現(xiàn)在運輸至實驗室時內(nèi)江豬精液活力顯著低于大白豬（P＜0.05，圖2A），同時精漿中過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量顯著高于大白豬（P＜0.05，圖2B）。對精子活力和精漿各生化指標進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)精子活力與精漿H2O2和MDA含量呈中等及以上負相關(guān)，而與甘油三酯（Tri-glyceride, TG）含量呈中等正相關(guān)關(guān)系（圖2C）。

圖2 內(nèi)江豬與大白豬公豬精子生化指標Figure 2 Sperm biochemical indexes of Neijiang and Large White boars

2.2 內(nèi)江豬冷凍精液制作及優(yōu)化

由于內(nèi)江豬與大白豬精子活力和精漿生化指標均存在差異，因此我們猜想適用于外種豬的冷凍精液制作方案可能不適用于內(nèi)江豬，因此對離心程序和甘油終濃度做了調(diào)整（圖3）。使用5頭內(nèi)江豬混合精液，改進后的冷凍流程（New）與原程序（Old）相比在冷凍前活率提升了10.28%，活力提升了15.75%，并達到顯著水平。同時快速前進精子數(shù)由原程序的19.31%提升至39.96%，并達到顯著水平。新程序還顯著影響了緩慢前進、環(huán)狀移動和原地移動精子比率。此外，使用原程序進行處理的大白豬冷凍精子，其活率和活力均顯著高于改進前后的內(nèi)江豬冷凍前精子的活率和活力，快速前進運動精子則顯著高于原程序，緩慢前進運動精子率則顯著高于新程序（表2）。

表2 內(nèi)江豬精液冷凍前精子指標Table 2 Sperm index of Neijiang pig semen before freezing %

圖3 豬冷凍精液制作及使用流程Figure 3 Production and use process of frozen pig semen

2.3 內(nèi)江豬凍精解凍程序及優(yōu)化

使用前述2 種冷凍程序（優(yōu)化前后）進行冷凍，分別使用低溫慢速（37 ℃，20 s）、中溫中速（42 ℃，15 s）和高溫快速（56 ℃，10 s）進行解凍。發(fā)現(xiàn)改進冷凍流程后的冷凍精液在解凍時選用低溫慢速法在總體活率、活力和緩慢前進運動精子比率均顯著高于高溫快速解凍。不同冷凍程序和解凍程序下的快速前進運動精子、環(huán)狀移動和原地移動精子比率均無顯著差異。綜合來看內(nèi)江豬最適的凍精解凍流程為低溫慢速（37 ℃，20 s），在此條件下冷凍保存內(nèi)江豬精液解凍后活率最高為(53.18±5.68)%，活力可達(40.36±5.01)%（圖4）。

圖4 不同程序解凍內(nèi)江豬精液精子指標Figure 4 Sperm index of Neijiang pigs under different thawed procedures

3 討論

當(dāng)前豬場為了提高種公豬利用率，配種方式主要是人工授精（鮮精）。一些研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)豬的遺傳和品種均會對精液品質(zhì)特征和冷凍保存能力產(chǎn)生影響[9-11]。對精液品質(zhì)的研究是精液未來應(yīng)用的保證，因此我們需要關(guān)注內(nèi)江豬的精液品質(zhì)和常溫保存時的保存時間[12]。對內(nèi)江豬公豬精液品質(zhì)進行分析，我們發(fā)現(xiàn)精液最初活力為(82.75±8.69)%，但12 h 后就迅速下降至(70.31±1.69)%，至3 d 進一步下降至(61.89±3.8)%，基本達到了國家標準《種豬常溫精液，標準號：GB23238-2009》中地方豬的要求，但與引入豬種還存在一定差距[8]。稀釋后精子活力快速從80%以上降至70%左右，猜測這可能與使用的是外種豬精液稀釋粉有關(guān)。今后有必要進一步研發(fā)適用于內(nèi)江豬的長效精液稀釋劑。

盡管在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中使用鮮精配種的比例超過了90%，冷凍精液的使用率僅占1%左右，但在引種和保種等特殊情況下，冷凍精液有其獨特的優(yōu)勢[13]。而在精子的保存過程中，存在許多影響精子保存的因素[14]。對于地方豬而言，在冷凍精液制作過程中尤其需要注意符合精液的生物特征，根據(jù)其特征確定最合適的冷凍程序。如鐘觀新[15]在同一套冷凍和解凍流程下對比杜洛克和廣東小耳花豬凍精效果的差異，發(fā)現(xiàn)同一套流程下，杜洛克精液解凍后的平均活力可以達到60%，而廣東小耳花豬精液解凍后平均活力只有40%。因此對于不同品種的豬不能簡單地使用一套通用的冷凍流程，有必要對其進行深入探究。在本研究中，由于內(nèi)江豬與大白豬精子活力和精漿生化指標均存在差異，因此我們猜想適用于外種豬的冷凍精液制作方案可能不適用于內(nèi)江豬。在本研究中發(fā)現(xiàn)內(nèi)江豬精漿中H2O2和MDA 含量顯著高于大白豬，H2O2和MDA 的產(chǎn)生可能與細胞膜破碎產(chǎn)生自由基等有關(guān)[16]，而自由基可能會促進活性氧的產(chǎn)生，進而降低精液質(zhì)量[17]。研究表明，離心會對精子的DNA造成損傷[18]。為了減輕離心對內(nèi)江豬精子造成的傷害，本研究使用了更為溫和的離心方式，將離心程序由“2 300 ×g，5 min”改為“2 000 ×g，7 min”。甘油是各種家禽精子冷凍時最常用的冷凍保護劑之一[19]。Zong Y. H.等[20]研究表明，不同甘油濃度對精子活力具有顯著影響。在本研究中內(nèi)江豬精漿TG 含量較低（僅大白豬55.50%，未達到顯著水平）?；诒菊n題組前期研究[7]和脂類對精子的影響[21]，猜測內(nèi)江豬精漿較低的TG含量可能是其冷凍效果較差的原因之一。因此在改進后的方案中增加了TG含量，將甘油的終濃度由6%改為8%。使用改進后的處理流程（圖3）顯著提升了冷凍前精子的活率和活力。

冷凍精液解凍是凍存的反向過程，對于精液保存同樣重要。在解凍程序方面，通常分為低溫慢速解凍和高溫快速解凍[8]。多年來針對豬冷凍精液的解凍程序，溫度上從22 ℃至70 ℃，時間從5 s到1 min均有涉及[22]。羅子燕[23]和劉莉[24]基于0.25 mL細管凍精的解凍最佳程序均為低溫慢速（37 ℃，30 s）模式。史文清等[25]采用的0.5 mL細管凍精更適用于低溫慢速（38 ℃，20 s）模式。而章嘯軍等[26]采用的0.5 mL細管凍精更適用于高溫快速（60 ℃，8 s）模式。由此可見，最佳的解凍模式也會受到豬品種、細管規(guī)格和冷保護劑的影響。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)江豬冷凍精液在37 ℃條件下進行20 s的解凍效果最好，精子活率為(53.18±5.68)%，活力可達(40.36±5.01)%。相較于高溫快速的解凍方式，采用低溫慢速解凍，精子活率和活力均提升超過10%。這與C. Tomas等[27]的研究（70 ℃，8 s）不同，但與我們前期針對榮昌豬的研究結(jié)果相似（42 ℃，20 s）[8]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明內(nèi)江豬與大白豬的精液在H2O2和MDA 含量上存在顯著差異。精子活力與精漿H2O2和MDA 含量呈中等及以上負相關(guān)，而與TG含量呈中等正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)內(nèi)江豬精液特點，新的冷凍程序和低溫慢速（37 ℃，20 s）的解凍程序更適合內(nèi)江豬?？偟膩碚f，內(nèi)江豬在今后的保種和開發(fā)利用的研究中可以針對內(nèi)江豬精液特點重點研發(fā)適用于內(nèi)江豬的高效和長效稀釋液，并對內(nèi)江豬冷凍精液流程進行進一步優(yōu)化。