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        不同產(chǎn)地生姜中姜酚類(lèi)含量及最佳配比研究

        2023-11-03 03:49:58董文南萬(wàn)敏李克招袁惠
        藥品評(píng)價(jià) 2023年7期
        關(guān)鍵詞:姜辣素抑制率產(chǎn)地

        董文南,萬(wàn)敏,李克招,袁惠

        1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330029;2 江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心,江西 南昌 330029

        生姜(Zingiber officinaleRosc.)為姜科姜屬的多年生草本植物的新鮮根莖,最早起源于春秋時(shí)期,首載于《金匱要略》,張仲景的《傷寒雜病論》記載的方劑中用到生姜的就有75 首[1]。我國(guó)是世界上生姜總產(chǎn)量最多的國(guó)家,地方品種繁多[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界生姜共有約80 個(gè)屬,而中國(guó)就占據(jù)了其中14 個(gè),分布于我國(guó)的中部、東南部到西南部。生姜是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,歷史悠久,應(yīng)用廣泛?,F(xiàn)代研究表明,生姜具有止吐[3]、抗腫瘤[4-5]、抗糖尿?。?]、治療心腦血管疾?。?]等藥理活性。

        不同產(chǎn)地的生姜中的功能性成分姜酚含量差異較大,不少文獻(xiàn)將姜酚作為評(píng)價(jià)生姜的質(zhì)量指標(biāo)[8-9]。2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定生姜中6-姜辣素含量不得低于0.05%,8-姜酚和10-姜酚總量不得低于0.04%。本研究收集了30 個(gè)不同產(chǎn)地的生姜,用優(yōu)選的姜酚制備工藝處理得到姜酚提取物,分別測(cè)定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量及含量配比,運(yùn)用成熟的宮頸癌Hela 細(xì)胞作為體外篩選模型,根據(jù)腫瘤細(xì)胞抑制率IC50值優(yōu)選姜酚提取物中各成分的比例。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        MS205DU 型電子天平(梅特勒-托利多公司);LC-20ADXR 型高效液相色譜(日本島津公司);SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)(上海鼎科科學(xué)儀器公司);QP-80 型二氧化碳培養(yǎng)箱(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司);SN-LSC-40S 型離心機(jī)(上海尚普儀器設(shè)備有限公司);ELI0A 型酶標(biāo)儀(BIOBASE公司)等。

        1.2 材料

        生姜(經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院的萬(wàn)林春主任中藥師鑒定為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖);6-姜酚對(duì)照品(批號(hào):SLCG1228,購(gòu)自Sigma 公司);Hela 細(xì)胞系[RPMI Medium 1640(含雙抗),索萊寶:31800-500 mL];FBS 緩沖液(ABW:AB-FBS0500);胰蛋白酶-EDTA 消化液(0.25%)不含酚紅(索萊寶:T1300);1×PBS 緩沖液(pH7.2~7.4,索萊寶:P1020);CCK-8 試劑盒(細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒,索萊寶:CA1210);二甲基亞砜(DMSO,細(xì)胞培養(yǎng)級(jí),索萊寶:D8371);5-氟尿嘧啶(美侖:MB1273-1);96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(labselect:11512)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 姜酚的含量測(cè)定

        2.1.1 色譜條件色譜柱:OSAKA SODA CAPCELL PAK C18 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫(0~10 min,45% A;10~15 min,45% →48% A;15~17 min,48% →60%A;17~43 min,60% A;43~45 min,60% →67% A;45~48 min,67%→69% A;48~58 min,69%→71% A);檢測(cè)波長(zhǎng):282 nm;流速:0.5 mL/min ;柱溫:25 ℃ ;進(jìn)樣量:15 μL。

        2.1.2 對(duì)照品溶液制備精密稱(chēng)取6-姜辣素對(duì)照品,加甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度為102.4 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

        2.1.3 供試品溶液制備取絞碎的生姜50 g,精密稱(chēng)定,加10 倍量75%乙醇浸泡0.5 h,回流提取1.0 h,濾過(guò),備用。藥渣再加5 倍量的75%乙醇,回流提取1.0 h,濾過(guò),合并濾液,50 ℃減壓回收乙醇至無(wú)醇味,加水稀釋至0.5 g/mL,備用。

        量取預(yù)先處理好的XAD 7HP 型大孔吸附樹(shù)脂10 mL,進(jìn)行濕法裝柱,將上述稀釋液緩慢上樣,以2~3BV 的體積流量通過(guò)樹(shù)脂柱;分別用水4BV(40 mL)和40%乙醇4BV(40 mL)洗滌除雜,棄去洗液;再用6BV 的75%乙醇,以2~3BV 的體積流量進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,50~60 ℃減壓回收乙醇至無(wú)醇味(至5~10 mL),加水稀釋至50 mL(1 g 生藥/mL),并加入同等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取,振搖10 min,靜置30 min,取有機(jī)相離心,分取澄清有機(jī)相,減壓濃縮至干,用適量甲醇分次洗滌殘?jiān)?,洗滌液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,備用。精密量取上述甲醇溶液1 mL,置于10 mL 量瓶中,加甲醇定容至刻度,即得供試品溶液。不同產(chǎn)地的30 個(gè)批次生姜同法操作。

        2.1.4 姜酚的測(cè)定方法參照2020 年版《中國(guó)藥典》,吸取供試品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定生姜中6-姜辣素的含量,利用校正因子分別計(jì)算8-姜酚、10-姜酚含量。

        2.2 抗腫瘤體外藥物篩選試驗(yàn)

        2.2.1 體外試驗(yàn)樣品制備從“2.1.3”項(xiàng)下的30 個(gè)批次的甲醇定容的總姜酚溶液中分別取1 mL 母液,揮干甲醇溶劑,加入20 μL DMSO 溶解沉淀后加入對(duì)應(yīng)體積的培養(yǎng)基至50、75、100、125、150 μM五種濃度,無(wú)菌過(guò)濾;陽(yáng)性組為5-氟尿嘧啶用完全培養(yǎng)基配制成50 μM 濃度的溶液;對(duì)照孔為0.5%DMSO 溶液。

        2.2.2 試驗(yàn)方法及計(jì)算(1)試驗(yàn)方法。CCK-8 試劑盒是MTT 法的最新的一種替代方法,用酶聯(lián)免疫法在特定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,可間接反映其中存活的細(xì)胞數(shù)量,廣泛應(yīng)用于腫瘤抑制率和細(xì)胞增殖的快速高靈敏度檢測(cè)。本試驗(yàn)使用胰酶消化Hela細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基以每孔1×104個(gè)鋪于96 孔板上,在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,待細(xì)胞完全貼壁;棄去舊的培養(yǎng)基,添加含藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行處理,培養(yǎng)48 h;棄上清,添加10% CCK-8 檢測(cè)試劑,培養(yǎng)1~2 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

        (2)計(jì)算方法。細(xì)胞抑制率(%)=[(A 對(duì)照孔-A 實(shí)驗(yàn)孔)/(A 對(duì)照孔-A 空白孔)]×100%;A 空白孔:不含細(xì)胞和待測(cè)藥物、只含CCK-8 的培養(yǎng)基的吸光度;A 對(duì)照組:含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有待測(cè)藥物、含0.5% DMSO 的吸光度;A 陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組:含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、5-氟尿嘧啶50 μM 濃度、含0.5% DMSO 的吸光度;A給藥實(shí)驗(yàn)組:含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)藥物、含0.5% DMSO 的吸光度。

        2.3 試驗(yàn)結(jié)果

        運(yùn)用優(yōu)選的制備工藝(見(jiàn)“2.1.3”項(xiàng)下),分別測(cè)定不同產(chǎn)地30 個(gè)批次的總姜酚提取物溶液的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚含量,并計(jì)算,有效成分含量配比=有效成分含量/(6-姜辣素、8-姜酚和10 姜酚含量之和)。從表1 結(jié)果可以看出,不同產(chǎn)地的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量和含量配比差異較大。

        表1 不同產(chǎn)地生姜的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚含量及對(duì)Hela細(xì)胞IC50值

        運(yùn)用成熟的宮頸癌Hela 細(xì)胞作為體外篩選模型,根據(jù)腫瘤細(xì)胞抑制率IC50值優(yōu)選姜酚提取物中的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的比例。從表1 抑制率結(jié)果可以看出,空白組抑制率為0,對(duì)照組抑制率為-0.87%,陽(yáng)性組抑制率為92.27%,實(shí)驗(yàn)組中三者比例6-姜辣素77%±0.5%(76.5%~77.5%),8-姜 酚11.5%±0.5%(11.0%~12.0%),10-姜 酚11.5%±0.5%(11.0%~12.0%)時(shí),IC50小于20 μM,顯示非常好的抗腫瘤活性,為最佳配比關(guān)系,為今后姜酚用于抗腫瘤研究確定提取物標(biāo)準(zhǔn)。

        3 討論

        試驗(yàn)結(jié)果表明,不同產(chǎn)地的生姜經(jīng)過(guò)優(yōu)選的制備工藝提取后,制備所得的姜酚提取物中功能性成分6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量差異較大,含量配比也有所不同。通過(guò)對(duì)30 個(gè)不同產(chǎn)地的姜酚提取物進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞抑制率試驗(yàn)進(jìn)行篩選,得到相應(yīng)批次提取物的IC50值來(lái)判斷抗腫瘤效果。最終發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地浙江磐安、江西南昌的生姜IC50值最小,表明這兩個(gè)產(chǎn)地的生姜具有較好地抑制宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)研究不同產(chǎn)地30 個(gè)批次的總姜酚提取物中6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚不同量的配比及對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞抑制率IC50值,確定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的比例范圍為(76.5%~77.5%)∶(11.0%~12.0%)∶(11.0%~12.0%)時(shí)抗腫瘤活性最強(qiáng)。

        近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),中藥發(fā)揮作用不僅僅依靠某一種單一的成分,有可能是結(jié)構(gòu)相近的一組成分發(fā)揮協(xié)同增效作用[2]。6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚為結(jié)構(gòu)相近的同系物,具有產(chǎn)生相同藥理作用的官能團(tuán),與體內(nèi)受體結(jié)合后,在體內(nèi)進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),并產(chǎn)生相同藥效[2]。通過(guò)體外腫瘤抑制率試驗(yàn)高通量快速篩選IC50值較低的所屬產(chǎn)地的生姜,并明確6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的天然配比,得到其最佳配比范圍。為探討中藥中含有的一系列同系物具有相同藥理作用提供了新思路,并為中藥用于抗腫瘤研究確定提取物標(biāo)準(zhǔn)。

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