董文南，萬(wàn)敏，李克招，袁惠

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2 江西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心，江西 南昌 330029

生姜（Zingiber officinaleRosc.）為姜科姜屬的多年生草本植物的新鮮根莖，最早起源于春秋時(shí)期，首載于《金匱要略》，張仲景的《傷寒雜病論》記載的方劑中用到生姜的就有75 首［1］。我國(guó)是世界上生姜總產(chǎn)量最多的國(guó)家，地方品種繁多［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界生姜共有約80 個(gè)屬，而中國(guó)就占據(jù)了其中14 個(gè)，分布于我國(guó)的中部、東南部到西南部。生姜是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，歷史悠久，應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代研究表明，生姜具有止吐［3］、抗腫瘤［4-5］、抗糖尿?。?］、治療心腦血管疾?。?］等藥理活性。

不同產(chǎn)地的生姜中的功能性成分姜酚含量差異較大，不少文獻(xiàn)將姜酚作為評(píng)價(jià)生姜的質(zhì)量指標(biāo)［8-9］。2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定生姜中6-姜辣素含量不得低于0.05%，8-姜酚和10-姜酚總量不得低于0.04%。本研究收集了30 個(gè)不同產(chǎn)地的生姜，用優(yōu)選的姜酚制備工藝處理得到姜酚提取物，分別測(cè)定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量及含量配比，運(yùn)用成熟的宮頸癌Hela 細(xì)胞作為體外篩選模型，根據(jù)腫瘤細(xì)胞抑制率IC50值優(yōu)選姜酚提取物中各成分的比例。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MS205DU 型電子天平（梅特勒-托利多公司）；LC-20ADXR 型高效液相色譜（日本島津公司）；SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)（上海鼎科科學(xué)儀器公司）；QP-80 型二氧化碳培養(yǎng)箱（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；SN-LSC-40S 型離心機(jī)（上海尚普儀器設(shè)備有限公司）；ELI0A 型酶標(biāo)儀（BIOBASE公司）等。

1.2 材料

生姜（經(jīng)江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院的萬(wàn)林春主任中藥師鑒定為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鮮根莖）；6-姜酚對(duì)照品（批號(hào)：SLCG1228，購(gòu)自Sigma 公司）；Hela 細(xì)胞系［RPMI Medium 1640（含雙抗），索萊寶：31800-500 mL］；FBS 緩沖液（ABW：AB-FBS0500）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）不含酚紅（索萊寶：T1300）；1×PBS 緩沖液（pH7.2～7.4，索萊寶：P1020）；CCK-8 試劑盒（細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒，索萊寶：CA1210）；二甲基亞砜（DMSO，細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，索萊寶：D8371）；5-氟尿嘧啶（美侖：MB1273-1）；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（labselect：11512）。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜酚的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，45% A；10～15 min，45% →48% A；15～17 min，48% →60%A；17～43 min，60% A；43～45 min，60% →67% A；45～48 min，67%→69% A；48～58 min，69%→71% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：282 nm；流速：0.5 mL/min ；柱溫：25 ℃ ；進(jìn)樣量：15 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備精密稱(chēng)取6-姜辣素對(duì)照品，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為102.4 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備取絞碎的生姜50 g，精密稱(chēng)定，加10 倍量75%乙醇浸泡0.5 h，回流提取1.0 h，濾過(guò)，備用。藥渣再加5 倍量的75%乙醇，回流提取1.0 h，濾過(guò)，合并濾液，50 ℃減壓回收乙醇至無(wú)醇味，加水稀釋至0.5 g/mL，備用。

量取預(yù)先處理好的XAD 7HP 型大孔吸附樹(shù)脂10 mL，進(jìn)行濕法裝柱，將上述稀釋液緩慢上樣，以2～3BV 的體積流量通過(guò)樹(shù)脂柱；分別用水4BV（40 mL）和40%乙醇4BV（40 mL）洗滌除雜，棄去洗液；再用6BV 的75%乙醇，以2～3BV 的體積流量進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，50～60 ℃減壓回收乙醇至無(wú)醇味（至5～10 mL），加水稀釋至50 mL（1 g 生藥/mL），并加入同等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，振搖10 min，靜置30 min，取有機(jī)相離心，分取澄清有機(jī)相，減壓濃縮至干，用適量甲醇分次洗滌殘?jiān)?，洗滌液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，備用。精密量取上述甲醇溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。不同產(chǎn)地的30 個(gè)批次生姜同法操作。

2.1.4 姜酚的測(cè)定方法參照2020 年版《中國(guó)藥典》，吸取供試品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定生姜中6-姜辣素的含量，利用校正因子分別計(jì)算8-姜酚、10-姜酚含量。

2.2 抗腫瘤體外藥物篩選試驗(yàn)

2.2.1 體外試驗(yàn)樣品制備從“2.1.3”項(xiàng)下的30 個(gè)批次的甲醇定容的總姜酚溶液中分別取1 mL 母液，揮干甲醇溶劑，加入20 μL DMSO 溶解沉淀后加入對(duì)應(yīng)體積的培養(yǎng)基至50、75、100、125、150 μM五種濃度，無(wú)菌過(guò)濾；陽(yáng)性組為5-氟尿嘧啶用完全培養(yǎng)基配制成50 μM 濃度的溶液；對(duì)照孔為0.5%DMSO 溶液。

2.2.2 試驗(yàn)方法及計(jì)算（1）試驗(yàn)方法。CCK-8 試劑盒是MTT 法的最新的一種替代方法,用酶聯(lián)免疫法在特定波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映其中存活的細(xì)胞數(shù)量，廣泛應(yīng)用于腫瘤抑制率和細(xì)胞增殖的快速高靈敏度檢測(cè)。本試驗(yàn)使用胰酶消化Hela細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基以每孔1×104個(gè)鋪于96 孔板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，待細(xì)胞完全貼壁；棄去舊的培養(yǎng)基，添加含藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，培養(yǎng)48 h；棄上清，添加10% CCK-8 檢測(cè)試劑，培養(yǎng)1～2 h 后用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

（2）計(jì)算方法。細(xì)胞抑制率（%）=［（A 對(duì)照孔-A 實(shí)驗(yàn)孔）/（A 對(duì)照孔-A 空白孔）］×100%；A 空白孔：不含細(xì)胞和待測(cè)藥物、只含CCK-8 的培養(yǎng)基的吸光度；A 對(duì)照組：含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒(méi)有待測(cè)藥物、含0.5% DMSO 的吸光度；A 陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組：含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、5-氟尿嘧啶50 μM 濃度、含0.5% DMSO 的吸光度；A給藥實(shí)驗(yàn)組：含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)藥物、含0.5% DMSO 的吸光度。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用優(yōu)選的制備工藝（見(jiàn)“2.1.3”項(xiàng)下），分別測(cè)定不同產(chǎn)地30 個(gè)批次的總姜酚提取物溶液的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚含量，并計(jì)算，有效成分含量配比=有效成分含量/（6-姜辣素、8-姜酚和10 姜酚含量之和）。從表1 結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量和含量配比差異較大。

表1 不同產(chǎn)地生姜的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚含量及對(duì)Hela細(xì)胞IC50值

運(yùn)用成熟的宮頸癌Hela 細(xì)胞作為體外篩選模型，根據(jù)腫瘤細(xì)胞抑制率IC50值優(yōu)選姜酚提取物中的6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的比例。從表1 抑制率結(jié)果可以看出，空白組抑制率為0，對(duì)照組抑制率為-0.87%，陽(yáng)性組抑制率為92.27%，實(shí)驗(yàn)組中三者比例6-姜辣素77%±0.5%（76.5%～77.5%），8-姜 酚11.5%±0.5%（11.0%～12.0%），10-姜 酚11.5%±0.5%（11.0%～12.0%）時(shí)，IC50小于20 μM，顯示非常好的抗腫瘤活性，為最佳配比關(guān)系，為今后姜酚用于抗腫瘤研究確定提取物標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的生姜經(jīng)過(guò)優(yōu)選的制備工藝提取后，制備所得的姜酚提取物中功能性成分6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量差異較大，含量配比也有所不同。通過(guò)對(duì)30 個(gè)不同產(chǎn)地的姜酚提取物進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞抑制率試驗(yàn)進(jìn)行篩選，得到相應(yīng)批次提取物的IC50值來(lái)判斷抗腫瘤效果。最終發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地浙江磐安、江西南昌的生姜IC50值最小，表明這兩個(gè)產(chǎn)地的生姜具有較好地抑制宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的作用。通過(guò)研究不同產(chǎn)地30 個(gè)批次的總姜酚提取物中6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚不同量的配比及對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞抑制率IC50值，確定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的比例范圍為（76.5%～77.5%）∶（11.0%～12.0%）∶（11.0%～12.0%）時(shí)抗腫瘤活性最強(qiáng)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，中藥發(fā)揮作用不僅僅依靠某一種單一的成分，有可能是結(jié)構(gòu)相近的一組成分發(fā)揮協(xié)同增效作用［2］。6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚為結(jié)構(gòu)相近的同系物，具有產(chǎn)生相同藥理作用的官能團(tuán)，與體內(nèi)受體結(jié)合后，在體內(nèi)進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，并產(chǎn)生相同藥效［2］。通過(guò)體外腫瘤抑制率試驗(yàn)高通量快速篩選IC50值較低的所屬產(chǎn)地的生姜，并明確6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的天然配比，得到其最佳配比范圍。為探討中藥中含有的一系列同系物具有相同藥理作用提供了新思路，并為中藥用于抗腫瘤研究確定提取物標(biāo)準(zhǔn)。