顧煒煒，巴金娜，鄭守晶，鄭明鋒

1.福建農(nóng)林大學金山學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002

人體腸道內(nèi)有大量的微生物菌群，有許多不同的菌株。其中，占細菌總數(shù)99%以上的是專性厭氧菌，屬于腸道中的優(yōu)勢菌群，類桿菌和雙歧桿菌占專性厭氧菌的90%以上[1]。腸道微生物在營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收中起著重要的作用，參與了糖和蛋白質(zhì)的代謝過程，促進了人體免疫系統(tǒng)的建立[2]。

銀耳是一種生長于枯木上的膠質(zhì)真菌[3]，銀耳多糖是銀耳中最重要的活性物質(zhì)，其含量為60%～70%，尤其是酸性多糖的含量較高[4]。暴悅梅等[5]的實驗研究發(fā)現(xiàn)，銀耳中提取的銀耳多糖無甜味，易溶于熱水。

本文從銀耳多糖對嗜酸乳桿菌生長過程的多個影響因素出發(fā)，探索銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的增殖效果，了解銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的細胞形態(tài)和完整度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus），福建農(nóng)大食品安全科技有限公司；銀耳多糖（Tremella polysaccharide），西安圣青生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基所用試劑及其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

銀耳多糖液體培養(yǎng)基：在MRS 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將葡萄糖分別換成0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%的銀耳多糖，121 ℃，0.1 MPa 滅菌20 min。

銀耳多糖固體培養(yǎng)基：在銀耳多糖MRS 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加瓊脂粉18 g。

1.2 儀器設(shè)備

NS-502CT 光學顯微鏡，東莞奈斯精密儀器有限公司；SPX-70B 恒溫培養(yǎng)箱、DGL-35B 立式高壓蒸汽滅菌鍋、DDS-307 電導率儀、pH-3E 酸度計，力辰科技；U-T6 可見分光光度計，屹譜儀器；2.5 L 厭氧培養(yǎng)袋、2.5 L 立式厭氧產(chǎn)氣袋，海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的分離純化

無菌條件下，穿刺挑取一環(huán)菌粉，接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24～48 h。取上述菌懸液在平板上進行劃線法接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置厭氧培養(yǎng)48 h。挑取培養(yǎng)較好的菌落于MRS 液體培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)24 h。將純化培養(yǎng)后的菌懸液與甘油按照1∶1 的比例混合后保存到菌種保藏管中，在-20 ℃環(huán)境下保存。

1.3.2 菌種的活化

取保存在菌種保藏管中的菌種接種到裝有MRS 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24～48 h。

1.3.3 嗜酸乳桿菌發(fā)酵液電導率的測定

微生物細胞里的細胞質(zhì)物質(zhì)可以用電導率直觀地表現(xiàn)出來，發(fā)酵液電導率的檢測可以直接明了地觀察出菌落細胞的完整性。

取活化后的菌液，以1 %的接種量分別接種到葡萄糖和不同體積分數(shù)（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）的銀耳多糖液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h。測定兩種不同碳源的嗜酸乳桿菌發(fā)酵液的電導率，觀察嗜酸乳桿菌的細胞完整性。

1.3.4 嗜酸乳桿菌細胞結(jié)構(gòu)的觀察

取活化后的菌液，同1.3.3 中的方法培養(yǎng)。培養(yǎng)后的菌液在4 ℃、8 600 r/min 的條件下，離心10 min，在載玻片上用革蘭氏陽性菌染液染色涂布固定，用光學顯微鏡觀察菌體的細胞形態(tài)，對不同碳源培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌形態(tài)進行比較，觀察銀耳多糖對嗜酸乳桿菌細胞形態(tài)的影響。

1.3.5 嗜酸乳桿菌生長曲線的測定[6]

取活化后的菌液，同1.3.3 中的方法培養(yǎng)48 h，每隔4 h 取5 mL 菌液，測定嗜酸乳桿菌的OD600nm值，繪制生長曲線。

1.3.6 嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)測定

取活化后的菌液，同1.3.3 中的方法培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液進行梯度稀釋，將合適梯度（10-14、10-15、10-16）菌液用傾注法接種到平板上，每個梯度3 個平行，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置厭氧培養(yǎng)72 h，進行平板計數(shù)統(tǒng)計菌落總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌細胞完整性的影響

由表1、表2 可知，不同碳源培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌發(fā)酵液的電導率差別不大，因此利用銀耳多糖為碳源培養(yǎng)嗜酸乳桿菌不會破壞細胞的完整性。

表1 不同碳源培養(yǎng)的菌液電導率

表2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵液電導率的方差分析表

2.2 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌細胞結(jié)構(gòu)變化的影響

用光學顯微鏡觀察不同碳源培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌株，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌的細胞結(jié)構(gòu)和以不同體積分數(shù)銀耳多糖為碳源培養(yǎng)的菌體細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)沒有區(qū)別，由此可得出銀耳多糖為碳源對嗜酸乳桿菌的細胞形態(tài)沒有影響。

2.3 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌生長曲線測定的影響

由圖1 可知，嗜酸乳桿菌在0～16 h 內(nèi)生長緩慢，16～36 h 之間嗜酸乳桿菌的生長速度較快，36 h之后其生長速度趨于平緩。其中，嗜酸乳桿菌在0.8%體積分數(shù)的銀耳多糖中生長最快。且由表3 可知，嗜酸乳桿菌在銀耳多糖不同體積分數(shù)及不同培養(yǎng)時間中的生長曲線差異極其顯著（P≤0.01），因此選擇0.8%體積分數(shù)的銀耳多糖作為碳源。

圖1 不同體積分數(shù)銀耳多糖為碳源的嗜酸乳桿菌的生長曲線

表3 不同體積分數(shù)銀耳多糖培養(yǎng)菌種的生長曲線的方差分析表

2.4 銀耳多糖對嗜酸乳桿菌活菌數(shù)變化的影響

活菌計數(shù)試驗結(jié)果顯示：嗜酸乳桿菌在0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的銀耳多糖中生長，對應的活菌數(shù)分別為1.3×1017CFU/mL、1.75×1017CFU/mL、1.04 ×1017CFU/mL、4.05 ×1017CFU/mL、3.15 ×1017CFU/mL；不同體積分數(shù)間的活菌數(shù)差異極其顯著（P<0.01），如表4 所示；且由表5 可知，在5%顯著水平下，活菌數(shù)在0.8%體積分數(shù)時與其他體積分數(shù)存在顯著差異。因此，0.8%銀耳多糖體積分數(shù)對嗜酸乳桿菌的增殖效果最好。

表4 不同體積分數(shù)銀耳多糖培養(yǎng)菌種的菌落總數(shù)方差分析表

表5 不同體積分數(shù)間菌種的菌落總數(shù)多重比較（Duncan 多重比較）

3 結(jié)論

通過電導率的測定及光學顯微鏡觀察可得出，用不同碳源培養(yǎng)的菌株細胞完整性和細胞結(jié)構(gòu)幾乎相同，說明銀耳多糖對嗜酸乳桿菌沒有毒害作用。通過OD600值的變化可知，不同體積分數(shù)碳源的嗜酸乳桿菌在0～16 h 內(nèi)生長緩慢，在16～36 h 間生長飛快，36 h 之后生長速度減慢基本趨于平緩。其中，在0.8%體積分數(shù)的銀耳多糖中嗜酸乳桿菌生長最快。通過對嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)分析可知，在0.8%銀耳多糖中培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)最多，對嗜酸乳桿菌的增殖效果最好。

結(jié)合對嗜酸乳桿菌的電導率、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長曲線、菌落總數(shù)等的測定，可以得出銀耳多糖對嗜酸乳桿菌的生長有增殖效果，且嗜酸乳桿菌利用銀耳多糖的最適體積分數(shù)為0.8%。