馬曉權,方興中,成建榮

(蘭州市第一人民醫(yī)院普外科,蘭州 730050)

甲狀腺結節(jié)是內分泌科較為常見的老年疾病類型,指甲狀腺內存在的可隨吞咽動作上下移動的腫塊,發(fā)病因素較為復雜[1]。甲狀腺退行性變、甲狀腺炎、自身免疫及新生物等多種臨床甲狀腺疾病均可表現(xiàn)出結節(jié)癥狀,可單發(fā)也可多發(fā),以多發(fā)病灶更為常見[2]。糖尿病是以胰島素分泌不足和胰島素障礙為重要病理基礎、高血糖為主要表現(xiàn)特征的代謝類疾病,臨床發(fā)病率高,并發(fā)癥多,危害性大,現(xiàn)已成為全球范圍內的公共衛(wèi)生問題。既往研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺結節(jié)與糖尿病發(fā)病之間存在一定關聯(lián),患有2型糖尿病的患者出現(xiàn)甲狀腺結節(jié)的概率明顯增加,兩種疾病之間或許存在共同的免疫及遺傳基礎,可互相影響加重病情[3]。DNA甲基化和羥甲基化是DNA化學修飾的一種形式,甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyl transferase1,DNMT1)的催化下將胞嘧啶轉化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)[4],羥甲基化是在甲基雙加氧酶(ten-eleven translocation-2,TET2)的作用下將5-mC轉化為5羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC),二者均可在不改變DNA序列的條件下進行表觀遺傳修飾,作為外遺傳編碼的一部分,也是一種常見的外遺傳機制[5]。既往研究多探討DNA甲基化和羥甲基化在動脈粥樣硬化相關疾病中的作用,而對于DNA甲基化/羥甲基化在甲狀腺結節(jié)及糖尿病中的作用效果的相關研究較少?；诖?本研究對老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者外周血DNA甲基化/羥甲基化進行檢測,分析異常表觀遺傳學修飾在該病中的作用及臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年1月至2022年12月蘭州市第一人民醫(yī)院普外科收治的136例老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者作為研究組。研究組納入標準:(1)符合甲狀腺結節(jié)相關診斷標準[6],且經(jīng)2位以上高年資影像科醫(yī)師共同閱片,經(jīng)彩超確診;(2)符合成年糖尿病相關診斷標準[7];(3)年齡≥60周歲。研究組136例患者中男性79例,女性57例,年齡65～84(76.19±1.43)歲。另選同期在蘭州市第一人民醫(yī)院體檢中心進行體檢的同年齡段、體檢結果為正常的135例老年人為對照組,其中男性76例,女性59例,年齡62～85(75.86±1.69)歲。對照組納入標準:(1)年齡≥60歲;(2)體檢結果顯示無甲狀腺結節(jié)及糖尿病。排除標準:(1)合并自身免疫疾病、惡性腫瘤或血液疾病;(2)合并急慢性感染性或傳染性疾病;(3)重要器官功能不全;(4)接受過甲狀腺激素替代治療或抗甲狀腺藥物治療;(5)高血壓未控制。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批通過,患者及家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基線資料采集 采集所有入組對象一般資料和既往病史,包括性別、年齡、體質量指數(shù)(body mass index,BMI)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、既往抽煙史、高血壓史和冠心病史。

1.2.2 生化指標檢測 口服葡萄糖耐量試驗測定所有對象空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)和餐后2h血糖(2h postprandial blood glucose,2hPBG)水平;高效液相色譜法[8]測定糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin A1c,HbA1c)水平;全自動生化分析儀檢測甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平;化學發(fā)光法[9]檢測游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(free tetraiodothyronine,FT4)和促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平;免疫化學發(fā)光法[10]檢測甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibodies,TGAb)和甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)水平。

1.2.3 外周血全基因組DNA甲基化/羥甲基化水平檢測 采集所有研究對象外周血各5ml加入含有乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)的抗凝管中,采用Plus血液基因組DNA純化試劑盒進行外周血全基因組DNA純化;采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[11]以5-mC和Quest 5-hmC DNA ELISA試劑盒檢測外周血全基因組5-mC和5-hmC水平,試劑盒均購自Zymo Research公司,所有操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.2.4 外周血細胞間黏附分子-1、TET2水平測定 采集所有研究對象外周血各5ml,采用ELISA法以人外周血細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和TET2 ELISA試劑盒檢測外周血ICAM-1、TET2含量,試劑盒均購自MyBioSource公司,所有操作均嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 2組人群一般資料與既往病史情況比較

2組人群年齡、性別、BMI、SBP、DBP、吸煙史、高血壓史和冠心病史等方面比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05;表1)。

2.2 2組人群生化指標比較

2組人群TG、HDL-C、LDL-C和FT4水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);研究組患者FBG、2hPBG、HbA1c、TSH、TgAb和TPOAb水平均高于對照組,FT3低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05;表2)。

表2 2組人群生化指標情況比較

表3 外周血全基因組DAN 5-mC、5-hmC與甲狀腺結節(jié)、糖尿病的相關性

2.3 2組人群外周血全基因組DNA甲基化/羥甲基化水平比較

研究組外周血5-mC、5-hmC水平均高于對照組[6.64%(3.53%,8.53%)和4.28%(1.70%,7.20%);50.41%(35.00%,63.27%)和36.51%(17.81%,50.06%)],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001;圖1)。

圖1 2組人群外周血全基因組5-mC與5-hmC水平比較

2.4 2組人群血清TET2與ICAM-1表達水平比較

圖2 2組人群外周血TET2、ICAM-1含量

研究組外周血TET2、ICAM-1水平均高于對照組[9.37(5.70,13.56)和4.56(1.52,6.99)pg/ml;4.98(2.35,7.01)和0.97(0.15,1.60)ng/ml],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001;圖2)。

2.5 研究組患者外周血全基因組DAN 5-mC、5-hmC與甲狀腺結節(jié)、糖尿病相關性

Spearman相關性分析結果顯示,研究組5-mC與TgAb、TPOAb和HbA1c呈正相關(r=0.413,0.348,0.405;P<0.05);5-hmC與TgAb、TPOAb、FBG和2hPG呈正相關(r=0.375,0.406,0.376,0.311;P<0.05)。5-mC與5-hmC呈正相關(r=0.256;P<0.05;表3)。

3 討 論

近年來,隨著社會生活水平的提高和人們生活方式的改變,老年糖尿病患者的發(fā)病率逐年升高,有研究提出,長期處于高糖和胰島素抵抗狀態(tài)下的人群發(fā)生甲狀腺結節(jié)的概率明顯升高,胰島素可影響機體甲狀腺組織相關基因的表達水平和細胞內的能量代謝,引起甲狀腺組織細胞快速增殖,導致甲狀腺形態(tài)異常,引發(fā)甲狀腺結節(jié)[12]。隨著學者們對基因組學和表觀遺傳學的不斷探索,最近的研究結果顯示,DNA甲基化和羥甲基化的改變與多種疾病如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、衰老、冠心病及自身免疫性疾病有關[13],此外,也有研究報道稱,自身免疫性甲狀腺疾病患者的甲狀腺細胞中可觀察到異常DNA修飾[14]?；诖?本研究以DNA甲基化和羥甲基化為切入點,探討全基因組DNA甲基化和羥甲基化在老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者中的變化及意義,旨在從表觀遺傳學角度探討老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病的發(fā)病機制,并據(jù)此發(fā)現(xiàn)新的診療手段,從而降低發(fā)病率,優(yōu)化治療,改善預后。

DNA甲基化又被叫做DNA的“第五個堿基”,是指胞嘧啶在DNMT1酶催化下產(chǎn)生5-mC的這一過程,DNA異常甲基化可通過關閉某些基因活性達到沉默基因從而影響一些疾病發(fā)生發(fā)展的作用[15]。DNA羥甲基化又被叫做DNA的“第六個堿基”,作為去甲基化的主要方式之一,可在TET酶的作用下將5-mC催化為5-hmC引起某些基因的重新活化和表達,進而達到調控表觀遺傳的目的[16]。本研究通過對比正常老年人與老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者外周血DNA甲基化和羥甲基化的水平,結果顯示,研究組患者全基因組DNA 5-mC和5-hmC水平均顯著高于對照組,且血清TET2和ICAM-1含量也明顯高于對照組,表明5-mC和5-hmC水平增加是老年甲狀腺合并糖尿病患者血清TET2和ICAM-1活性升高的結果,外周血DNA甲基化和羥甲基化在老年甲狀腺合并糖尿病患者發(fā)病過程中扮演著重要作用。本研究還對外周血DNA甲基化和羥甲基化水平與甲狀腺結節(jié)合并糖尿病的發(fā)病影響因素進行了相關性分析,結果顯示,5-mC與TgAb、TPOAb和HbA1c呈正相關(P<0.05);5-hmC與TgAb、TPOAb、FPG和2hPBG呈正相關(P<0.05);5-mC與5-hmC呈正相關(P<0.05),提示老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者外周血全基因組DNA甲基化和羥甲基化水平與患者甲狀腺功能及血糖代謝有明顯關聯(lián),老年患者的血糖代謝和甲狀腺功能異常影響了外周血全基因組DNA 5-mC和5-hmC水平,這與Pinzón-Cortés等[17]對糖尿病患者外周血甲基化的探索結論基本相符。5-mC在老年患者胰島組織和甲狀腺組織中廣泛分布,并在增強子區(qū)域大量存在,被TET2催化為5-hmC,調控基因的表達和疾病進展[18]。此外,老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者體內長期處于一種慢性高糖和炎癥狀態(tài),多種黏附分子、趨化因子和炎癥細胞因子均發(fā)生異常變化,ICAM-1作為參與單核細胞黏附的主要細胞因子,在血管內壁上誘導單核細胞向巨噬細胞轉換[19],巨噬細胞又在升高的TET2作用下維持炎癥因子的過度積累,加重血糖代謝和甲狀腺代謝功能異常[20],因此,DNA甲基化和羥甲基化是老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病發(fā)病的重要病理基礎,與患者的血糖及甲狀腺功能密切相關。

綜上,老年甲狀腺結節(jié)合并糖尿病患者外周血全基因組DNA甲基化與羥甲基化水平較正常老年人顯著升高,外周血5-mC、5-hmC水平與老年人群甲狀腺結節(jié)、糖尿病發(fā)病顯著相關。然而本研究也存在一定的不足之處,如僅探討了老年患者為外周血DNA甲基化和羥基化水平的變化及臨床意義,未深入探索其影響發(fā)病的機制,后續(xù)會進一步研究。