陳永奇，逯陣毫，馬明，李靜雯，王玉堂

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

癌癥抗原72-4（CA72-4）法是一種檢測腫瘤相關(guān)糖蛋白72（TAG-72）的免疫分析法，該抗原被發(fā)現(xiàn)是在某些腫瘤細(xì)胞群中表達(dá)的抗原［1-3］?？乖昏b定為220～400 kDa 黏蛋白型糖蛋白［1,4］?？贵wB72.3 最初是用轉(zhuǎn)移到肝臟的乳腺腫瘤的膜富集細(xì)胞提取物制備的，并已被證明能與TAG-72［3］反應(yīng)。CC49 是TAG-72 特異性抗體。CC49 抗體和B72.3 抗體分別識別TAG-72 的Galβ（1-3）唾液酸-tn和唾液酸-tn 糖鏈表位［5-6］。有趣的是，CA72-4 在惡性胃癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌患者的血清或血漿中含量升高，并被用于監(jiān)測胃腸道和黏液性卵巢癌患者［1,7-9］。血液測試可以為臨床醫(yī)生提供各種疾病跡象的信息。由于血液檢測的結(jié)果提高了診斷的準(zhǔn)確性，診斷測定顯示準(zhǔn)確的測量值對于臨床決策至關(guān)重要。直到20 世紀(jì)40 年代，標(biāo)本都是用肉眼和人工檢測的。每次測試都很耗時，測試的準(zhǔn)確性取決于技術(shù)人員的技能水平。20 世紀(jì)50 年代，隨著美國制造商自動分析儀的出現(xiàn)，全面的檢測自動化開始了。自動化技術(shù)的進(jìn)步緩解了準(zhǔn)確性和速度的問題。如今，全國醫(yī)療機(jī)構(gòu)（醫(yī)院和臨床檢驗(yàn)中心）的實(shí)驗(yàn)室都有相當(dāng)數(shù)量的標(biāo)本，并在24 h 內(nèi)進(jìn)行檢測。免疫化學(xué)方法在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中被常規(guī)使用。電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）法和化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）法因其靈敏度高、背景低、操作簡單而廣泛應(yīng)用于自動化分析儀中。然而，這兩種方法都受限于免疫化學(xué)反應(yīng)對各種干擾的敏感性，如血清中的自體抗體、抗動物IgG 的嗜異抗體、交叉反應(yīng)、溶血、高脂血癥和高膽紅素血癥。本文基于化學(xué)發(fā)光免疫分析法，采用一些手段排除交叉反應(yīng)等干擾，提高檢測準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 小牛血清白蛋白（BSA）（Sigma公司，雅為生物公司等），魚明膠（Sigma 公司）磁微粒（Merck 公司，羧基磁珠，100 mg/mL）；包被抗體（鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)抗體（鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽 EDC（Sigma 公司）；N-羥基丁二酰亞胺 NHS（Sigma 公司）；磁微粒偶連緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 MES buffer；磁微粒穩(wěn)定液：緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 PBS buffer；酶結(jié)合物穩(wěn)定液：緩沖液0.1 mol/L pH=7.4 PBS buffer；乙醇胺（Aladdin 公司）；高碘酸鈉（Sigma公司）；氰基硼氫化鈉（Sigma 公司）；精氨酸（Sigma 公司）。

1.1.2 主要儀器 全自動化學(xué)發(fā)光測定儀AutoLumo A2000 Plus（安圖生物）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器材有限公司）；振蕩器（TOPSCIEN 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 磁微粒試劑包被方法 在4 mL 玻璃瓶中分別加入0.1 mL 10%質(zhì)量濃度羧基磁珠，1 mL 偶連緩沖液，震蕩5 min 后磁分離，將上述操作重復(fù)3 遍進(jìn)行清洗，而后分別加入0.3 mL 0.1 mol/L EDC 溶液與0.3 mL 0.1 mol/LNHS 溶液（注：以偶連緩沖液進(jìn)行溶解），室溫震蕩反應(yīng)1 h；洗2 次后加入0.9 mL 磁微粒偶聯(lián)緩沖液和0.6 mg CA72-4抗體，并室溫震蕩反應(yīng)2 h。最后加入乙醇胺60 μL 繼續(xù)反應(yīng)30 min，使用磁微粒穩(wěn)定液（根據(jù)不同方案，向磁微粒緩沖液中加入不同的穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑濃度為10 mg/mL），磁分離清洗3 次后定容至9 mL，2～8 ℃儲存。

1.2.2 酶結(jié)合物配制方法 配制酶結(jié)合物穩(wěn)定液，根據(jù)不同方案，向從酶結(jié)合物緩沖液中加入不同的穩(wěn)定劑，穩(wěn)定劑濃度為10 mg/mL；再向上述配置好的穩(wěn)定液中加入酶結(jié)合物，終濃度為1 μg/mL。充分混勻，2～8 ℃儲存。

1.2.3 測試模式 由機(jī)器按照上機(jī)文件進(jìn)行測試，每次加入50 μL 校準(zhǔn)品（濃度值為0 μIU/mL、5 μIU/mL、50 μIU/mL、100 μIU/mL、150 μIU/mL、300 μIU/mL）、20 μL 磁珠混懸液和100 μL 酶結(jié)合物以及100 μL 底物。具體過程使用A2000plus 儀器進(jìn)行檢測，除磁珠混懸液其余均使用該公司在售試劑盒內(nèi)組分。

1.2.4 檢測指標(biāo) 穩(wěn)定性指標(biāo)：目前IVD 行業(yè)對化學(xué)發(fā)光試劑盒的穩(wěn)定性的共識為在37 ℃下放置7 d 約等于試劑條件下在2～8 ℃存放8～12 個月，計算濃度點(diǎn)相對光單位（RLU）下降率ROD（%）=ABS（RLU37℃7d/RLU2～8℃-1）×100%，ROD 均 值為校準(zhǔn)品各值的平均值，目前業(yè)內(nèi)公認(rèn)ROD 值小于10%為合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 BSA 去糖基化方法 將BSA 用純化水配成50 mg/mL，充分?jǐn)嚢?，待其完全溶解后，向其中加入高碘酸鈉和精氨酸，高碘酸鈉及精氨酸的終濃度均為5 mg/mL，避光反應(yīng)3 h。向其中加入氰基硼氫化鈉，終濃度為5 mg/mL，過夜反應(yīng)。用PBS 緩沖液透析，過夜，透析液：PBS 緩沖液液＞1∶50。

2 結(jié)果

2.1 不同穩(wěn)定劑對產(chǎn)品性能影響的結(jié)果

將魚明膠、BSA 加入穩(wěn)定液（10 mg/mL）中，上機(jī)驗(yàn)證產(chǎn)品CA72-4 反應(yīng)性，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同穩(wěn)定劑對產(chǎn)品性能影響的結(jié)果比較

2.2 不同廠家BSA 對產(chǎn)品性能影響的結(jié)果

將不同廠家BSA 加入到穩(wěn)定液中（10 mg/mL），上機(jī)驗(yàn)證產(chǎn)品CA72-4 反應(yīng)性，結(jié)果如表2 所示。

表2 不同廠家BSA 對產(chǎn)品性能影響的結(jié)果

2.3 去糖基化BSA 對產(chǎn)品性能影響的結(jié)果

將上述提到效價較優(yōu)的BSA 進(jìn)行去糖基化，加入到穩(wěn)定液中，且對該產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性考核，其結(jié)果如表3 所示。

表3 去糖基化BSA 對產(chǎn)品性能影響的結(jié)果

通過表2 和表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，將BSA 去糖基化之后，本底有所降低，高濃度RLU 略微降低，但是澤龍20190739 批號的BSA 出現(xiàn)異常。除此之外，其它進(jìn)行7D 熱加速穩(wěn)定性考核，僅個別去糖基化BSA 作為穩(wěn)定劑本底會升高，其它均較優(yōu)。滿足項(xiàng)目需求。

3 討論

本文通過篩選常用的兩種穩(wěn)定劑，確定BSA對RLU 影響較小，但是本底高。后期，筆者又對不同廠家的BSA 進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)不同廠家BSA 對產(chǎn)品性能影響差異較大，綜合分析，可能是BSA上的糖基于抗體發(fā)生了交叉反應(yīng)，因此本文對BSA 進(jìn)行去糖基化，最終通過熱加速穩(wěn)定性考核，本底降低，滿足項(xiàng)目需求。