羅 寧,王玲玲

南京市浦口區(qū)中醫(yī)院:1.內(nèi)分泌科;2.眼科,江蘇南京 211800

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是最常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥之一,主要表現(xiàn)為血-視網(wǎng)膜屏障遭到破壞,發(fā)生新生血管的病理學(xué)變化,使糖尿病患者視力受損。DR病因?qū)W十分復(fù)雜,新血管生成主要與人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCEC)增殖有關(guān)[1]。在DR患者中發(fā)現(xiàn),HRCEC細(xì)胞存在遷移與凋亡的情況[2],因此以高糖誘導(dǎo)HRCEC細(xì)胞為研究對(duì)象,對(duì)探索DR的病理過(guò)程及發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)約為22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼小RNA分子,在轉(zhuǎn)錄后可抑制機(jī)體靶基因的表達(dá)而調(diào)控信號(hào)通路的活性,進(jìn)一步參與疾病進(jìn)程[3]。miR-409-3p是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新miRNA,可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)展[4-5],同時(shí)有研究表明,miR-409-3p在調(diào)節(jié)人體微小血管生成中具有重要作用,在血管生成相關(guān)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3)中下調(diào)[6],但是關(guān)于其在DR中的功能及作用機(jī)制研究甚少。L-型電壓依賴型鈣通道β(CACNB2)是1型糖尿病中DR的一種新的易感基因,有研究表明其在DR患者視網(wǎng)膜細(xì)胞中大量表達(dá),并可以調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的分泌[7]。但是,miR-409-3p是否可靶向結(jié)合CACNB2,調(diào)控DR至今尚罕見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬觀察miR-409-3p是否靶向調(diào)控CACNB2表達(dá)影響HRCEC細(xì)胞的凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,以期為DR的治療提供可能的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1試劑與耗材 人HRCEC購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù),胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,四甲基噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,Trizol試劑、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司,RIPA蛋白裂解液、人白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-18、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,miR-409-3p、miR-con、CACNB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、空白質(zhì)粒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司,雙熒光素酶活性檢測(cè)(LRA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司,CACNB2、活性氧(ROS)、Cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2HRCEC細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HRCEC細(xì)胞,用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),設(shè)置條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況(細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代),每2～3天傳代1次,傳代時(shí)加入無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞,棄除PBS后,加入0.25%胰蛋白酶溶液消化。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 轉(zhuǎn)染前一天將1×105個(gè)HRCEC細(xì)胞接種至6孔板,用50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋miR-409-3p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空白質(zhì)粒(miR-NC)。將對(duì)數(shù)期的HRCEC細(xì)胞分為對(duì)照組、高滲葡萄糖(HG)組、HG+miR-con組、HG+miR-409-3p組、HG+si-con組、HG+si-CACNB2組、HG+miR-409-3p+pcDNA和HG+miR-409-3p+pcDNA- CACNB2組。對(duì)照組用5 mmol/L的葡萄糖處理HRCEC細(xì)胞48 h,HG組用30 mmol/L的葡萄糖處理HRCEC細(xì)胞48 h。按照LipofectamineTM2000試劑盒操作步驟的要求,將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HRCEC細(xì)胞,轉(zhuǎn)染持續(xù)5 h。轉(zhuǎn)染成功后,用30 mmol/L的葡萄糖處理繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集各組細(xì)胞備用。

1.4熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)細(xì)胞中miR-409-3p、CACNB2的表達(dá) Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,微量核酸儀(美國(guó)Thermo公司)對(duì)RNA進(jìn)行定量,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性 15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)35次。miR-409-3p:上游引物為5′-GCGAATGTTGCTCGGTGA-3′,下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內(nèi)參U6:上游引物為5′-ATTCCCCTGTAGGGCTATGA-3′,下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;CACNB2:上游引物為5′-AGGGTCGCTGTTCCTGCATC-3′,下游引物為5′-AATTCTTTGCCTGCTTTTCTG-3′;內(nèi)參GAPDH:上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-409-3p和CACNB2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western blotting(WB)法檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白,13 400×g離心20 min,收集上清,BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。定量蛋白后進(jìn)行變性,再進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳后,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,使用5%脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉1 h。然后,分別將CACNB2、裂解的半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(Bcl-2)和Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)一抗與 PVDF 膜4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,洗膜后顯影,采用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。使用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值進(jìn)行蛋白相對(duì)定量。

1.6LRA驗(yàn)證靶向關(guān)系 TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示,CACNB2的3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)中含有與miR-409-3p互補(bǔ)的核苷酸序列,即miR-409-3p與靶基因CACNB2存在結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建CACNB2野生型(CACNB2-WT組)和突變型(CACNB2-MUT組)熒光素酶報(bào)告載體。使用LipofectamineTM2000試劑盒分別將CACNB2-WT、CACNB2-MUT與miR-409-3p、anti-miR-409-3p、miR-con、anti-miR-con共轉(zhuǎn)染至HRCEC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶的活性,結(jié)果以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值表示。

1.7活性氧(ROS)熒光強(qiáng)度檢測(cè) 采用免疫熒光法檢測(cè)ROS熒光強(qiáng)度。以4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,0.5% Triton X-100[以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制]室溫通透10 min,1% BSA室溫封閉30 min,細(xì)胞滴加適量稀釋至適當(dāng)比例(1∶2 000)的ROS一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,滴加熒光二抗(1∶1 000)。DAPI染細(xì)胞核,濃度和時(shí)間根據(jù)試劑說(shuō)明書使用,用抗熒光淬滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.8炎癥因子檢測(cè) 收集各組細(xì)胞,13 400×g離心20 min,收集上清,參照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-18及IL-1β分泌情況,使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)得IL-6、IL-18及IL-1β在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,并計(jì)算炎癥因子水平。

1.9氧化應(yīng)激因子檢測(cè) 收集細(xì)胞,13 400×g離心20 min后收集上清,按照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)活性,使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)得LDH、MDA、GSH在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度值,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作并計(jì)算酶活性。

1.10流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,加入600 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,再按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI)操作說(shuō)明,先加入5 μL的Annexin V-FITC避光反應(yīng)20 min,再加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min,300目細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾后,于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。凋亡率計(jì)算方法如下:細(xì)胞的凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1miR-409-3p和CACNB2在人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá) 與對(duì)照組比較,HG組miR-409-3p相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05),CACNB2 mRNA和蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

表1 兩組miR-409-3p和CACNB2 mRNA、蛋白表達(dá)量比較

圖1 人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞CACNB2蛋白表達(dá)

2.2miR-409-3p靶向CACNB2表達(dá) miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-409-3p與CACNB2結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2A。LRA檢測(cè)結(jié)果顯示,相較于miR-con組,轉(zhuǎn)染miR-409-3p mimics的CACNB2-WT組細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.01);與anti-miR-con組相比,轉(zhuǎn)染anti-miR-409-3p的CACNB2-WT組細(xì)胞熒光素酶活性升高(P<0.01),CACNB2-MUT組細(xì)胞熒光素酶活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-409-3p組CACNB2蛋白表達(dá)量低于miR-con組(P<0.01),anti-miR-409-3p組CACNB2蛋白表達(dá)量高于anti-miR-con組(P<0.01),說(shuō)明CACNB2為miR-409-3p的靶基因。見(jiàn)圖2B、表2。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:A為預(yù)測(cè)的miR-409-3p與CACNB2結(jié)合位點(diǎn);B為WB法檢測(cè)CACNB2蛋白表達(dá)。圖2 miR-409-3p 與CACNB2靶向序列和調(diào)控CACNB2蛋白表達(dá)

2.3miR-409-3p和CACNB2蛋白表達(dá)對(duì)HG誘導(dǎo)的HRCEC細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 各組CACNB2蛋白表達(dá)量和各組ROS比較,HG組高于對(duì)照組,HG+miR-409-3p組低于HG+miR-con組,HG+si-CACNB2組低于HG+si-con組,HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組高于HG+miR-409-3p+pcDNA組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組CACNB2蛋白表達(dá)量和各組ROS的比較結(jié)果一致。與對(duì)照組相比,HG組miR-409-3p相對(duì)表達(dá)量和LDH及GSH水平降低(P<0.01),MDA水平升高(P<0.01);與HG+miR-con組相比,HG+miR-409-3p組miR-409-3p相對(duì)表達(dá)量、LDH及GSH水平上調(diào),MDA水平下降(P<0.01);HG+si-con組相比,HG+si-CACNB2組miR-409-3p相對(duì)表達(dá)量、LDH及GSH水平升高(P<0.01),MDA水平下降(P<0.01);與HG+miR-409-3p+pcDNA組相比,HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組miR-409-3p相對(duì)表達(dá)量、LDH及GSH水平下降,MDA水平升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表3。

表3 過(guò)表達(dá)miR-409-3p、干擾CACNB2對(duì)HRCEC細(xì)胞LDH、GSH和MDA水平的影響

注:A為WB法檢測(cè)HRCEC細(xì)胞CACNB2蛋白表達(dá);B為免疫熒光法檢測(cè)HRCEC細(xì)胞ROS水平。圖3 過(guò)表達(dá)miR-409-3p、干擾CACNB2對(duì)HRCEC細(xì)胞CACNB2蛋白和ROS水平的影響

2.4過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HG誘導(dǎo)HRCEC細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比,HG組HRCEC細(xì)胞Cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P<0.01),Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01);與HG+miR-con組相比,HG+miR-409-3p組HRCEC細(xì)胞Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01);與HG+si-con組相比,HG+si-CACNB2組HRCEC細(xì)胞Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2水平上升(P<0.01);與HG+miR-409-3p+pcDNA組相比,HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組HRCEC細(xì)胞Cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表達(dá)量下降(P<0.01),見(jiàn)圖4、表4。

表4 過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HRCEC細(xì)胞凋亡率及Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

注:A為WB法檢測(cè)HRCEC細(xì)胞Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá);B為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HRCEC細(xì)胞凋亡。圖4 過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HG誘導(dǎo)HRCEC細(xì)胞的影響

2.5過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HG誘導(dǎo)HRCEC細(xì)胞炎癥因子分泌情況的影響 HG組IL-6、IL-18及IL-1β高于對(duì)照組(P<0.01);與HG+miR-con組相比,HG+miR-409-3p組IL-6、IL-18及IL-1β下降(P<0.01);HG+si-CACNB2組IL-6、IL-18及IL-1β水平低于HG+si-con組(P<0.01);與HG+miR-409-3p+pcDNA組比較,HG+miR-409-3p+ pcDNA-CACNB2組IL-6、IL-18及IL-1β水平升高(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HRCEC細(xì)胞IL-6、IL-18和IL-1β分泌水平的影響

2.6過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HG誘導(dǎo)HRCEC細(xì)胞VEGF和ICAM的影響 HG組、HG+miR-409-3p+pcDNA-CACNB2組VEGF、ICAM蛋白表達(dá)量分別高于對(duì)照組和HG+miR-409-3p+pcDNA組,HG+miR-409-3p組、HG+si-CACNB2組的RGF、ICAM蛋白表達(dá)量分別低于HG+miR-con組、HG+si-con組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖5、表6。

表6 過(guò)表達(dá)miR-409-3p表達(dá)和干擾CACNB2對(duì)HRCEC 細(xì)胞VEGF和ICAM蛋白表達(dá)的影響

圖5 WB法檢測(cè)HRCEC細(xì)胞VEGF和ICAM蛋白表達(dá)

3 討 論

HRCEC細(xì)胞的增殖是眼部新血管生成的主要原因,同時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)紊亂,分泌過(guò)量ROS,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,引起機(jī)體的致炎指標(biāo)的過(guò)度表達(dá),造成機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂[8-9]。因此,抑制HRCEC細(xì)胞的增殖及致炎因子分泌、平衡氧化應(yīng)激系統(tǒng)對(duì)抑制DR進(jìn)程具有積極作用。miRNA參與人類多種疾病的進(jìn)程中,其中包括糖尿病[10],由于機(jī)體miRNA的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,因此關(guān)于其調(diào)控疾病的機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。本研究通過(guò)培養(yǎng)暴露于高糖環(huán)境的HRCEC細(xì)胞,模擬糖尿病患者體內(nèi)高血糖狀態(tài),分析HRCEC細(xì)胞miR-409-3p、CACNB2表達(dá)情況,并研究miR-409-3p通過(guò)靶向結(jié)合CACNB2對(duì)HRCEC細(xì)胞的氧化應(yīng)激、凋亡、炎癥的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制。

有研究發(fā)現(xiàn),miR-409-3p具有調(diào)節(jié)抗血管生成作用[11],血漿miR-409-3p水平在1型糖尿病發(fā)展的過(guò)程中逐漸降低,經(jīng)過(guò)治療后隨著病情緩解而有所提高,靶點(diǎn)預(yù)測(cè)工具將miR-409-3p與免疫和代謝相關(guān)信號(hào)聯(lián)系起來(lái)[12]。CACNB2基因與夜盲癥有關(guān)并且可改變小鼠的視網(wǎng)膜形態(tài)[13-14],其可能通過(guò)鈣通道參與DR的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn),miR-409-3p能夠通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)CACNB2抑制新血管生成;同時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miR-409-3p或敲減CACNB2均提高了LDH及GSH水平,并使ROS及MDA水平下調(diào),證明了miR-409-3p可以平衡機(jī)體氧化應(yīng)激水平。另外,本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)的miR-409-3p抑制了高糖誘導(dǎo)的HRCEC細(xì)胞炎癥因子IL-6、IL-18及IL-1β的分泌,降低了HRCEC細(xì)胞的炎癥反應(yīng),抑制了DR的進(jìn)程。而miR-409-3p的這種作用能夠被過(guò)表達(dá)CACNB2明顯減弱。這提示,miR-409-3p參與調(diào)節(jié)抗血管生成作用可能與其靶向結(jié)合CACNB2調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)相關(guān)。

研究顯示,視網(wǎng)膜色素上皮中VEGF的表達(dá)和釋放與CACNB2有關(guān),并通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)證明了這一論點(diǎn)[15]。有研究發(fā)現(xiàn),VEGF是血管生成和糖尿病視網(wǎng)膜新生血管的形成中起至關(guān)重要的作用的能量底物[16],抑制VEGF可防止眼部新生血管形成。在DR患者血清ICAM水平呈高表達(dá),提示其與微血管損傷密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果證明,過(guò)表達(dá)miR-409-3p降低了HG環(huán)境下HRCEC細(xì)胞中VEGF、ICAM蛋白表達(dá)量。本研究雖然探討了miR-409-3p通過(guò)靶向CACNB2調(diào)控DR作用機(jī)制,但不足之處在于未研究miR-409-3p在不同嚴(yán)重程度DR中的作用,下一步研究重點(diǎn)在于miR-409-3p對(duì)DR病情進(jìn)展的影響。

綜上所述,miR-409-3p可促進(jìn)HG誘導(dǎo)的HRCEC細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制與調(diào)控CACNB2有關(guān),可為DR的治療提供新靶點(diǎn)。