林開榮,胡宏媛,劉曉燕

萬寧市人民醫(yī)院產(chǎn)科,海南萬寧 571500

流行病學(xué)調(diào)查顯示,妊娠期高血壓(HDP)是導(dǎo)致全球孕產(chǎn)婦不良事件和新生兒不良結(jié)局的主要原因[1]。相關(guān)報(bào)道表明,HDP具有家族遺傳傾向,許多遺傳基因在HDP的發(fā)生發(fā)展中扮演者重要角色[2]。目前研究證實(shí),包括一氧化氮合成酶(eNOS)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種基因多態(tài)性與HDP進(jìn)展密切相關(guān)[3-4],但HDP發(fā)生的潛在風(fēng)險(xiǎn)及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。多聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP-1)是PARP家族中的重要成員,其主要作用為DNA的損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。有研究表明,PARP-1的不同位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性變化與許多疾病的遺傳易感性相關(guān),特別是rs1805407、rs1805414、rs3219090 3個(gè)位點(diǎn);然而,PARP-1與HDP的相關(guān)性及其在HDP中的調(diào)控機(jī)制尚鮮見報(bào)道[5]。有研究還顯示,PARP-1可以在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮中介效應(yīng),通過核因子-κB(NF-κB)信號通路介導(dǎo)組織炎癥損傷、病理生理變化等過程[6]。作為一種核轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB已經(jīng)被證實(shí)參與了機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄和凋亡[7]。NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)作用在腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病、重癥感染方面發(fā)揮著重要作用[8]。由于HDP本身的特征也是機(jī)體的過度炎癥反應(yīng),因此,NF-κB可能在PARP-1參與HDP發(fā)病中起到了一定作用。本研究擬探討PARP-1基因多態(tài)性與HDP的相關(guān)性,同時(shí)基于NF-κB通路探討其潛在的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2021年8月至2022年6月在本院就診的80例HDP孕婦作為HDP組,以及同期80例健康孕婦作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HDP診斷符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》[9];(2)單胎妊娠;(3)無其他妊娠期并發(fā)癥。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)妊娠前存在高血壓及合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病者;(2)惡性腫瘤及合并嚴(yán)重臟器功能障礙的患者;(3)人工授精、試管嬰兒等輔助生殖技術(shù)受孕者;(4)存在交流障礙或精神類疾病者。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合赫爾辛基宣言,所有孕婦知情同意,并簽署書面文件。

1.2資料收集 收集兩組孕婦年齡、體重指數(shù)(BMI)、孕周、胎次、家庭收入、受教育水平等一般資料。兩組孕婦年齡、BMI、孕周等比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較或n)

1.3實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 于孕中期(14～18周)時(shí)抽取孕婦靜脈血5 mL,采用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測兩組孕婦血管內(nèi)皮生長因子受體-1(sFlt-1)和胎盤生長因子(PLGF),計(jì)算sFlt-1/PLGF;(2)于孕22～26周時(shí),結(jié)合產(chǎn)科三維超聲檢查測定孕婦子宮動(dòng)脈搏動(dòng)指數(shù)(UAPI),以兩側(cè)UAPI的平均值為衡量指標(biāo)。

1.4PARP-1基因多態(tài)性分析 在禁食12 h后,采集孕婦肘靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后分成3 mL和2 mL兩份,2 mL血液標(biāo)本用作提取DNA進(jìn)行不同位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測,3 mL血液標(biāo)本靜置后置于4 ℃冰箱內(nèi)保存,用以測定血清中PARP-1、NF-κB、髓樣分化因子88(MyD88)和Toll樣受體7(TLR7) mRNA蛋白表達(dá)情況。單核苷酸多態(tài)性檢測方法如下:(1)取2 mL EDTA抗凝管血液,3 000 r/min離心5 min(離心半徑7.5 cm)分離血漿,-70 ℃冰箱冷藏。(2)采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法測定PARP-1基因rs1805407、rs1805414、rs3219090 3個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性,具體操作步驟如下:①按常規(guī)酚-氯仿抽提方法提取外周血DNA。②應(yīng)用Primer3軟件設(shè)計(jì)3個(gè)基因不同位點(diǎn)引物,由美國AB公司設(shè)計(jì)合成。rs1805407位點(diǎn)的上游引物序列為5′-TAGGGTTGGGTCTAGAGCTTG-3′,下游引物序列為5′-ACAGAGCAGAAACACCAAGAT-3′;rs1805414位點(diǎn)的上游引物序列為5′-TGCTTCCCTTGCTCCTGGTTC-3′,下游引物序列為5′-GGGGGCAAGGTCTGTTAGTGG-3′;rs3219090位點(diǎn)的上游引物序列為5′-TACGATCTATGCGACCTGAC-3′,下游引物序列為5′-CGAGTTCAGTTGCTGCATC-3′。探針序列為FAM-TATGCCAGTCTTACCTGCTG-MGB,HEX-AC TACTCTGAATGCAGCTGCT-MGB。③PCR反應(yīng)體系:共25 μL,包括10 pmol/L引物1 μL,DNA模板約2 μL,200 μmol/L dNTPs 20 μL,1 U Taq聚合酶1 μL,1.5 mmol/L MgCl21 μL。PCR反應(yīng)條件:96 ℃預(yù)變性 6 min,94 ℃ 40 s,52 ℃ 60 s,72 ℃ 50 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。④限制性內(nèi)切酶MspⅠ、CviQ Ⅰ酶解。⑤采用瓊脂糖凝膠電泳鑒別基因型。⑥紫外光照相儀進(jìn)行拍照。采用Bio-Rad C FX manager 3.0 軟件進(jìn)行基因型分析。采用Apaman探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測3個(gè)位點(diǎn)的基因型。

1.5PARP-1基因和NF-κB通路蛋白及mRNA表達(dá)水平檢測

1.5.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測PARP-1、NF-κB、MyD88、TLR7的mRNA表達(dá)水平 取3 mL血液標(biāo)本采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),分別裝在100 μL EP管中,-70 ℃保存;然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞質(zhì),保留細(xì)胞核。采用Trizol試劑盒提取外周血PBMC中的總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后采用PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為10 μL:100 ng/μL的cDNA 0.5 μL,SYBR Green Master Mix 5 μL,10 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL,RNase-Free H2O 3.7 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。Trizol試劑盒由瑞士Roche公司提供,PCR儀由美國Bio-Rad公司提供,SYBR Green Master Mix試劑盒由賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供,PCR引物由上海科瑞生物科技有限公司提供,引物序列見表2。

表2 PCR引物序列

1.5.2Western blotting法檢測PARP-1、NF-κB、MyD88和TLR7蛋白表達(dá) 采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將HDP組患者的單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(四季青公司)的培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后胰酶消化。使用細(xì)胞裂解液裂解并收集蛋白樣品,取總蛋白20 μg,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,然后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入1∶500稀釋的一抗[兔抗人PARP-1、NF-κB、MyD88和TLR7單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),鼠抗人β-actin單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)],4 ℃孵育過夜;TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h;TBST洗膜后,使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑避光反應(yīng)15 min。應(yīng)用Tanon 4600全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白顯影,應(yīng)用Image J圖像分析軟件對條帶進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參,獲得PARP-1、NF-κB、MyD88、TLR7蛋白相對表達(dá)量。同時(shí),分別在3、6、12、24 h 4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)檢測PARP-1蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值作為最終結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1兩組孕婦實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、PARP-1基因多態(tài)性和相關(guān)基因表達(dá)情況比較 HDP組sFlt-1、sFlt-1/PLGF水平,PARP-1 mRNA、TRL7 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB mRNA相對表達(dá)量,以及PARP-1、TRL7、MyD88和NF-κB蛋白相對表達(dá)量均高于對照組,PARP-1基因rs1805414位點(diǎn)CC基因型頻率高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3、4及圖1～3。

注:A為CC基因型;B為TC基因型;C為TT基因型。圖1 rs1805414多態(tài)位點(diǎn)基因型分布

注:M為marker,1、3為CC基因型,2、4為TC基因型,5、6為TT基因型。圖2 rs1805414多態(tài)性位點(diǎn)PCR-RFLP法酶切電泳圖

注:A為HDP組隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長,PARP-1 mRNA相對表達(dá)量逐漸增加,在6、24 h最為明顯;B為HDP組PARP-1蛋白表達(dá)量逐漸增加,但是這種增加與mRNA在變化時(shí)間上并不完全一致;C為HDP組蛋白酶激活受體(PAR)蛋白表達(dá)量逐漸增加。圖3 PARP-1蛋白表達(dá)和PAR蛋白修飾

表3 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、PARP-1基因多態(tài)性比較或n)

表4 兩組PARP-1、NF-κB、MyD88和TLR7 mRNA和蛋白表達(dá)情況比較

2.2影響HDP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的Logistic回歸模型分析 Logistic回歸模型分析顯示,sFlt-1/PLGF(OR=1.236)、PARP-1 mRNA(OR=107.998)及PARP-1基因rs1805414位點(diǎn)CC基因型(OR=3.788)是HD患者發(fā)生子癇前期(PE)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響HDP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的Logistic模型回歸分析

2.3PARP-1表達(dá)與NF-κB通路關(guān)鍵蛋白及mRNA相對表達(dá)量的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示,PARP-1 mRNA與TRL7、MyD88和NF-κB mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.782、0.688、0.903,均P<0.001);PARP-1蛋白相對表達(dá)量與TRL7、MyD88和NF-κB蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.833、0.845、0.907,均P<0.001)。

3 討 論

目前,關(guān)于HDP疾病的病因機(jī)制研究尚不明確,現(xiàn)有的證據(jù)表明機(jī)體免疫狀態(tài)的失衡對于HDP的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[10]。另外,由于HDP存在遺傳傾向,這種被證實(shí)是通過HDP易感基因之間相互作用和表觀遺傳學(xué)功能改變的途徑來發(fā)揮作用的[11]。而關(guān)于HDP易感基因的研究主要是通過分析其基因表達(dá)情況和不同位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性來實(shí)現(xiàn)的[12],通過分析不同人群中其基因頻率的區(qū)別判斷某個(gè)基因與某種疾病的關(guān)聯(lián)性?；?qū)W研究對于揭示HDP深層次的病因?qū)W具有一定的作用。

本研究結(jié)果顯示,HDP組sFlt-1、sFlt-1/PLGF水平,PARP-1、TRL7、MyD88、NF-κB mRNA水平,以及PARP-1、TRL7、MyD88、NF-κB蛋白相對表達(dá)量高于對照組,PARP-1基因rs1805414位點(diǎn)CC基因型高于對照組,且經(jīng)Logistic回歸模型分析顯示,sFlt-1/PLGF、PARP-1 mRNA及PARP-1基因rs1805414位點(diǎn)CC基因型是發(fā)生PE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。分析原因:(1)關(guān)于sFlt-1 、PLGF 、sFlt-1/PLGF與HDP的相關(guān)性有研究證實(shí),且已被指南推薦用于早期預(yù)測[13]。胎盤生長因子具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能,具有促進(jìn)血管生成及擴(kuò)血管的作用,對胎盤的正常生長發(fā)育具有重要作用;而與其高度特異性結(jié)合的受體是血管內(nèi)皮生長受體-1,二者具有高度拮抗作用,健康孕婦血清sFlt-1、PLGF分泌呈峰形,到孕29～32周時(shí)達(dá)到高峰,二者呈正相關(guān)[14];而在HDP患者中存在sFlt-1分泌過多而PLGF分泌不足,導(dǎo)致血管生成失衡,滋養(yǎng)層侵襲不夠,導(dǎo)致母體血管內(nèi)皮功能障礙,最終導(dǎo)致HDP。(2)PARP-1作為真核細(xì)胞中多功能蛋白修飾酶家族的重要成員之一,在體內(nèi)主要參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。近年來研究表明,PARP-1在重癥感染時(shí)可出現(xiàn)高表達(dá),并通過調(diào)控多效性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),促進(jìn)下游炎性因子的釋放,形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)瀑布反應(yīng),導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙[15]。相關(guān)研究還表明,炎癥相關(guān)基因家族中的白細(xì)胞基因家族和PARP-1基因具有相關(guān)性[16],這種相關(guān)性使得PARP-1基因在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中的DNA修復(fù)、基因穩(wěn)態(tài)等過程中發(fā)揮重要作用。(3)rs1805414位點(diǎn)作為PARP-1基因最為常見的位點(diǎn),有研究指出,堿基T突變?yōu)镃后導(dǎo)致編碼的纈氨酸(Val)轉(zhuǎn)換為丙氨酸(Ala),引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而影響PARP-1的生物學(xué)功能[17]。有研究表明,PARP-1基因rs1805414位點(diǎn)的CC基因型增多與許多癌癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),如胃癌、甲狀腺癌、宮頸癌、口腔癌等,且該位點(diǎn)的SNP與癌癥患者的預(yù)后也存在一定關(guān)聯(lián)[18-20]。本研究結(jié)果也顯示,PARP-1基因rs1805414位點(diǎn)CC基因型是發(fā)生PE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

有研究表明,炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要過程為Toll樣受體(TLRs)和其相關(guān)細(xì)胞內(nèi)信號分子構(gòu)成的信號通路,特別是TLR7與NF-κB信號分子是一個(gè)關(guān)鍵的受體信號[21]。相關(guān)研究顯示,TLR7與NF-κB信號分子構(gòu)成的信號通路在增加乳腺癌細(xì)胞侵襲力方面具有重要作用,TLR7的表達(dá)水平在乳腺癌細(xì)胞中急劇升高[22]。在炎癥反應(yīng)方面,TLR7通過MyD88依賴性或非依賴性途徑(TRIF途徑)啟動(dòng)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活炎癥信號。目前,MyD88在炎癥介導(dǎo)方面的具體機(jī)制尚不清楚,但有研究顯示,MyD88在乳腺炎性細(xì)胞、漿細(xì)胞中呈高表達(dá),乳腺癌組織中的MyD88基因和蛋白表達(dá)水平也高于周圍正常組織[23]。NF-κB作為一組真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,幾乎存在于所有有核細(xì)胞內(nèi),主要發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥反應(yīng)。一項(xiàng)不同HDP分期的研究中指出,重度PE患者體內(nèi)NF-κB表達(dá)水平明顯高于輕度PE和HDP[24],這可能是由于發(fā)生PE后胎盤局部組織發(fā)生缺血缺氧損傷,許多細(xì)胞因子、氧自由基在蛋白酶和蛋白激酶的作用下發(fā)生IKB激酶磷酸化,激活NF-κB信號通路,引起炎癥反應(yīng),而炎癥因子會(huì)進(jìn)一步激活NF-κB信號通路形成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示,PARP-1與TRL7、MyD88和NF-κB mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān);PARP-1蛋白相對表達(dá)量與TRL7、MyD88和NF-κB蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)。也就是說,PARP-1基因及其表達(dá)產(chǎn)物與NF-κB信號通路的3個(gè)關(guān)鍵蛋白TRL7、MyD88和NF-κB存在高度相關(guān)性,這為揭示PARP-1基因與HDP的關(guān)系提供了新的思路。有學(xué)者認(rèn)為,PARP-1與NF-κB為共活化子,使用PARP-1抑制劑抑制PARP-1基因表達(dá)后也會(huì)降低促炎因子的表達(dá)[25]。也有數(shù)據(jù)表明,PARP-1與NF-κB基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠在體內(nèi)形成一個(gè)穩(wěn)定的免疫沉淀復(fù)合物[26]。動(dòng)物研究表明,在心肌細(xì)胞中寄生的克魯氏原蟲能夠誘導(dǎo)持續(xù)的PARP-1活化并與線粒體中的活性氧分子形成正反饋,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)持續(xù)的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,增強(qiáng)了NF-κB信號通路的促炎作用[27]。一項(xiàng)基礎(chǔ)研究顯示,采用脂多糖(LPS)作用于Ana-1細(xì)胞,LPS作用后能夠促進(jìn)NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,而PARP-1抑制劑能夠阻斷這個(gè)過程,說明PARP-1的活化確實(shí)對NF-κB介導(dǎo)的信號通路起到了作用[28]。

本研究的局限性在于:僅評估了PARP-1基因3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性及相關(guān)信號通路與HDP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,可能無法完全解釋PARP-1基因多態(tài)性與HDP的關(guān)系,后期需要檢查更多的基因位點(diǎn)以驗(yàn)證PARP-1基因多態(tài)性與HDP的關(guān)系。另外,由于HDP患者存在明顯的種族差異和群體異質(zhì)性,本研究對我國研究人群的參考意義較大,而對于國外其他人種的參考意義有所降低;限于樣本量較小,本研究尚未對HDP不同嚴(yán)重程度的孕婦PARP-1基因多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證,后期需要增加樣本量,針對不同嚴(yán)重程度的患者來論證。

綜上所述,PARP-1基因表達(dá)水平及多態(tài)性與HDP發(fā)病密切相關(guān),特別是rs1805414位點(diǎn)CC突變可作為HDP遺傳易感性的敏感指標(biāo);NF-κB信號通路在PARP-1參與HDP發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。