羅阿蓉，李完波，王志勇

(集美大學水產(chǎn)學院、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建廈門 361021)

0 引言

大黃魚是我國養(yǎng)殖量最大的海水魚類，但各種病害頻發(fā)，而且病原復(fù)雜多樣、防控困難，使養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大損失。從大黃魚自身的免疫機制入手，闡明其免疫抗病機制，可為制定防治措施提供理論基礎(chǔ)[1-3]。本課題組前期對81尾1.5齡健康大黃魚脾臟進行了轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合全基因組測序數(shù)據(jù)進行表達數(shù)量性狀位點分析(expression quantitative trait locus，eQTL)，發(fā)掘出諸多調(diào)控免疫相關(guān)靶基因的順式作用eQTL(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這些靶基因有的在免疫系統(tǒng)中充當關(guān)鍵樞紐，如參與免疫調(diào)節(jié)的硫酸軟骨素蛋白聚糖4(chondroitin sulfate proteoglycan 4，Cspg4)基因。調(diào)控Cspg4基因的eQTL中最顯著的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點位于脂質(zhì)磷酸磷酸酶相關(guān)蛋白1型(lipid phosphate phosphatase-related protein type 1，lppr1)的內(nèi)含子中。

Cspg4是一種由硫酸軟骨素和核心蛋白組成的具有多個亞結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白，在細胞生長、連接、遷移和細胞外基質(zhì)中起作用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Cspg4基因在人類多種惡性腫瘤細胞及組織中高表達，如惡性黑色素瘤[4]、成膠質(zhì)細胞瘤[5]、乳腺癌[6]、頭頸腫瘤[7]、胰腺腫瘤[8]和難治性混合性白血病[9]等。它能促進腫瘤細胞的多種生物學行為，如增殖、運動、侵襲和抗凋亡，這些行為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[10-11]。人類和犬類的Cspg4氨基酸序列具有82%的同源性，Riccardo等[12]研究發(fā)現(xiàn)人的Cspg4 DNA能使犬口腔惡性黑色素瘤中Cspg4特異性免疫和生存期延長，針對Cspg4的異種疫苗能夠克服宿主對“自我”抗原的無反應(yīng)性，對治療犬類惡性黑色素瘤初步有效。另外研究者們利用模式生物也對Cspg4基因進行了多方面的研究。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)Cspg4在斑馬魚胚胎發(fā)育中通過調(diào)控Wnt/平面細胞極性信號通路調(diào)控體軸組織，而Cspg4的過表達還會導(dǎo)致睫狀視網(wǎng)膜動脈阻塞。受Cspg4基因座的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在沒有心功能不全或纖維脂肪癥、掌跖角化病和脫發(fā)的情況下，橋粒斑蛋白(desmoplakin，Dsp)的缺失可導(dǎo)致小鼠致死性心律失常，類似人類的心臟皮膚綜合癥[14]。鼠體內(nèi)還存在Cspg4同源蛋白的神經(jīng)元膠原抗原(neuron-glia antigen2，Ng2)。Zhu等[15]利用細菌人工染色體修飾技術(shù)，制備了在Ng2陽性(Ng2+)細胞中特異性表達紅色熒光蛋白DsRed或噬菌體Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ng2+細胞在體內(nèi)外均可形成原生質(zhì)星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。Wilms等[16]證明脊椎動物特異性氧化還原酶谷氧還蛋白2 (Grx2c)的胞漿異構(gòu)體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Sp-1的氧化還原狀態(tài)，使其與Cspg4基因的啟動子和增強子區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致編碼蛋白水平的增加，從而增強了膠質(zhì)細胞和膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。

本研究就上述Cspg4基因的表達調(diào)控機制進行初步探索。通過PCR產(chǎn)物的Sanger測序驗證該eQTL區(qū)域中最顯著的SNP位點的真實性，隨后構(gòu)建Cspg4基因候選啟動子區(qū)不同長度缺失片段的重組質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測重組質(zhì)粒的活性并確定Cspg4基因的核心轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，在此基礎(chǔ)上插入此基因的不同單倍型調(diào)控序列進行驗證，為揭示該eQTL與靶基因之間的表達調(diào)控方式打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本實驗室前期對81尾1.5齡的健康大黃魚進行了全基因組重測序(從鰭條提取DNA)和轉(zhuǎn)錄組測序(從脾臟提取RNA)，所用大黃魚來自寧德市三都澳養(yǎng)殖漁排。DNA和RNA的提取按照常規(guī)方法進行，動物實驗操作遵循集美大學水產(chǎn)學院動物倫理委員會的要求進行。

1.1.2 菌株和細胞

大腸桿菌菌株DH5α CompetentE.coliStrain購自南京諾唯贊生物科技有限公司；螢火蟲pGL3-basic載體菌株、內(nèi)參海參pRL-TK載體菌株為本實驗室保存，HEK 293T細胞購自上海富衡生物科技有限公司，經(jīng)傳代、凍存保存于本實驗室。

1.1.3 引物

本研究所用引物由廈門鉑瑞生物科技有限公司和生工生物工程(上海)有限公司合成，其名稱及序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列及名稱Tab.1 Sequence and name of primers used in this experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 SNP位點驗證

前期研究獲得了調(diào)控Cspg4基因的順式eQTL，其中最顯著的eQTL位于大黃魚基因組17號染色體13952653 bp的一個SNP(Chr17_13952653)上。為了檢驗該SNP是否真實存在而非測序錯誤，搜尋用于eQTL分析的81個個體的全基因組重測序數(shù)據(jù)，獲取該SNP位點的基因型信息，并進行匯總統(tǒng)計。同時，從參考基因組上獲取該SNP兩側(cè)各250 bp的序列，使用NCBI網(wǎng)站“Primer-BLAST”在線工具分別設(shè)計PCR引物(chr17_13952653-F/R，見表1)。然后，根據(jù)基因組重測序獲得該SNP位點的基因型，每個位點、每種基因型分別挑選若干個體的鰭條DNA 為模板，使用高保真 Taq 酶進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物送至廈門鉑瑞生物科技有限公司進行Sanger測序，并將測序結(jié)果與基因組重測序結(jié)果進行比較。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。取 2 μL PCR反應(yīng)后產(chǎn)物，用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物是否條帶單一。

1.2.2Cspg4啟動子活性分析

從大黃魚參考基因組中獲得Cspg4基因啟動子區(qū)序列信息，以大黃魚鰭條DNA為模板，擴增Cspg4候選啟動子序列。為了鑒定大黃魚Cspg4啟動子序列中的核心區(qū)域，對其進行不同長度片段的截短。使用2× Phanta?Max Master Mix，帶有SmaⅠ和HindⅢ兩個酶切位點的相應(yīng)引物(pGL3-Cspg4-P-R，pGL3-Cspg4-P1～P7-F，見表1)分別進行擴增，以獲得全長啟動子和各個截短的片段。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 4 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5min；10 ℃保存。根據(jù)各試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物純化和pGL3-Cspg4-P1～P7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞并進行雙熒光素酶活性測定。

為預(yù)測大黃魚Cspg4基因的5' UTR上游候選啟動子序列中潛在核心區(qū)域的分布，本研究使用在線程序神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)啟動子Neural Network Promoter Prediction預(yù)測BDGP，閾值設(shè)為0.8。

1.2.3 Chr17_13952653位點不同單倍型序列對Cspg4基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用驗證

通過上述Cspg4啟動子活性分析實驗確定啟動子的核心區(qū)域后，在核心區(qū)前插入含Chr17_13952653位點的序列，以此來研究包含該SNP位點的序列對靶基因Cspg4啟動子的調(diào)控情況。

根據(jù)大黃魚參考基因組設(shè)計引物(pGL3-chr17-1kb-F/R，見表1)擴增包含Chr17_13952653位點的序列，其片段大小為1157 bp，2條引物分別帶有MluI與SmaI酶切位點。從81個重測序樣品中選取Chr17_13952653位點基因型為AA和CC的個體，以其鰭條DNA為模板，使用2× Phanta?Max Master Mix進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 70 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5min；4℃保存。根據(jù)各試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物純化和pGL3-Cspg4-A/C重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞并進行雙熒光素酶活性測定。

1.2.4Cspg4基因不同單倍型調(diào)控序列生物信息學分析

為了計算包含Chr17_13952653位點的調(diào)控序列內(nèi)的連鎖不平衡，本研究提取區(qū)域內(nèi)所有的SNP及InDel并進行可視化展示，具體步驟如下：

1)用GATK V3.8[17]的HaplotypeCaller模塊，提取含Chr17_13952653位點的調(diào)控序列1157 bp內(nèi)所有的SNP及InDel，用CombineVariants模塊合并VCF文件。

2)通過PopLDdecay V3.41[18]計算該區(qū)域內(nèi)的連鎖不平衡，即每個SNP或InDel之間的r2值，統(tǒng)計與Chr17_13952653該SNP強連鎖的SNP或InDel。

3)通過R 4.0.3中的TrackViewer包，對強連鎖的SNP或InDel在基因組上的位置，進行可視化展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最顯著eQTL突變位點的驗證

2.1.1 最顯著SNP位點所在短片段序列擴增與測序結(jié)果

含Chr17_13952653 SNP位點的短片段擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1所示，在266 bp左右有單一條帶，符合預(yù)期結(jié)果。將上述擴增產(chǎn)物進行Sanger測序，測序結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)各測序樣品該SNP位點的基因型與基因組重測序獲得的結(jié)果完全一致，純合子測序峰圖為單峰，雜合子測序峰圖為雙峰。以上結(jié)果表明該顯著SNP位點均真實存在于實驗群體中。

2.1.2 最顯著eQTL位點的基因型統(tǒng)計

從81個全基因組重測序數(shù)據(jù)中，獲取顯著影響Cspg4基因表達的Chr17_13952653位點的基因型，結(jié)果顯示Chr17_13952653位點為A/C突變，A的頻率為0.34，C的頻率為0.66。其中AA基因型個體4個，AC基因型個體47個，CC基因型個體30個。

2.2 Cspg4啟動子活性分析

2.2.1Cspg4候選啟動子序列分析及潛在核心區(qū)域預(yù)測

本研究成功擴增到Cspg4基因2076 bp的啟動子序列，另包含20 bp的外顯子1的部分編碼序列，具體序列信息見圖3。使用在線程序BDGP啟動子預(yù)測大黃魚Cspg4候選啟動子序列中潛在的核心區(qū)域，結(jié)果表明有1個潛在的核心區(qū)域存在于該基因的候選啟動子序列中，位置及得分見表2，序列具體位置如圖3所示。

表2 大黃魚Cspg4候選啟動子序列中預(yù)測的核心區(qū)域的分布Tab.2 The distribution of predicted core regions within the candidate promoter sequence of Cspg4 in large yellow croaker

2.2.2Cspg4候選啟動子區(qū)活性分析

雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，Cspg4基因候選啟動子區(qū)不同長度缺失片段的相對熒光活性由強到弱的順序為：P4、P3、P7、P2、P1、P6、P5(見圖4)，其中pGL3-Cspg4-P4重組質(zhì)粒的啟動子活性最高。pGL3-Cspg4-P1～P3重組質(zhì)粒相較于pGL3-Cspg4-P4的啟動子活性逐漸降低，表明在-2076～-1202區(qū)域可能存在負調(diào)控元件(negative regulatory element，NRE)；在-1202～-762和-190～+20區(qū)域可能為該啟動子的核心區(qū)域，存在基本調(diào)控元件；而pGL3-Cspg4-P5～P7重組質(zhì)粒的啟動子活性逐漸增強，表明在-762～-190區(qū)域也可能存在負調(diào)控元件。

2.3 Chr17_13952653位點不同單倍型序列對Cspg4基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用

據(jù)上述大黃魚Cspg4候選啟動子區(qū)活性分析，推測可知在-1202～-762和-190～+20區(qū)域可能為該啟動子的核心區(qū)域。本研究選擇pGL3-Cspg4-P7(-190～+20)作為Cspg4基因的核心區(qū)域，在此核心區(qū)域前插入含Chr17_13952653位點共1157 bp的調(diào)控序列，以此來研究該序列對靶基因Cspg4啟動子的表達調(diào)控情況。

雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，pGL3-Cspg4-P7-A和pGL3-Cspg4-P7-C重組質(zhì)粒的相對熒光活性均顯著低于對照組pGL3-Cspg4-P7，而pGL3-Cspg4-P7-A和pGL3-Cspg4-P7-C重組質(zhì)粒之間相對熒光活性無顯著差別，pGL3-Cspg4-P7-C重組質(zhì)粒活性略低(如圖5，P<0.05)，表明含Chr17_13952653 位點的1157 bp序列中可能含有減弱啟動子活性的調(diào)控序列，即含有沉默子。

連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，包含Chr17_13952653 位點的1157 bp 序列中有14個r2=1的與Chr17_13952653位點強連鎖的SNP位點(見表3、圖6)。這提示該序列對Cspg4基因轉(zhuǎn)錄的弱化作用，可能也涉及諸多強連鎖堿基的協(xié)同作用。

表3 Cspg4不同單倍型調(diào)控序列區(qū)域內(nèi)連鎖不平衡分析Tab.3 Results of linkage disequilibrium in the region of different allele sequences of Cspg4

3 討論

表達QTL分析被認為是定位基因表達調(diào)控位點的一種有效方法。為了解大黃魚脾臟eQTL中挖掘到的顯著SNP位點對生物信息學分析預(yù)測到的靶基因是否存在調(diào)控作用，本研究首先通過Sanger測序驗證了81尾實驗魚中該SNP位點的基因型，進而通過構(gòu)建候選啟動子與調(diào)控序列片段的重組質(zhì)粒測定調(diào)控序列的活性。

RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子通常結(jié)合作用在基因的啟動子區(qū)，欲了解基因表達調(diào)控模式必須研究啟動子的分子結(jié)構(gòu)和功能[19]。本研究成功擴增到大黃魚Cspg4候選啟動子2096 bp序列并預(yù)測該序列中潛在的核心區(qū)域，結(jié)果表明有1個潛在的核心區(qū)域存在于該基因的候選啟動子序列中。隨后構(gòu)建Cspg4基因候選啟動子區(qū)不同長度缺失片段的重組質(zhì)粒。分析結(jié)果顯示：pGL3-Cspg4-P4重組質(zhì)粒的啟動子活性最高，而pGL3-Cspg4-P1～P3重組質(zhì)粒相較于pGL3-Cspg4-P4的啟動子活性逐漸降低。表明：在-2076～-1202區(qū)域可能存在負調(diào)控元件；在-1202～-762和-190～+20區(qū)域可能為該啟動子的核心區(qū)域，存在基本調(diào)控元件。而pGL3-Cspg4-P5～P7重組質(zhì)粒的啟動子活性逐漸增強，說明在-762～-190區(qū)域可能存在負調(diào)控元件。

在轉(zhuǎn)錄激活過程中發(fā)生的一系列級聯(lián)反應(yīng)最終會作用到核心啟動子上，直接或間接影響核心啟動子上發(fā)生的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄作用。核心啟動子是所有能轉(zhuǎn)錄調(diào)控RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄因子的終極作用靶標[20]。因此，為了研究含Chr17_13952653位點的序列對Cspg4的調(diào)控作用，據(jù)上述啟動子活性分析結(jié)果，將存在Cspg4基因的核心區(qū)域的pGL3-Cspg4-P7(-190～+20)重組質(zhì)粒作為對照組，構(gòu)建含Chr17_13952653位點的不同單倍型調(diào)控序列的重組質(zhì)粒。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，pGL3-Cspg4-P7-A和pGL3-Cspg4-P7-C重組質(zhì)粒的相對熒光活性均顯著低于對照組pGL3-Cspg4-P7，而pGL3-Cspg4-P7-A和pGL3-Cspg4-P7-C重組質(zhì)粒之間相對熒光活性無顯著差別。pGL3-Cspg4-P7-C重組質(zhì)?；钚月缘停砻骱珻hr17_13952653 位點的1157 bp序列可能為減弱啟動子活性的調(diào)控序列，但該位點的A/C變異可能不直接影響該調(diào)控序列的功能。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，該序列中有14個與Chr17_13952653位點強連鎖的SNP位點(見圖6)，且r2值均等于1(見表3)。

生物的基因組存在大量調(diào)控基因表達的序列，包括啟動子、增強子、沉默子和絕緣子等。其中的沉默子是一類主動行使抑制啟動子活性的調(diào)控元件，這些序列能招募轉(zhuǎn)錄因子到啟動子上，進而執(zhí)行特定的功能。已有研究表明許多不同類型的沉默子可影響基因調(diào)控的多個方面，如轉(zhuǎn)錄因子活性、內(nèi)含子剪接、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、3' 上游非翻譯信號識別及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配等，最終下調(diào)基因表達[21]。目前已報道的研究顯示：沉默子無特定結(jié)構(gòu)或保守序列，它們可能是一段包含有特異性阻遏蛋白結(jié)合位點的短核酸序列；也可能作為一個包含多個調(diào)控元件的復(fù)雜區(qū)域存在，如酵母HMR-E(hidden mating region-E)沉默子[22]。大部分沉默子具有非啟動子特異性的特點。Zhao等[23]報道在多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白基因(human dopamine transporter gene，hDAT)內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)一個121 bp的沉默子，它不僅可在體外下調(diào)hDAT啟動子活性，還可以使異源性SV40(simian virus 40)啟動子活性下降80%。典型沉默子對基因表達的阻遏作用表現(xiàn)出位置和方向的非依賴性，主要通過干擾轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配這一主動抑制過程調(diào)控轉(zhuǎn)錄，但也有些沉默子對此表現(xiàn)出不同程度的依賴[24]。B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)是細胞凋亡的抑制因子。Young等[25]在此基因的5' UTR中鑒定出一個約1.3 kb的負調(diào)控元件，將其插入P1啟動子下游約2.4 kb處，啟動子的活性未受影響，表明該NRE以特定位置的方式降低bcl-2 P1啟動子的表達。一些沉默子元件具有遠距離作用順式連接啟動子的特性，本研究中含Chr17_13952653位點的調(diào)控序列相對熒光活性顯著低于對照組，該結(jié)果表明在大黃魚脾臟基因中也可能存在類似沉默子抑制轉(zhuǎn)錄過程的順式作用元件。目前研究者們對大黃魚的順式調(diào)控元件及其功能的研究，主要體現(xiàn)在啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合層面。如Sun等[26]發(fā)現(xiàn)大黃魚Toll樣受體家族中tlr5m和tlr5s的基因組結(jié)構(gòu)和啟動子結(jié)構(gòu)可能存在差異，其中oct1和nf-κb結(jié)合位點可能是tlr5s啟動子的順式調(diào)控元件，nf-κb/p65通過與nf-κb結(jié)合位點結(jié)合，在tlr5s啟動子激活中發(fā)揮重要作用。Zhang等[27]發(fā)現(xiàn)大黃魚中存在對哺乳動物巨噬細胞的發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子pu.1的兩種轉(zhuǎn)錄本pu.1a和pu.1b，它們都可以通過結(jié)合其啟動子的不同E26轉(zhuǎn)化特異性基序，上調(diào)組織蛋白酶(Cathepsin S)的表達，并且它們的三個結(jié)構(gòu)域都是啟動Ctss表達的必要條件。Xu等[28]發(fā)現(xiàn)磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子stat1通過結(jié)合其啟動子區(qū)域，顯著上調(diào)了干擾素調(diào)節(jié)因子1(irf1)的啟動子活性。但是本研究在啟動子基礎(chǔ)上進一步探究eQTL分析獲得的不同單倍型調(diào)控序列對靶基因的作用，為表型與變異之間建立起連接。因此，利用啟動子、增強子、沉默子等元件構(gòu)建人工表達載體，精確調(diào)控目的基因的表達，深入研究有關(guān)基因表達調(diào)控機制可作為未來研究的基礎(chǔ)。

綜上所述，通過對大黃魚17號染色體13952653 bp前后長度為1157 bp的調(diào)控序列對靶基因Cspg4啟動子的表達調(diào)控研究，為Cspg4基因在大黃魚脾臟中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及功能研究奠定了基礎(chǔ)。但迄今為止，對該基因參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)且在大黃魚脾臟組織表達的分子機制還知之甚少，其具體表達調(diào)控方式與作用機制有待進一步深入研究。