王吉榮，史小飛，種育暉，賈令茹，萬(wàn)雪瑩，李睿旻 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海 004；.無(wú)錫聯(lián)勤保障中心衛(wèi)勤處，江蘇 無(wú)錫 4000；.景洪市第一人民醫(yī)院, 云南 西雙版納 66600）

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿且進(jìn)展迅速的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。胰腺癌發(fā)病與吸煙、肥胖、遺傳、糖尿病和飲酒等多種危險(xiǎn)因素相關(guān)，其首次確診時(shí)通常已是晚期，預(yù)后極差[1]。盡管過(guò)去10 年內(nèi)全球癌癥的生存率不斷提高，但胰腺癌的發(fā)病率在不斷提高的同時(shí)，其5 年生存率在我國(guó)胰腺癌患者中卻并未提高，僅為7%左右[2]。晚期胰腺癌的治療主要以化療為主，其中，F(xiàn)OLFIRINOX 化療方案與白蛋白結(jié)合型紫杉醇聯(lián)合吉西他濱的治療方案對(duì)胰腺癌患者的生存率有一定的提高[3]。盡管聯(lián)合化療方案對(duì)胰腺癌的治療有一定效果，但化療藥物的毒副作用與腫瘤細(xì)胞的耐藥性限制了其在胰腺癌治療中的應(yīng)用。

中醫(yī)秉承整體調(diào)理與辨證論治的治療理念，在胰腺癌的治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如緩解臨床癥狀，提高抗癌藥物的臨床效果，改善患者的生活質(zhì)量以及延長(zhǎng)患者的生命等[4]。研究表明，在中醫(yī)治療胰腺癌的用藥規(guī)律中，白術(shù)-半夏-茯苓是最常用且置信度最高的藥組。三藥協(xié)同可產(chǎn)生健脾益氣、燥濕化痰等功效[5]。中藥白術(shù)是將菊科植物白術(shù)的根莖干燥后制得，具有健脾益氣、除濕益燥的功效。其活性成分可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制胰腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)免疫代謝等[6]。中藥半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖，具有燥濕化痰、消痞散結(jié)的作用效果。半夏的化學(xué)成分包括生物堿類(lèi)、 有機(jī)酸類(lèi)、黃酮類(lèi)和糖類(lèi)等，具有抗腫瘤、 抗炎等藥理活性[7]。中藥茯苓是真菌茯苓的干燥菌核，其多糖與三萜類(lèi)化合物成分可以通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增加其他化療藥物的抗腫瘤效果以及降低其他化療藥物的毒副作用等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤效果[8]。盡管臨床上白術(shù)-半夏-茯苓藥組常用于胰腺癌的配伍治療，但其包含的活性成分復(fù)雜，具體分子作用機(jī)制尚未系統(tǒng)闡述。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以利用藥物疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)以及生物系統(tǒng)分析方法來(lái)預(yù)測(cè)藥物、疾病、靶點(diǎn)間的聯(lián)系，從而了解藥物成分對(duì)機(jī)體的潛在調(diào)控機(jī)制[9]。分子對(duì)接技術(shù)則利用計(jì)算機(jī)模擬配受體間的相互結(jié)合模式，通過(guò)一系列參數(shù)篩選出能相互結(jié)合的藥物活性成分與靶點(diǎn)蛋白，從而提高藥物開(kāi)發(fā)與分子機(jī)制驗(yàn)證的成功率[10]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)分析驗(yàn)證白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的潛在分子機(jī)制，以期為臨床使用該藥組提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藥物成分及靶點(diǎn)的收集與規(guī)范

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharamacology Database and Analysis Platform， TCMSP； https://www.tcmsp-e.com/）檢索白術(shù)-半夏-茯苓藥組的活性成分及作用靶點(diǎn)，并設(shè)定篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18。同時(shí)通過(guò)TCMSP 平臺(tái)下載藥組活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，保存為mol2 格式文件。將格式文件上傳至PharmMapper平臺(tái)（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)， 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)范圍設(shè)置為Human Protein Targets Only (v2010，2 241)，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。預(yù)測(cè)結(jié)果按照“Normalized Fit Score≥0.9，z'-score＞0”進(jìn)行篩選。將TCMSP 平臺(tái)與PharmMapper平臺(tái)搜集的活性成分作用靶點(diǎn)合并去重后，通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)活性成分的靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范。

1.2 胰腺癌靶點(diǎn)的收集

利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man; https://omim.org/）兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“pancreatic cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索， 篩選評(píng)分大于＞10 的GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)與胰腺癌相關(guān)的基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，并與OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果去重匯總。

1.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）制作白術(shù)-半夏-茯苓藥組靶點(diǎn)和胰腺癌靶點(diǎn)的韋恩圖，并通過(guò)韋恩圖提取交集靶點(diǎn)。

1.4 藥物-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物、活性成分、交集靶點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建白術(shù)-半夏-茯苓治療胰腺癌的藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將所獲取的藥組與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入在線STRING 11.5 平臺(tái) （https://cn.string-db.org/），將物種設(shè)定為 Homo sapiens，minimum required interaction score ＞0.9，其余設(shè)置為默認(rèn)值，獲取PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，篩選出白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體功能與通路富集分析

將藥組與胰腺癌交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/），將物種選擇為Homo sapiens 后進(jìn)行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析，分別篩選出前10 個(gè)生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）條目，前20 條KEGG 通路以及胰腺癌相關(guān)的靶點(diǎn)通路，并用作圖平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.7 靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將上述KEGG 的前20 條顯著差異的信號(hào)通路與相應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建白術(shù)-半夏-茯苓治療胰腺癌的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.8 核心成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

以藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中每種中藥度值排名前三的核心成分和胰腺癌相關(guān)靶點(diǎn)為研究對(duì)象，進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。具體操作如下：① 利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Chem3D 20.0 軟件和Open Babel 軟件得到能量最小化的活性成分pdb 格式文件；② 從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載網(wǎng)絡(luò)度值較高的疾病靶點(diǎn)蛋白3D 結(jié)構(gòu)，并將其導(dǎo)入PyMOL軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去水、去配體等操作，導(dǎo)出為 pdb文件；③ 運(yùn)用Autodock Tools 1.5.7 軟件將靶點(diǎn)蛋白添加非極性氫后計(jì)算Gasteiger 電荷，而原始配體添加非極性氫后檢測(cè)扭轉(zhuǎn)鍵，分別保存為pdbqt文件。用 Autogrid 模塊獲得對(duì)接活性的位點(diǎn)，用Autodock 模塊進(jìn)行藥組核心成分與胰腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接；④ 采用PyMOL 軟件將結(jié)合能最佳的前三結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分及靶點(diǎn)的收集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到白術(shù)55 個(gè)化合物，半夏116 個(gè)化合物，茯苓34 個(gè)化合物。在OB≥30%，DL≥0.18 的篩選條件下，共得到35 個(gè)活性成分化合物，其中，白術(shù) 7 個(gè)， 半夏13 個(gè)，茯苓15 個(gè)。通過(guò) PharmMapper 平臺(tái)對(duì) 35 個(gè)化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，將得到的結(jié)果與TCMSP 搜集的靶點(diǎn)匯總?cè)ブ睾?，?jīng) UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化后得到190 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)檢索OMIM 和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選匯總后共獲得1 566 個(gè)胰腺癌相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)繪制韋恩圖，得到白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的交集靶點(diǎn)共76 個(gè)（圖1）。

圖1 白術(shù)-半夏-茯苓與胰腺癌的交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 藥物-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在Cytoscape 3.9.1 軟件中導(dǎo)入白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的活性成分與交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，構(gòu)建藥物-成分-交集靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2），包括114 個(gè)節(jié)點(diǎn)（3 個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、35 個(gè)活性成分節(jié)點(diǎn)、76 個(gè)交集靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和516 條邊。其中，用拼音首字母BZ、BX、FL 分別代表白術(shù)、半夏、茯苓；首字母+數(shù)字代表每種藥物的活性成分。從圖2 可以看出，同一活性分子可作用多個(gè)靶點(diǎn)，而不同活性分子可作用同一靶點(diǎn)，說(shuō)明該藥組配伍治療胰腺癌可能是通過(guò)多成分、多基因靶點(diǎn)發(fā)揮作用的。在網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)越大，節(jié)點(diǎn)相連的線條數(shù)越多，則節(jié)點(diǎn)的度值越大，其在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用也相對(duì)越大。所有活性成分中，白術(shù)活性成分度值排名前三的是12-千里光?；?8-反式白術(shù)三醇（12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol，度值15），14-乙?；?12-千里光?；?8-反式白術(shù)三醇（14-acetyl-12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol，度值15），3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮（3β-acetoxyatractylone，度值9）；半夏活性成分度值排名前三的是黃芩素（baicalein，度值31），12,13-環(huán)氧-9-羥基十九碳-7,10-二烯酸（12,13-epoxy-9-hydroxynonadeca-7,10-dienoic acid，度值23），β-谷甾醇（beta-sitosterol，度值22）；茯苓活性成分度值排名前三的是茯苓酸A（poricoic acid A，度值22），茯苓酸B（poricoic acid B，度值22），3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛甾烯-21-酸（3beta-Hydroxy-24-methylene-8-lanostene-21-oic acid，度值21）。度值排名前10 的靶點(diǎn)分別為CA2（度值32），PIM1（度值27），ALB（度值25），MAPK1（度值21），AR（度值20），GSTP1（度值20），CASP3（度值19），PGR（度值17），BMP2（度值17），CASP7（度值15）。

圖2 藥物-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用STRING 11.5 平臺(tái)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，并將結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3）。其中，節(jié)點(diǎn)顏色越深、直徑越大代表它與其他靶點(diǎn)的相關(guān)性越大，在蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)中處于越中心的位置。對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選得到網(wǎng)絡(luò)中degree 值＞2 倍中位數(shù)值的17 個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白基因（圖4），degree 值排名前十的靶點(diǎn)蛋白基因分別是SRC、TP53、MAPK1、ESR1、JUN、RELA、FOS、AKT1、HIF1A、MAPK14。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，靶點(diǎn)degree 值越大，說(shuō)明該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的相互作用越強(qiáng)。因此，上述10 個(gè)靶點(diǎn)基因可能是白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的核心靶點(diǎn)。

圖3 白術(shù)-半夏-茯苓與胰腺癌交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)

2.4 GO 功能與KEGG 通路富集分析

將白術(shù)-半夏-茯苓與胰腺癌的交集靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 富集分析，得到P＜0.05的結(jié)果共計(jì)498 個(gè)。其中，包含生物過(guò)程（BP）條目373 個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目36 個(gè)，分子功能（MF）條目89 個(gè)。將生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能排名前十的分析結(jié)果繪制成柱狀圖（圖5）。

圖5 白術(shù)-半夏-茯苓與胰腺癌交集靶點(diǎn)的GO 富集分析

通過(guò)KEGG 分析篩選出P＜0.05 的通路共134 條，前20 條通路見(jiàn)圖6。其中，胰腺癌信號(hào)通路的潛在靶點(diǎn)有AKT1，MAPK1，MAPK8，RELA，TP53， CASP9， TGFB1， BAX， EGFR， TGFBR1，TGFBR2，VEGFA。通過(guò)進(jìn)一步分析，白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌是通過(guò)影響KRAS 下游的PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路以及TGFβ 信號(hào)通路發(fā)揮作用的（圖7）。

圖6 白術(shù)-半夏-茯苓與胰腺癌交集靶點(diǎn)的KEGG 富集分析

圖7 白術(shù)-半夏-茯苓治療胰腺癌的信號(hào)通路

2.5 靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將KEGG 富集分析得到的前20 條顯著差異的信號(hào)通路與相應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建白術(shù)-半夏-茯苓治療胰腺癌的靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖8）。該網(wǎng)絡(luò)中共75 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中 55 個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)為藥組治療胰腺癌的潛在作用靶點(diǎn)，20 個(gè)V 形節(jié)點(diǎn)代表信號(hào)通路。度值排名前10 的靶點(diǎn)為AKT1（度值19）、MAPK1（度值18）、MAPK8（度值16）、RELA（度值16）、JUN（度值16）、FOS（度值15）、BCL2（度值14）、TP53（度值13）、CASP3（度值13）、MAPK14（度值12）。

2.6 核心成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

一般而言，配受體間的結(jié)合能越小，結(jié)合越穩(wěn)定。結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol，表明配受體間有較好的結(jié)合活性[11]。為了能更好地闡述白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的可能作用機(jī)制，選取靶點(diǎn)-通絡(luò)網(wǎng)絡(luò)中胰腺癌通路相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1，MAPK1，MAPK8，RELA 和TP53，并篩選出與胰腺癌通路關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)的位于藥物-成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名前三的核心活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，茯苓酸A 與靶點(diǎn)AKT1，3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛甾烯-21-酸與靶點(diǎn)MAPK8，茯苓酸B 與靶點(diǎn)MAPK8 的結(jié)合能≤-20.93 kJ/mol，表明它們與靶點(diǎn)間有較好的結(jié)合活性。利用PyMOL軟件將穩(wěn)定結(jié)合排名前三的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理（圖9）。茯苓酸A 與靶點(diǎn)AKT1 的氨基酸殘基ALA-230/GLU-228 形成3 個(gè)氫鍵，3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛甾烯-21-酸與靶點(diǎn)MAPK8 的氨基酸殘基ILE-304 形成1 個(gè)氫鍵，茯苓酸B 與靶點(diǎn)MAPK8的氨基酸殘基LYS-288/ASN-322/GLN-317 形成4 個(gè)氫鍵，這些氫鍵可能是配體結(jié)合到相應(yīng)靶蛋白位點(diǎn)的主要作用力。

3 討論

胰腺癌是一種預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。目前臨床上治療胰腺癌倡導(dǎo)綜合姑息性手術(shù)、放化療、分子靶向治療等多學(xué)科療法[12]。中醫(yī)在治療晚期胰腺癌的目標(biāo)并不只是消滅腫瘤，其注重整體調(diào)理與辨證論治的治療方式能顯著提高患者的生活質(zhì)量與5 年生存率[13]。多數(shù)中醫(yī)認(rèn)為，胰腺癌總體屬于正虛邪實(shí)的病證，其疾病的機(jī)制可以歸納成脾虛、肝郁、痰瘀等。中醫(yī)治療胰腺癌時(shí)注重攻補(bǔ)兼施，常以健脾益氣的中藥為主，并且用疏肝理氣、利水滲濕、燥濕化痰等中藥輔助。白術(shù)-半夏-茯苓三藥協(xié)同施用可產(chǎn)生健脾化濕的功效，對(duì)相應(yīng)病證的胰腺癌患者具有良好的效果[14]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出白術(shù)-半夏-茯苓3 種中藥的主要活性成分共35 個(gè)，包括黃芩素、β-谷甾醇、茯苓酸A、茯苓酸B、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮等。黃芩素又稱(chēng)黃芩苷元，是半夏的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎等生理活性[15]。黃芩素能通過(guò)Hedgehog 通路有效抑制胰腺癌干細(xì)胞的增殖，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄機(jī)制降低抗凋亡基因Mcl-1 的表達(dá)，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素 C 的釋放以及激活半胱氨酸蛋白酶來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[16]。此外，黃芩素還可通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥反應(yīng)來(lái)降低腫瘤微環(huán)境的炎癥， 從而抑制大鼠胰腺腺泡的導(dǎo)管樣化生[17]。β-谷甾醇是一種植物甾醇類(lèi)成分，能誘導(dǎo)活化淋巴細(xì)胞來(lái)提高機(jī)體免疫力并發(fā)揮靶細(xì)胞殺傷作用，進(jìn)而抑制乳腺癌、胃癌、大腸癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]。它能抑制人胰腺癌的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，抑制其遷移與侵襲，并通過(guò) AKT/GSK-3β 信號(hào)通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。茯苓酸A 是中藥茯苓表層的主要三萜類(lèi)化學(xué)成分，可以通過(guò)Akt/mTOR 通路溫和地抑制多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。茯苓酸A 通過(guò)降低mTOR 和 p70s6K 的磷酸化來(lái)調(diào)節(jié) mTOR/p70s6k 通路，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡和自噬，極大地抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]。茯苓酸 B 能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NO 的產(chǎn)生，降低炎性細(xì)胞因子，產(chǎn)生比茯苓酸A 更高的抗炎活性[21]。白術(shù)藥用成分揮發(fā)油的主要成分是蒼術(shù)酮。MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，它能對(duì)肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及結(jié)腸癌細(xì)胞均產(chǎn)生不同程度的抑制活性[22]。

本研究中， 通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取了白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌潛在作用靶點(diǎn)蛋白相互關(guān)系的數(shù)據(jù)，構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)后分析數(shù)據(jù)得到degree 值排名前十的核心靶點(diǎn)蛋白，分別是SRC、TP53、MAPK1、ESR1、JUN、RELA、FOS、AKT1、HIF1A、MAPK14。SRC 基因編碼人原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src。Src 作為一種非受體細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞分化、增殖、黏附和遷移等。Src 活性增加可促進(jìn)癌細(xì)胞的過(guò)度增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。SRC 基因過(guò)表達(dá)與激活促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而對(duì)胰腺癌應(yīng)用酪氨酸蛋白激酶Src 抑制劑能產(chǎn)生一定的臨床治療效果[23]。TP53 是一種腫瘤抑制基因，編碼一種在細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)活性的抑癌蛋白。TP53 在75%的胰腺癌中發(fā)生突變，而這種突變會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]。MAPK1 與MAPK14是MAPK 家族的成員，它們編碼的蛋白激酶1 主要調(diào)節(jié)各種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。胰腺癌中存在 MAPK 通路的異常激活，而這與胰腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[25]。ESR1 編碼的人雌激素受體是類(lèi)固醇核受體超家族的成員，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，在促進(jìn)各種癌癥的生長(zhǎng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。它在胰腺癌細(xì)胞中表現(xiàn)出增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[26]。JUN 基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子Jun 是JNK 信號(hào)通路的下游靶標(biāo)，其與87%胰腺腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[27]。RELA基因編碼的蛋白是經(jīng)典的核因子-κB 通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。相比于正常小鼠，RELA 敲除小鼠在胰腺癌前病變過(guò)程中出現(xiàn)了更多的 DNA 損傷，而這種損傷會(huì)促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[28]。FOS 基因編碼的蛋白c-Fos 是激活蛋白復(fù)合物的成員，它是其他癌基因的重要效應(yīng)物，參與細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞凋亡等過(guò)程的調(diào)節(jié)。致癌因子c-Fos 的異常表達(dá)會(huì)促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展，并與其預(yù)后相關(guān)[29]。AKT1 基因編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶?；罨腁kt 激酶可磷酸化多種蛋白底物，引起胰腺腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。Akt 激酶抑制劑與吉西他濱聯(lián)用可以顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[30]。HIF1A 基因編碼的缺氧誘導(dǎo)因子1α 是一種機(jī)體對(duì)低氧應(yīng)答的核蛋白，參與血管形成，能量代謝，細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程。胰腺導(dǎo)管腺癌基質(zhì)中缺乏血管與氧氣，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1α 的上調(diào)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞在低氧環(huán)境中存活。缺氧誘導(dǎo)因子1α 可通過(guò)抑制蛋白磷酸酶1 調(diào)節(jié)因子亞基1B 的表達(dá)以及p53 蛋白的降解來(lái)發(fā)揮腫瘤抑制作用。胰腺癌細(xì)胞中HIF1A 基因缺失將增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移活性[31]。

GO 與KEGG 富集分析顯示，白術(shù)、半夏和茯苓主要通過(guò)參與基因表達(dá)的調(diào)控，細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路，蛋白質(zhì)的磷酸化以及細(xì)胞凋亡等生物過(guò)程，從多方面影響胰腺癌的進(jìn)展。通過(guò)對(duì)作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，白術(shù)-半夏-茯苓通過(guò)影響KRAS 下游的PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、VEGF 信號(hào)通路以及p53 信號(hào)通路發(fā)揮治療胰腺癌作用。PI3K-Akt 信號(hào)通路是KRAS 下游的重要信號(hào)通路，能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡。研究表明，通過(guò)下調(diào) PI3K/Akt 信號(hào)通路可抑制胰腺癌細(xì)胞[32]。MAPK 信號(hào)通路在胰腺癌的多種信號(hào)傳遞過(guò)程中起關(guān)鍵作用，參與調(diào)控基因的表達(dá)、細(xì)胞的增殖與凋亡。MAPK 信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MARK）和c-Jun 氨基末端激酶（JNK）。其中，ERK 主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，而p38 MAPK 與JNK 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用[33]。ErbB 信號(hào)通路在多種類(lèi)型的實(shí)體瘤中表現(xiàn)出異常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌和直腸癌等。ErbB 信號(hào)通路不僅參與細(xì)胞增殖，還能調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的其他活動(dòng)，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、黏附、血管生成以及免疫抑制等。ErbB 信號(hào)通路的EGF 受體過(guò)表達(dá)或活性失調(diào)通常與癌癥的惡性程度和預(yù)后不良有關(guān)[34]。VEGF信號(hào)通路是通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vVEGF）與相應(yīng)受體結(jié)合來(lái)激活酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來(lái)發(fā)揮其血管生成功能。胰腺癌組織中，VEGF 信號(hào)通路異常激活，導(dǎo)致胰腺癌基質(zhì)血管的異常增生，這與腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有密切聯(lián)系[35]。p53 腫瘤抑制信號(hào)通路通過(guò)控制有絲分裂，脂肪酸的β 氧化、葡萄糖與氨基酸代謝等致癌信號(hào)來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。在胰腺癌中，p53 信號(hào)通路功能的缺失普遍存在。p53 基因的錯(cuò)義突變或截短突變導(dǎo)致信號(hào)通路的異常，以致于機(jī)體缺失促進(jìn)細(xì)胞凋亡、觸發(fā)DNA 損傷反應(yīng)以及維持細(xì)胞極性等反應(yīng)，促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展[36]。TGF-β 信號(hào)通路由多種功能性細(xì)胞因子，受體以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子構(gòu)成，能調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移以及凋亡等過(guò)程。它在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到雙重作用。在癌癥形成早期，TGF-β 信號(hào)通路通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞停滯與凋亡程序來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)；在癌癥發(fā)展中晚期，它對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用會(huì)降低，反而成為癌細(xì)胞生長(zhǎng)的助力[37]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的作用機(jī)制，采用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果顯示，茯苓酸A 與靶點(diǎn)AKT1，3β-羥基-24-亞甲基-8-羊毛甾烯-21-酸與靶點(diǎn)MAPK8，茯苓酸B 與靶點(diǎn)MAPK8有較好的結(jié)合活性。因此，白術(shù)-半夏-茯苓可能主要通過(guò)KRAS 下游的PI3K-Akt 信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路發(fā)揮胰腺癌的治療作用。

綜上所述，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白術(shù)-半夏-茯苓通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路對(duì)胰腺癌進(jìn)行調(diào)控，為闡述白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的作用機(jī)制提供了初步的理論依據(jù)，但后續(xù)仍然需要進(jìn)一步基礎(chǔ)與臨床實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證白術(shù)-半夏-茯苓配伍治療胰腺癌的作用機(jī)制與效果。