董雨龍，婁 成，陳熙昀，魏 煒，陶晨潔，韓 琴，袁振剛 （海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤科, 上海 201805）

肝細胞癌（HCC）是亞洲第五大常見癌癥，也是癌癥死亡的常見原因，其中中國占亞洲病例的62.4%[1]。HCC 晚期治療方法則有經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE)、廣譜絡(luò)氨酸酶抑制劑（TKI）、免疫療法和抗血管生成療法。上述治療策略延長了患者的生存期，但存在廣譜毒副作用，長期應(yīng)用分子靶向治療還會出現(xiàn)嚴重耐藥等問題[2]。中藥治療作為HCC 的另一種療法，在HCC 中有獨特的治療作用。其能緩解癌癥患者的臨床癥狀、改善生活質(zhì)量、提高免疫功能、預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、延緩腫瘤進展和延長生存期[3-5]。因此，探究中藥抗肝細胞癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制越來越受到關(guān)注。

通關(guān)藤又稱烏骨藤、通關(guān)散、通光藤等，在我國主要分布在云南和貴州兩省，其最初記載于明代的《滇南本草》，藥用歷史悠久。通關(guān)藤富含多種生物活性成分，如甾體苷、多糖、有機酸等，其中C21 甾體苷被認為是主要的抗腫瘤物質(zhì)。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤在肝細胞癌和其它腫瘤中有特異性治療作用[6]。在Huh7 和HepG2 細胞系中，通關(guān)藤皂苷H（TEH）通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR 信號通路誘導(dǎo)自噬和凋亡，從而增加腫瘤細胞的敏感性[7]。在肝細胞癌患者來源的腫瘤異種移植物模型中，通關(guān)藤提取物通過下調(diào)血管生成標志物的表達、阻斷血管生成因子的分泌，抑制腫瘤中血管網(wǎng)絡(luò)的形成，從而延緩HCC 的生長[8]。上述研究僅基于單個藥物-單個靶點-單個通路的思路進行研究設(shè)計，未充分考慮中藥成分的復(fù)雜性。中藥發(fā)揮藥效是一個多成分-多靶點-多通路的協(xié)同作用。因此，本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，尋找通關(guān)藤的多成分-多靶點-多通路的關(guān)系，構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，從多個角度探討通關(guān)藤治療肝細胞癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，結(jié)合生物信息學(xué)方法，挖掘肝細胞癌基因芯片數(shù)據(jù)，尋找通關(guān)藤治療HCC 的潛在靶點，然后通過分子對接技術(shù)驗證并展示通關(guān)藤活性成分與關(guān)鍵靶點間的相互作用，明確通關(guān)藤治療肝細胞癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，以期為通關(guān)藤在HCC 臨床應(yīng)用中提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 通關(guān)藤活性成分及靶點收集

檢索《中國期刊全文數(shù)據(jù)庫》（中國知網(wǎng)）和PubMed 數(shù)據(jù)庫，收集通關(guān)藤的成分。將獲得的化合物輸入到PubChem 數(shù)據(jù)庫中，獲得Smiles 結(jié)構(gòu)式；對于未在PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲得Smiles 結(jié)構(gòu)式的化合物，進一步采用ChemDraw 軟件獲得。通過Swiss ADME 獲得化合物的具體信息。依據(jù)“類藥五原則”篩選出有效活性成分。利用Swiss Target Prediction 預(yù)測化合物的作用靶點，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為標準的基因名稱。

1.2 肝細胞癌相關(guān)靶點收集

從GEO 數(shù) 據(jù) 庫 以“hepatocellular carcinoma”和“Homo sapiens”為關(guān)鍵詞，篩選得GSE147888 系列數(shù)據(jù)。該系列包括12 份腫瘤樣本和12 份鄰近非腫瘤肝臟組織，采用R 語言進行差異分析，收集兩組之間差異基因表達的微陣列信息。微陣列數(shù)據(jù)以調(diào)整后P＜0.05 和│log2（FC）│≥1 為標準篩選表達有明顯差異的基因。采用R 語言繪制差異基因熱圖和火山圖。

在Genecards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫中以“hepatocellular carcinoma”為關(guān)鍵詞，搜索與肝細胞癌相關(guān)疾病靶點，合并、去除重復(fù)靶點。

1.3 通關(guān)藤活性成分與HCC 靶標網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利 用Venny 2.1（ https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將活性成分靶點、GEO 數(shù)據(jù)庫篩選的靶基因和疾病數(shù)據(jù)庫篩選的靶點取交集，得到共同靶點基因，并繪制韋恩圖。將獲得的共同靶點基因?qū)朐诰€分析網(wǎng)站String，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置條件為中等置信度＞0.4。利用Cytoscape v3.8.0 軟件中的“Network analyze”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。將藥物活性成分與共同靶基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO/KEGG 分析

為了進一步探索通關(guān)藤活性成分對HCC 的潛在作用機制和共同靶基因的功能，使用R 語言中的Bioconductor 包和Cluster Profiler 包[9]對上一步獲得的靶基因進行GO 和KEGG 信號通路分析。使用GOplot 包對結(jié)果進行可視化。GO 分析包括生物學(xué)過程（BP）、細胞組成（CC）、分子功能（MF）三方面。

1.5 生物信息學(xué)分析

在GEPIA 數(shù)據(jù)庫生存分析模塊中分析HCC患者的總生存率與關(guān)鍵基因表達水平的相關(guān)性；使用人類蛋白質(zhì)圖譜（HPA）數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵基因的蛋白表達水平。

1.6 分子對接

對通關(guān)藤活性成分和潛在靶點進行分子對接驗證，探索它們之間的相互作用。首先從PubChem數(shù)據(jù)庫下載通關(guān)藤活性成分的2D 結(jié)構(gòu)（SDF 格式），利用OpenBabel 2.4.1 轉(zhuǎn)化為mol 格式。然后從PDB 數(shù)據(jù)庫下載受體蛋白的3D 結(jié)構(gòu)（PDB 格式）。PyMOL 軟件用于執(zhí)行蛋白質(zhì)的脫水和磷酸鹽去除等操作。最后，利用PyMOL 去掉受體蛋白配體，并用Auto Dock Tools 軟件對受體蛋白和配體分子進行去水、加氫、加電荷操作，保存為pdbqt格式，然后借助Auto Dock Vina 軟件進行分子對接。PyMOL 將對接結(jié)果進行可視化。結(jié)合能＜0表示配體和受體可以自發(fā)結(jié)合。選擇結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol 作為篩選依據(jù)，評價生物信息分析和預(yù)測的可靠性[10]。

2 結(jié)果

2.1 通關(guān)藤活性成分及靶點的篩選

通過文獻檢索[11-18]，共收集到50 種活性成分（表1）和588 個靶基因。其中通關(guān)藤苷元甲未查詢到靶基因。

表1 通關(guān)藤活性成分信息

2.2 HCC 靶點篩選

GSE147888 包括12 個正常人肝組織樣本和12 個肝細胞癌組織樣本，對樣本進行差異基因表達分析。結(jié)果顯示（見圖1），共有1 251 個差異基因，其中上調(diào)基因532 個，下調(diào)基因719 個。從Genecards和OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲得靶基因783 個。

圖1 肝細胞癌組織中基因表達差異分析

2.3 通關(guān)藤活性成分及HCC 靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分靶點、GEO 數(shù)據(jù)庫篩選的靶基因和疾病數(shù)據(jù)庫篩選的靶點取交集（見圖2A），得到共同靶點基因12 個，分別是ESR1、CYP1A1、PARP1、PTGS2、AR、JUN、MAP2K1、IL6、MMP1、MMP9、PPARG、PLA2G2A。將共同靶點基因與其對應(yīng)的活性成分構(gòu)建“成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”。如圖2B 所示，網(wǎng)絡(luò)圖含44 個節(jié)點、75 條邊，節(jié)點包含12 個靶點基因和32 個化合物。以度值對化合物進行排序，發(fā)現(xiàn)化合物野黃芩素四甲醚、通關(guān)苷元、芥子酸、苦繩苷元、山奈酚排名靠前。將交集基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖2C 和圖2D），發(fā)現(xiàn)基因度值排名靠前。提示這些化合物和基因可能是通關(guān)藤治療肝細胞癌的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點。

圖2 通關(guān)藤活性成分及HCC 靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 通關(guān)藤治療肝細胞癌作用靶點

圖4 生物信息學(xué)分析

圖5 通關(guān)藤活性成分與核心靶點分子對接結(jié)果

2.4 GO/KEGG 分析

為了進一步探索通關(guān)藤活性成分對肝細胞癌的潛在作用機制和共同靶基因的功能，對共同靶基因進行GO/KEGG 分析。GO 分析獲得條目BP 505個、CC 6 個、MF 59 個。圖3A 所示，生物過程主要涉及基因沉默調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、平滑肌細胞增殖，細胞組成涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物、蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物、細胞器外膜、外膜；分子功能涉及外膜、R-SMAD 結(jié)合、RNA 聚合酶II 特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。KEGG 分析得61 條通路（圖3B），其中排名前列與肝細胞癌相關(guān)通路有IL-17 信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、TNF 信號通路等。

2.5 生物信息學(xué)分析

為證明關(guān)鍵基因與HCC 之間的關(guān)系，通過GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫中分析了共同靶基因與HCC患者的生存曲線。在12 個靶基因中，ESR1、MMP1、MMP9、JUN、PPARG 高表達的HCC 患者的總生存期較差，與低表達患者相比，生存時間有明顯差異（圖4A）。ESR1 和MMP9 在肝細胞癌組織中mRNA 水平表達存在顯著差異（圖4B）。HPA 數(shù)據(jù)庫中免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示（圖4C），ESR1 和MMP9 在正常肝臟組織不表達，在肝癌組織中分別呈現(xiàn)中度表達和低表達狀態(tài)。未在數(shù)據(jù)庫中查詢到MMP1、JUN、PPARG 在正常肝臟組織和肝癌組織中的表達。

2.6 分子對接驗證

根據(jù)“2.3”項中結(jié)果，將度值排名靠前化合物野黃芩素四甲醚（Scutellarein-4-Methylether）、通關(guān)苷元（Tenasogenin）、芥子酸（Sinapic Acid）、苦繩苷元（Dresgenin）、山奈酚（Kaempferol）分別與基因IL6、PTGS2、JUN、ESR1、MMP9 進行分子對接。對接結(jié)果如圖5A 所示，除PTGS2 與野黃芩素四甲醚、芥子酸的結(jié)合自由能大于-5 kcal/mol，其余化合物與蛋白質(zhì)受體結(jié)合能均低于-5 kcal/mol，有良好的結(jié)合活性。部分分子對接可視化結(jié)果如圖5B所示。

3 討論

本研究通過查詢文獻收集通關(guān)藤藥物成分，依據(jù)“類藥五原則”篩選出50 個有效活性成分。由藥物成分-靶點圖可知，通關(guān)藤治療HCC 的關(guān)鍵成分有野黃芩素四甲醚、通關(guān)苷元、芥子酸、苦繩苷元、山奈酚等。芥子酸是一種小分子酚酸化合物，其與順鉑聯(lián)用可以抑制肝癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡[19]。山奈酚是一種多酚類中性化合物，具有較高的細胞毒性，在腫瘤治療中有廣闊的應(yīng)用前景。其可以抑制肝癌細胞活性[20]，改善索拉菲尼的化療療效[21]。目前關(guān)于野黃芩素四甲醚、通關(guān)苷元和苦繩苷元的研究分別在分離提取和心臟保護方面，尚無其在HCC 中抗腫瘤活性的相關(guān)報道，需進一步研究[18,22]。

采用Swiss Target Prediction 預(yù)測通關(guān)藤各成分的作用靶點；同時篩選Genecards、GEO 數(shù)據(jù)庫中HCC 疾病基因，與GSE147888 肝細胞癌芯片數(shù)據(jù)取交集，得出通關(guān)藤與HCC 共有靶基因12 個。如ESR1，是雌激素受體α（ERα）的編碼基因，能夠介導(dǎo)雌激素信號在HCC 進展中的作用。肝臟是性激素的靶器官，其細胞表達ERα 和雄激素受體，性激素特異性基因差異表達是肝癌發(fā)病的主要原因之一。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HCC 在女性中發(fā)病率明顯低于男性，多項研究證實雌激素信號在HCC 中具有保護作用[23-24]。ERα 可通過STAT3 信號通路、脂質(zhì)代謝相關(guān)通路和非編碼RNA 多種途徑抑制HCC 的進展[25]；而抑制ESR1 基因的表達可促進HCC 細胞的增殖、遷移和侵襲[26-27]。人肝癌組織中ERα 表達缺失或減弱，表明雌激素信號在HCC 中的保護作用。IL-6 是一種多功能炎性細胞因子，在肝癌患者中表達增加，與肝癌的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)[28]。肝癌中肝前體細胞通過分泌IL-6 促進自身增殖，進一步促進腫瘤的惡性進展[29]。IL-6 單克隆抗體阻斷IL-6 相關(guān)信號通路是治療HCC 的潛在藥物[30]。在急性肝損傷模型中，芥子酸可改善肝臟中IL-6、TNF-α、ROS 等炎癥指標，對肝臟組織病理學(xué)變化起到保護作用[31]。PTGS2是前列腺素G/H 合酶（又稱誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶2，COX-2）的編碼基因，在肝癌發(fā)生過程中能夠促進機體慢性炎癥的形成。COX-2 在肝癌患者中表達增高，且與患者總體生存率降低有關(guān)。COX-2 抑制劑可有效抑制肝癌發(fā)生和進展[32-33]。在LPS 誘導(dǎo)的斑馬魚炎癥反應(yīng)模型中，通關(guān)藤皂苷H 通過NFκB 和P38 通路調(diào)節(jié)COX-2、TNF-α、IL-8 等炎癥因子，發(fā)揮抗炎作用[34]。且本研究分子對接結(jié)果顯示，通關(guān)藤關(guān)鍵成分與ESR1、IL-6、PTGS2 均有較高的分子對接能，提示通關(guān)藤可能是通過交集靶基因發(fā)揮抗HCC 作用。

為研究通關(guān)藤治療HCC 的作用機制，對交集靶基因進行GO 和KEGG 分析。GO 分析發(fā)現(xiàn)，這些基因通過調(diào)節(jié)基因沉默、炎癥反應(yīng)、平滑肌細胞增殖等參與通關(guān)藤抗HCC 作用。KEGG 分析顯示通關(guān)藤治療HCC 可能與IL-17、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、TNF 通路相關(guān)。IL-17 是由CD4+輔助性T 細胞（Th17）分泌的炎癥細胞因子，可通過上調(diào)MMP2、MMP9、VEGF 的表達，促進HCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移[35-36]。在非酒精性脂肪肝?。∟ASH）向HCC 轉(zhuǎn)變模型中，成纖維細胞生長因子21（FGF21）通過抑制肝細胞中TLR4、IL-17A 信號通路，預(yù)防NASH 向HCC 的 轉(zhuǎn) 變[37]。 miR-383 可 能 通 過STAT3 通路靶向IL-17 發(fā)揮抗腫瘤作用，使得miR-383/IL-17 軸成為HCC 臨床診斷和治療的潛在靶點[38]。IL-17 還可通過調(diào)節(jié)膽固醇合成影響HCC 進展[39]；膽固醇的過度累積可對肝細胞產(chǎn)生脂毒性作用，導(dǎo)致肝細胞代償性增殖，釋放促瘤細胞因子IL-6、TNF-α，促進HCC 進展。LI 等[40]采用多組學(xué)聯(lián)合分析，在H22 小鼠肝癌模型中確定了通關(guān)藤活性成分通關(guān)藤苷G 可通過靶向HIF1α減少VEGF 蛋白合成，從而抑制肝臟腫瘤中血管生成。PAN 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在MHCC97H 和HepG2細胞及肝癌患者來源的腫瘤異種移植小鼠模型中，通關(guān)藤提取物均可下調(diào)血管生成相關(guān)標志物（VEGF、VEGFA、PDGFRB、VWF）的表達，提示其有效成分通過抑制血管生成阻斷供血，最終導(dǎo)致腫瘤組織壞死，抑制肝癌進展。另外，TNF 信號通路在HCC 發(fā)生發(fā)展中也有重要作用。術(shù)后接受索拉菲尼輔助用藥治療的HCC 患者，TNFα 高表達與不良預(yù)后相關(guān)[41]。高表達的lncRNA SPRY4-IT1 可通過TNF 信號通路促進HCC 進展和轉(zhuǎn)移[42]。在高脂飲食合并二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，敲除TNFR1，可抑制HCC 發(fā)生[43]。研究表明通關(guān)藤苷H 可通過調(diào)節(jié)TNFα 等炎癥細胞因子水平，發(fā)揮抗炎作用[34]。

通過GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫分析交集靶基因與HCC 患者生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)5 個基因ESR1、MMP1、MMP9、JUN、PPARG 的低表達與HCC 生存率升高有關(guān)，這與GSE147888 芯片分析中交集基因表達情況一致。Proteinatlas 數(shù)據(jù)庫免疫組化結(jié)果顯示：與正常肝臟組織相比，HCC 癌組織中ESR1、MMP9 基因表達上調(diào)，進一步證實了其與HCC 的相關(guān)性。MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶9），可通過調(diào)節(jié)生長板血管生成和干預(yù)內(nèi)皮干細胞募集在腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用[44]。MMP9 在HCC 的過度表達通過增加淋巴結(jié)侵襲和促進轉(zhuǎn)移導(dǎo)致更高的TNM 分期，也導(dǎo)致分化差和總體預(yù)后差[45]。LIU等[46]研究表明，通關(guān)藤的4 種C21 甾體糖苷可下調(diào)MMP9 的表達，削弱其降解細胞外間質(zhì)成分和Ⅳ型膠原蛋白，抑制A549 腫瘤細胞的遷移和侵襲。綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對通關(guān)藤治療HCC 的藥物成分、潛在靶點及作用機制進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤治療HCC 關(guān)鍵基因12 個，藥物成分50 種。其中關(guān)鍵靶基因IL6、PTGS2、JUN、ESR1、MMP9可能有重要作用，涉及基因沉默調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等過程，參與R-SMAD 結(jié)合、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能；可能通過IL-17 信號通路、TNF 信號通路等通路，抑制HCC 的進展。本研究體現(xiàn)了中草藥通關(guān)藤治療HCC 的多成分、多靶點、多通路的特點，為通關(guān)藤在HCC 的臨床應(yīng)用中提供科學(xué)依據(jù)。