楊笑菡

（北京大學基礎醫(yī)學院生物化學與生物物理學系，北京 100191）

真核細胞染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體，核小體由約147 bp的DNA纏繞在H2A、H2B、H3和H4各兩個拷貝的組蛋白八聚體上形成。在以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄、復制、重組和修復等諸多細胞生命活動中，核小體結(jié)構(gòu)始終處于動態(tài)解聚和再組裝過程。尤其在復制期，伴隨全基因組的復制，染色質(zhì)上所有的核小體也發(fā)生了解聚與再組裝，形成新的染色質(zhì)，保證了遺傳信息的準確傳遞，這個過程被稱為染色質(zhì)的從頭裝配［1］。表觀遺傳一直被認為在染色質(zhì)從頭裝配中發(fā)揮重要作用，但具體機制仍不清楚［2］。

由于組蛋白堿性強的特征，為了避免與帶負電荷的DNA非特異性結(jié)合，成為不溶的聚集體，新生組蛋白存在H4K5、K12、K91的乙?；阴；軌蛑泻徒M蛋白的正電荷，有利于核小體正確組裝。與乙?；煌?，新生組蛋白H3與H4的甲基化修飾程度很低，當其裝配為核小體后，新生組蛋白所特有的乙酰化修飾被快速去除，甲基化程度也迅速升高而成為成熟的染色質(zhì)。很多證據(jù)表明，組蛋白的表觀修飾在復制期存在動態(tài)改變，雖然新生組蛋白乙?；揎椗c核小體裝配的關系目前研究得較為清楚，但親代組蛋白表觀修飾如甲基化水平是否對染色質(zhì)裝配起調(diào)控作用還不清楚。

組蛋白H3K4去甲基化酶（lysine-specific demethylase 1， LSD1）是第一個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶，能夠催化組蛋白H3K4二甲基化、一甲基化（H3K4me2∕1）去甲基化［3］，它作為轉(zhuǎn)錄抑制復合物的成員在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用被廣為研究。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)了LSD1不同于其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的復制起始與復制時序調(diào)節(jié)功能［4］。進一步研究［5］表明，LSD1除了能夠促進復制起始，同時能夠促進復制偶聯(lián)的核小體組裝過程，親代組蛋白H3K4me2的修飾需要在一定程度上被去除，有助于解聚后的核小體高速、準確地重新裝配。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人骨肉瘤細胞系（U2OS細胞）培養(yǎng)與同步化 DMEM培養(yǎng)基（Gibco）含10%胎牛血清（Gibco）和青鏈霉素（Sigma），胸苷（thymidine）（Sigma），諾考達唑（nocodazole）（Sigma）。

1.1.2 siRNA訂購與轉(zhuǎn)染 對照siRNA與靶向LSD1 siRNA購買自GE Dharmacon，序列如下：

siLSD1

UGAAUUAGCUGAAACACAA

siCTR

UGGUUUACAUGUUUUCUGA

siRNA轉(zhuǎn)染試劑為RNAiMAX （Invitrogen）。

1.1.3 點突變試劑盒 （QuikChange mutagenesis，Stratagene公司），微球菌核酸酶（micrococcal nuclease， MNase）（Worthington）。

1.2 方法

1.2.1 U2OS細胞周期同步化 雙胸苷（double thymidine）雙阻滯：將1.5×105U2OS細胞系接種在六孔板中，轉(zhuǎn)染75 nM對照和LSD1 siRNA，6 h后更換為含有2 mM thymidine的培養(yǎng)基孵育14~17 h，第2天去除thymidine釋放細胞10~12 h，再次加入2 mM thymidine孵育14~17 h，去除thymidine釋放細胞，在釋放的0、3、6、9和16 h收集細胞進行流式細胞術或免疫熒光分析。Double thymidine雙阻滯法可以使約90%U2OS細胞同步化在G1∕S臨界點。

胸苷-諾考達唑（thymidine-nocodazole）阻滯：U2OS細胞轉(zhuǎn)染對照和LSD1 siRNA后，加入2 mM thymidine的DMEM培養(yǎng)14 h，第2天去除thymidine釋放細胞6 h，加入250 ng∕mL nocodazole培養(yǎng)細胞6 h，去除nocodazole后，在0、1、3、7和12 h收細胞進行流式細胞術分析。Thymidine-nocodazole阻滯法可以使約90%U2OS細胞同步化在G2∕M臨界點。

1.2.2 抵抗siRNA的點突變質(zhì)粒構(gòu)建 以野生型LSD1質(zhì)粒為模板，合成包含3個點突變的引物，點突變?yōu)長SD1 siRNA靶點區(qū)域，上游引物： G GAA TAT GAT GAA TTG GCA GAT ACA CAA GGA AAG CTA G；下游引物： C TAG CTT TCC TTG TGT ATC TGC CAA TTC ATC ATA TTC C。按照試劑盒說明進行PCR反應、DpnI去除模板DNA、轉(zhuǎn)化、挑克隆測序鑒定。

1.2.3 免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察 將U2OS細胞以25%的密度接種在提前放入蓋玻片的六孔板中，采用thymidine雙阻滯法同步化U2OS細胞至G1∕S臨界點。去除thymidine釋放細胞后，在不同時間點收集細胞，固定、打孔、一抗（LSD1、H3K4me2、H3K4me1）孵育4度過夜、熒光二抗孵育室溫1 h、封片、共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 流式細胞術分析 70%乙醇4 ℃過夜打孔、固定細胞，清洗細胞后加入500 μL 含RNA酶和DNA染料碘化丙錠的PBS 37 ℃孵育1 h，300目濾網(wǎng)過濾細胞入流式管分析DNA含量。

1.2.5 微球菌核酸酶（micrococcal nuclease， MNase）消化的染色質(zhì)空間可及性分析 U2OS細胞轉(zhuǎn)染對照和LSD1 siRNA，48 h后在細胞培養(yǎng)基中加入10 μM胸腺嘧啶核苷類似物EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）標記增殖期細胞新生DNA 10 min，收集細胞，用不同濃度（0.25 U、0.5 U、2 U和5 U）或相同濃度（5 U）不同時間（1、4、8和12 min）MNase處理等量的細胞核［6］，經(jīng)過酚∕氯仿抽提去蛋白、乙醇沉淀DNA等步驟，將純化后的DNA片段用含核酸染料溴化乙錠（ethidium bromide， EB）的2%瓊脂糖凝膠進行電泳。為了檢測新生DNA，將瓊脂糖凝膠中的DNA在20×SSC緩沖液中轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外交聯(lián)10 min，用Click反應給標記了EdU的新生DNA片段偶聯(lián)上生物素（biotin），與辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（HRP-Streptavidin）孵育進行免疫印跡分析。DNA條帶灰度定量分析采用Image J V1.50b軟件［7］。

1.2.6 免疫共沉淀實驗（co-immunoprecipitation，Co-IP） 將U2OS細胞同步化在G1∕S臨界點，釋放3 h收集細胞，用Co-IP裂解液裂解細胞，收集蛋白，預留1%裂解液作為陽性對照組（input），其余加入LSD1抗體過夜孵育，第2天分別加入二抗、Agarose蛋白A瓊脂糖凝珠，清洗珠子6遍，每次5 min，和Input一起加入2×上樣緩沖液，水浴鍋100 ℃煮樣10 min，Western blot檢測目標蛋白。

1.3 統(tǒng)計學方法

定量數(shù)據(jù)均錄入SPSS進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用Student′st檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LSD1敲低會引起復制期延遲

本研究的前期結(jié)果表明，LSD1通過去除H3K4me2激活基因組的早期復制起始點，正調(diào)控復制起始，促進復制的進行。為了觀察LSD1對細胞周期的影響，采用抑制復制的藥物Thymidine雙阻滯法將U2OS細胞同步化在G1∕S臨界點或采用thymidine與抑制有絲分裂的藥物nocodazole雙阻滯法將U2OS細胞同步化在G2∕M臨界點，去除藥物后在不同時間點收集細胞進行流式細胞術分析，結(jié)果表明LSD1敲低使得細胞復制期的進程減慢（圖1A），但不影響分裂期的進程（圖1B）。

圖1 LSD1敲低引起細胞復制期進程延遲

為了檢測LSD1 siRNA的特異性，采用點突變試劑盒引入三個siRNA靶點DNA的點突變構(gòu)建出能夠抵抗siRNA的LSD1質(zhì)粒（siRNA resistant LSD1，siR-LSD1）。在U2OS細胞中分別轉(zhuǎn)染對照siRNA、LSD1 siRNA或LSD1 siRNA加siR-LSD1，48 h后收集、裂解細胞，提取細胞總蛋白進行Western blot分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染LSD1 siRNA后細胞中的LSD1蛋白水平顯著降低，當同時轉(zhuǎn)染siR-LSD1質(zhì)粒后，過表達的外源LSD1能夠抵抗siRNA的降解，表達水平不受影響，證實實驗所用的siRNA能特異性地敲低細胞中LSD1蛋白水平（圖1C）。

2.2 LSD1、H3K4me2及H3K4me1的表達水平依賴于細胞周期

為了觀察細胞周期中LSD1活性的動態(tài)改變，采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察和分析LSD1、H3K4me2、H3K4me1在細胞周期不同節(jié)點的水平。結(jié)果顯示，LSD1的熒光信號強度在復制早期（0 h和3 h）最強，隨著細胞周期進展，熒光強度逐漸減弱，與之相應，代表LSD1活性的H3K4me2的熒光信號強度在復制早期（0 h和3 h）最弱，之后逐漸增強（圖2A）。同時，觀察到H3K4me1熒光強度在復制早期增高，隨著復制的進行熒光強度降低（圖2B）。Image J定量分析3次獨立免疫熒光實驗結(jié)果（圖2C）。結(jié)果表明，LSD1蛋白的表達及活性水平與細胞周期的變化密切相關，表達與活性的峰值出現(xiàn)在復制早期；同時，組蛋白H3K4me2在復制早期被去除，復制中后期快速重建。

圖2 LSD1活性峰值在復制早期

2.3 LSD1促進復制偶聯(lián)的染色質(zhì)∕核小體裝配

動態(tài)組蛋白修飾對復制偶聯(lián)的核小體解聚與再組裝過程有重要的調(diào)節(jié)作用［8-9］。為了解LSD1是否對復制偶聯(lián)的核小體裝配有作用，采用MNase消化實驗檢測細胞中總?cè)旧|(zhì)和新生染色質(zhì)的核小體裝配效率。MNase對裸露的DNA有切割作用，對組蛋白保護的核小體DNA則不能切割，因此該實驗可以評估新生核小體的形成情況即核小體的裝配效率，亦被稱作染色質(zhì)空間可及性分析。在U2OS細胞中敲低LSD1，加入胸腺嘧啶核苷類似物EdU（5-ethynyl-2′-deoxyuridine）標記新生DNA10 min，收集細胞，用不同條件的MNase處理等量細胞核，收集、純化被切割的染色質(zhì)DNA片段，上樣至2%含EB的瓊脂糖凝膠進行電泳。成像后將瓊脂糖凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，標記了EdU的DNA片段用Click反應偶聯(lián)上Biotin，與HRP-Streptavidin孵育，顯色曝光。結(jié)果表明，與對照相比，LSD1敲低之后，細胞中總?cè)旧|(zhì)被不同條件MNase消化后的染色質(zhì)片段在瓊脂糖凝膠電泳中條帶的帶型和亮度基本一致（圖3A，3B上），同時，Image J對DNA條帶灰度掃描定量分析結(jié)果顯示，實驗組與對照組的DNA片段的數(shù)量基本一致，表明LSD1敲低對總?cè)旧|(zhì)核小體裝配效率影響不大（圖3A，3B中）；但新生染色質(zhì)，即被EdU標記的染色質(zhì)，在不同條件的MNase處理后，LSD1敲低組與對照組相比，DNA片段變小，且代表單核小體的DNA片段與代表多核小體的DNA片段在總DNA中占比增多（圖3A，3B下，紅框內(nèi)），說明新生染色質(zhì)裸露的DNA程度較高，更容易被MNase降解，反映出新生DNA沒有及時形成核小體從而被組蛋白保護，核小體裝配效率降低。為了進一步驗證以上實驗結(jié)果，將3B實驗獨立重復7次，Image J定量檢測總?cè)旧|(zhì)和新生染色質(zhì)中代表單核小體的DNA片段。結(jié)果表明，與對照相比，LSD1敲低后，總?cè)旧|(zhì)被MNase切割后生成的單核小體DNA的量基本一致，但新生染色質(zhì)被切割后單核小體DNA增多1.9倍，統(tǒng)計學顯示差異具有顯著性（圖3C、3D，P<0.05），表明LSD1敲低后新生DNA的核小體裝配效率降低。

圖3 LSD1促進復制偶聯(lián)的染色質(zhì)從頭裝配

LSD1與復制起始復合物的多種蛋白因子有相互作用，為了了解LSD1是否與復制偶聯(lián)的核小體裝配復合物CAF-1有相互作用。收集同步化于復制期的U2OS細胞，免疫共沉淀實驗檢測LSD1與CAF-1蛋白復合體亞基p150，p60和p48的相互作用。研究結(jié)果顯示，細胞內(nèi)LSD1與CAF-1復合物的亞基存在相互作用。

3 討論

本實驗室前期研究［10］已經(jīng)證實組蛋白甲基化修飾的動態(tài)變化對復制起始點活化的時序和效率有調(diào)控作用，流式細胞術分析結(jié)果表明，H3K4me2∕1去甲基化酶LSD1對細胞復制有正向促進作用，與前期結(jié)論一致：LSD1在復制中發(fā)揮重要作用。

免疫熒光分析結(jié)果表明，LSD1的蛋白水平在復制早期（0 h和3 h）最高，復制中后期到G1期蛋白水平逐漸減弱，與之相應，代表LSD1活性的H3K4me2的水平在復制早期（0 h和3 h）最弱，之后逐漸增強，與H3K4me2在復制早期全基因組水平降低的前期結(jié)論一致。有趣的是，我們觀察到H3K4me1水平在復制早期增高，之后水平逐步降低。H3K4甲基化的規(guī)律是1甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)?甲基化，2甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)?甲基化，去甲基化反之。由于LSD1也能夠去除H3K4me1，推測H3K4me1的升高的原因，一個可能是LSD1更傾向于去除H3K4me2，另一個可能是H3K4me3在復制早期也被去甲基化酶去除［11］，導致H3K4me2大量堆積。LSD1催化大量的H3K4me2去甲基化，引起H3K4me1升高；而隨后H3K4me1的降低可能是H3K4me1被甲基化恢復為H3K4me2所引起。研究結(jié)果表明LSD1蛋白的表達與活性水平及細胞周期的變化密切相關，表達與活性的峰值出現(xiàn)在復制早期；同時，組蛋白H3K4me2在復制早期被去除，復制中后期快速重建，H3K4me2與H3K4me1修飾水平此消彼長的實驗證據(jù)，支持了組蛋白修飾在生命活動中處于動態(tài)改變的事實。

已有的研究［8］表明，新生組蛋白動態(tài)修飾與復制偶聯(lián)的核小體裝配密切相關。作為DNA的載體，核小體本身組裝∕去組裝的結(jié)構(gòu)動態(tài)變化對基因轉(zhuǎn)錄、DNA復制等生理過程非常重要，亦是表觀遺傳穩(wěn)定傳遞的分子基礎。由于新生組蛋白上的高乙?；c低甲基化有利于復制核小體的裝配［12］，推測成熟后的親代組蛋白上的高甲基化修飾的是否不利于復制偶聯(lián)的核小體裝配［13］，本研究關注復制早期親代組蛋白H3K4甲基化在全基因組水平的去除是否也與復制期染色質(zhì)的重頭裝配有關。提出假說：復制起始前H3K4me2在全基因組水平降低除了能夠促進復制起始點活化，同時能夠促進復制偶聯(lián)的核小體組裝過程。

采用MNase消化實驗，研究結(jié)果顯示，與對照相比，LSD1敲低后，新生染色質(zhì)的核小體裝配效率降低，支持了我們的推測：H3K4me2水平需要被在一定程度上去除，從而有利于復制偶聯(lián)的核小體高效裝配，LSD1是H3K4me2去甲基化的重要因子，也是調(diào)節(jié)復制的重要因子。免疫共沉淀實驗證實染色質(zhì)裝配因子（Chromatin assembly factor， CAF-1）與LSD1有相互作用，支持LSD1在染色質(zhì)裝配中發(fā)揮作用。由于組蛋白修飾的表觀遺傳也能相對準確地傳遞給子代細胞，由此會提出一個問題：復制早期親代組蛋白甲基化修飾的去除如何使表觀遺傳傳遞下去？有研究者提出過“緩沖液系統(tǒng)”理論來解釋復制期或應對內(nèi)外環(huán)境刺激時染色質(zhì)表觀修飾改變，而在復制期結(jié)束或內(nèi)外環(huán)境刺激因素消失后染色質(zhì)表觀修飾再恢復的生理過程［14］。“緩沖液區(qū)”是指生物體內(nèi)對于組蛋白修飾等表觀遺傳信息的改變在一定范圍內(nèi)波動可以合理容忍，就像緩沖液一樣，可以在一定范圍維持自身的穩(wěn)定。我們的合理解釋是：表觀遺傳傳遞亦遵循著相似的機制，H3K4me2在全基因組水平的降低只是至一定程度，降低到該水平既有利于復制偶聯(lián)的核小體裝配，同時像“種子”有利于表觀遺傳在子代染色質(zhì)上或迅速或逐漸重建［15］。

LSD1長期以來被認為與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，通過去除與轉(zhuǎn)錄激活相關H3K4me2修飾，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。本實驗室前期研究表明LSD1在常染色質(zhì)復制起點的激活和調(diào)控復制時序中具有重要作用。鑒于LSD1在多種不同類型的癌癥中高表達［16-18］，LSD1的選擇性抑制劑已被開發(fā)用于癌癥的治療［19］，由于LSD1參與多種生物學進程，因此幫助LSD1水平恢復正常是未來應用該抑制劑的方向［20］。本研究不僅揭示了LSD1之前未被闡明的生物學功能，同時拓寬了對表觀遺傳生物學功能的認知。